本研究では、80~100 C.エレガンス胚の3Dタイムラプスイメージングを1回の夜間実行で可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。さらに、データ分析を合理化するために、画像処理ツールと視覚化ツールが含まれています。カスタムレポーター株とこれらの方法の組み合わせは、胚発生の詳細なモニタリングを可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
C.エレガンスは、胚発生時の細胞運命仕様と形態形成過程の系統的解析のための最高のシステムです。1つの課題は、胚発生が約13時間にわたって動的に展開することです。この半日のタイムスケールは、画像化できる胚の数を制限することによって実験の範囲を制限している。ここでは、1回の夜間実行で、中程度の時間分解能で80~100個の胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。プロトコルは簡単で、ポイント訪問容量の顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室によって実装することができる。このプロトコルの有用性は、生殖層の仕様および形態形成の主要な側面を視覚化するために最適化された蛍光マーカーを発現する2つのカスタム構築された株を画像化することによって実証される。データを分析するために、すべてのチャネル、Z ステップ、およびタイムポイントで、より広い視野から個々の胚をトリミングし、各胚のシーケンスを別々の tiff スタックに保存するカスタム プログラムが作成されました。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を含むプログラムは、可視化または自動分析の準備のために個々の胚を分離、前処理、均一に指向することにより、データ処理を合理化します。また、個々の胚データをマルチパネルファイルにコンパイルし、各時点で各胚の最大強度蛍光投影と明視野画像を表示するImageJマクロも提供されています。本明細書に記載されているプロトコルおよびツールは、40の前に説明した発達遺伝子のノックダウン後に胚発生を特徴付けるためにそれらを使用することによって検証された;この分析は、以前にアノトされた発達表現型を可視化し、新しいものを明らかにした。要約すると、この研究では、クロッピングプログラムとImageJ可視化ツールを組み合わせた半ハイスループットイメージング法の詳細を説明し、有益な蛍光マーカーを発現する株と組み合わせることで、実験を大幅に加速して分析します。胚。
概要
C.エレガンス胚は、機械学的細胞生物学のための重要なモデルシステムであり、胚発生を駆動する細胞運命の仕様と形態形成過程の解析1、2、3、4 ,5,6,7,8,9.現在までに、胚における細胞レベルの事象と細胞運命仕様の両方の特徴付けの多くは、比較的高い時間分解能を1回に1回のイメージング実験(すなわち、10~100s毎に取得)を用いて達成されてきた。蛍光マーカー。数秒から数十分の順序でのイベントには適していますが、このアプローチは、時間単位から数日の順序で、より長いプロセスの特性評価を技術的に制限するようになります。最初の切断から伸びの終わりまでの胚の発達は約10時間かかります。この時間スケールでは、胚のより大きなコホートの同時に低い時間分解能イメージング(すなわち、5〜20分の時間間隔での取得)を可能にするセミハイスループット法は、異なる条件から、新しい範囲の実験を開くだろう。例えば、体系的な大規模スクリーニングの努力を可能にし、分子摂動の結果を比較するための十分な数の胚の分析を可能にする。
ここでは、C.エレガンス胚発生をモニタリングするセミハイスループット法について、最大14の異なる条件から、1回の夜間走行で、80~100個の胚における同時3Dタイムラプスイメージングを可能にする方法について説明する。プロトコルは実装が簡単で、ポイント訪問機能を備えた顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室で行うことができます。このプロトコルの主な手順を図 1に示します。要するに、胚は、関心のある蛍光マーカーを発現する重症成人から解剖され、若い胚(2〜8細胞段階)をイメージング用の384ウェルプレートのウェルに移す。この形式では、比較的小さいウェルサイズのじょうごは、狭い領域に胚を漏斗し、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にする。胚のコホート全体でほぼ同期的な発達を維持するために、解剖は冷蔵された媒体で行われ、プレートは氷の上に保持され、1時間の解剖時間枠の間に大きな発達を防ぐ。プレートを顕微鏡に移し、胚を一晩温度調節された部屋で撮影し、20分間隔で、60xオイル浸漬1.35 NAレンズを使用して、2μmステップで全Z範囲を収集する。1~5個の胚を含む50個のフィールドが、1回の夜間走行で画像化されます。目的の実験に応じて、画像化されたフィールドの数を比例的に減らすことで、時間分解能を増やすことができます(たとえば、5~10分間隔でのイメージング)。
このプロトコルを使用すると、1 回の夜間実行でも大量のデータ (50 フィールドに広がる 80 ~ 100 個の胚) が生成され、より大きな実験では、データ分析に関してすぐに管理不能になる可能性があります。このデータの処理、可視化、分析の合理化を容易にするために、胚をトリミングして指向し、前処理手順 (オプション) を実行するプログラムと、データをコンパイルして表示を簡略化する ImageJ マクロを作成しました。これらのプログラムは、イメージング方法に依存せず、単一の明視野面のみを必要とするため、従来のアプローチを使用して収集された画像を処理するために使用できます。最初のプログラムは、複数の胚(GUIオプションまたはソースコードembryoCrop.py)または複数の胚(screenCrop.py)を含む複数の4Dフィールドを含む4Dフィールドを取り込み、胚をしっかりとトリミングし、後部構成で向けます。これらのプログラムは、バックグラウンド減算、ドリフト補正、および減衰補正を実行するオプションもユーザーに提供します。結果として得られるファイルは、自動画像解析に修正可能な各胚に対して、均一に処理され、しっかりとトリミングされた tiff スタックです。各条件のすべての胚を簡単に表示できるように、ImageJ マクロ (OpenandCombine_embsV2.ijm) が書かれ、特定の条件からすべての胚を単一の tiff スタックにアセンブルし、明るいフィールドイメージと最大強度投影色 (RGB) オーバーレイは、各胚に対して並べて表示されます。この方法は、生殖層の主要な側面を可視化するために最適化された蛍光マーカーを発現する一対のカスタム構築された株で、40個の前に記述された発達遺伝子をノックダウンした後の胚発生を特徴付けるためにそれらを使用して検証された。仕様および形態形成10、11。セミハイスループット胚イメージングプロトコルと画像処理ツールを組み合わせることで、より高いサンプル数の実験と、開発プロセスの理解を目的とした大規模なスクリーニング作業が可能になります。さらに、これらの株はまた、胚発生に対する分子摂動の影響を調べるための効率的な手段を提供する。
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プロトコル
1. セミハイスループットイメージングのためのC.エレガンス胚の準備
注:プロトコルのこの部分の目的は、半同期(2〜8細胞段階)C.エレガンス胚の集団を、適切なマーカー株から解剖し、イメージング用のガラス底384ウェルプレートにロードすることです。他のプレートフォーマットも機能する可能性がありますが、384ウェルプレートは、小さなウェルサイズが比較的小さな領域への胚の広がりを制約するため、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にするため、好ましい。胚を大まかに同期させることで、現場の胚ごとに開発の完全な過程が確実に捕捉されます。
- 氷冷M9培地に溶解したテトラミソール塩酸塩(TMHC)麻酔薬の0.1mg/mL溶液を5~10mL調製し、氷冷M9培地(0.45M Na2HPO4∙7H2O、0.11 M KH2PO4、0.04M NaCl、0.09 MNH4Cl)を使用する解剖およびイメージング。この媒体は、孵化した幼虫を動かすことが初期の発達段階で胚のイメージングを妨げないことを保証する麻酔薬を含む。
注:トリミングおよび可視化ツールを使用して、標準のアガロースパッドの取り付け方法を使用して取得したデータを分析する場合は、以下のセクション 3 に進んでください。 - アリクォート70°Lの調製溶液をガラス底384ウェルプレートの個々のウェルに、各条件に1つのウェルを備えています。エッジ効果を防ぐために、プレートの外側の 2 行を避けてください。
注:接着PCRプレート箔(図1Dの例を参照)を使用して周囲の井戸をマスクすると、将来の実験のために隣接する井戸を保存し、解剖顕微鏡下で適切なウェルを見つけやすくするのに役立ちます。溶液が引用されたら、解剖全体を通して氷の上にプレートと残りの溶液を保ちます。 - うつ病のスライド(重力ヘルマフロダイトが解剖される場所)から井戸に胚を移すための口のピペットを生成します。炎の上にキャピラリーピペット(25°Lの校正ピペット)を引っ張り、細かいテーパーエンドを生成します(図1D)。クロスコンタミネーションを防ぐために、条件ごとに1つのピペットが必要です。使用後にピペットを廃棄します。
- 細かいピンセットを使用して、解剖範囲の下で〜10の重力成人を、各状態のうつ病スライドに引用した氷冷TMHC溶液の150°Lに移します。ピンセットとメスを使用して、胚を放出するためにワームを解剖します。
- ピペットに含まれる吸引器付属品に引っ張られた毛細管ピペットをロードし、口のピペットを2〜8細胞の胚の全てを調製したプレートの個々のウェルに移す(図1D)。後期胚や解剖破片の移送は避けてください。解剖スコープの下で調べ、胚の凝集体が存在する場合は、口が上下にピペットするか、ピペットチップで胚の塊をタップして分散させます。
注:クロスコンタミネーションを防ぐために、きれいな解剖装置を使用し、条件間を移動しながら新鮮な口のピペットを使用します。プレートをディスセクションの間の氷の上に保管します。 - すべての条件からのワームが解剖され、胚が適切な井戸に置かれたら、384ウェルプレートを600 x gで1分間回転させ、胚を沈着させます。
- プレートの底部をエタノール浸漬ワイプで拭き取り、残留物を取り除き、温度管理された環境でプレートホルダーを装備した共焦点顕微鏡にプレートを置きます。
注:次の手順では、ラボセットアップを使用してこの方法について詳しく説明します。実験ニーズや機器に合わせて取得条件を変更してください。ここでは、マイクロレンズ強化デュアルニプコウスピニングディスクを搭載した共焦点スキャナーボックス、512 x 512 EM-CCDカメラ、高精度オートXYステージ(指定解像度0.1μm)と電動Z軸制御(指定解像度0.1μm)を使用しています。このシステムは16°Cの部屋に保たれ、一晩のイメージ投射の間に21と23 °Cの間の顕微鏡温度を維持する。 - 適切な胚を持つフィールドを識別するには、10x 0.4 NAの目的と適切なイメージングソフトウェアを使用して、各ウェルの事前スキャンを実行します。最も最適なフィールドは、他の胚と同じ焦点面にある複数の初期胚を含み、理想的には隣接する胚間の接触を最小限に抑えます。適切な領域の位置をマークします。
- 撮像場を選択するには、60倍の目的に切り替え、各点訪問時に焦点面を調整して胚を適切に断面化します。ウェルごとに 1 ~ 4 個のフィールドがイメージされ、14 のウェル全体で合計 50 個のフィールドがイメージされ、各フィールドには 1 ~ 5 個の胚を含めることができます。全体として、4〜15個の胚が高解像度イメージングの各条件から選択される。
注:このステップで重要な変数は、十分なオイルの使用です。目的に油を置き、各井戸のポイントを訪問し、すべての井戸の表面の周りに油を広げ、フィールドの選択の前に目的に油の追加の滴を適用します。 - 60x 1.35 NA目標を使用して選択したフィールドをイメージし、20 分ごとに 18 z セクションを 10 時間取得します。生殖層および形態形成レポーター株を用いたイメージング条件は以下の通りである:明視野、90%の力、25 ms、20%の利益;488 nm、100%の電力、200ミリ秒、60%の利益;568 nm、45%の電力、150ミリ秒、60%の利益。
- イメージングが完了したら、夜間イメージングの開始後に低倍率(10x 0.4 NA目標)全体の明るいフィールドスキャン〜20〜24時間を行うことによって胚致死率を評価します。
2. 胚致死性スコアリング
- ポストラン10倍のスキャンフィールドを使用して、各井戸の孵化したワームと未孵化胚を数えることによって、胚の致死率と幼虫の欠陥を評価します。
- 胚致死として未孵化した胚をスコア付けします。若い解剖された胚が時々卵殻形成を完了できず(メイオシスIIがまだ完了していない場合)、透水性欠陥が最初の2つの間に浸透性合併症を引き起こす可能性があるため、致死率カウントから1〜4段階の胚を逮捕除外する部門。
- 部分的に孵化したワームや、ダンプリーや麻痺などの行動上の欠陥を「異常な幼虫」として採点する。
3. 自動トリミング (図 3A)
注:ソフトウェアは2つの場所に収容されています:(1)ゼノドは、任意のプログラミングの専門知識を必要としないソフトウェア12のユーザーフレンドリーなバージョンを収容しています。(2) Githubには、Python の習熟度を必要とするembryoCropUI.pyおよびscreenCrop.pyソフトウェア13のソース コードが含まれています。プログラムの両方のバージョンをダウンロードして操作するための詳細な手順は、以下で見つけることができます。
- 胚クロップUI実行可能バージョンを使用した自動トリミング(ユーザーフレンドリーなバージョン)
- embryoCropUIプログラムを使用するには、まずゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12からプログラムをダウンロードします。
- プログラムの MacOS または Windows 形式のバージョンをダウンロードします (MacOS バージョンには MacOS X10.11 以降が必要です)。
- 命令ファイル (GUI_命令_ゼノド_レポV2.docx) をダウンロードします。
- test_files.zip をダウンロードして、プログラムがプラットフォーム上で正しく機能しているかどうかをテストします (手順を参照)。
- ダウンロードが完了したら、解凍して胚作物の実行可能ファイル (...\胚作物 UI\\\WINDOWS\胚作物UI\胚作物UI.exe)または (...\胚クロップUI\_MacOS\胚クロップUI\胚クロップUI.exe)を見つけます。ダブルクリックして起動 (または 「で開く」ターミナルを選択)し、embryoCropUI 実行可能ファイルを実行します。
- GUI 実行可能ファイルは、一度に 1 つの 4D 視野をトリミングします。左上隅にある開くボタンを選択して、トリミングする特定のフィールドを読み込みます(マルチティフ)。複数の寸法(z、時間、チャネル)で tiff シリーズをトリミングする場合は、フォルダ内のシリーズの最初のイメージのみをロードします(フォルダごとに 1 つの tiff シリーズ)。
- イメージが読み込まれたら、z-スライスの数、(Z)、タイムポイント数(T)、チャンネル数(C)、DICまたはブライトフィールドに対応するチャンネル(1番目=1、2番目=2など)などの情報を指定します。
- イメージに対して実行する追加の処理を選択します。プログラムは、ドリフト補正、背景減算、および減衰補正を提供しています。
- GUI プロンプトで処理作業をガイドするために、バックグラウンド減算および減衰補正のパラメータを指定します。[バックグラウンド減算] で、意味のある信号のサイズを反映する最大フィーチャ サイズを定義します。この機能のサイズは背景と見なせず、奇数の値である必要があります。減衰補正に 0 ~ 1 の値を入力します。減衰補正値は、イメージされるオブジェクトの最も遠い深さに残る元の強度のパーセンテージを反映します。
注:バックグラウンド減算と減衰補正は一緒に実行する必要があります。 - イメージの収集順序 (チャネル z 時間 (czt)、または z チャネル時間 (zct)) を指定します。
- 使用するカメラに基づいて、イメージのピクセルあたりのミクロンを指定します。
注:ピクセル サイズが適切に定義されていない場合、イメージのトリミングが不適切になります。 - 左下隅にある [実行]を選択します。"トリミング" というラベルの付いた新しいサブフォルダが、トリミングされていないフォルダと同じパスに作成されます。トリミングされたバージョンはこの場所に保存されます。ファイルサイズに応じて、トリミングは数秒から数分以内に完了する必要があります。
- embryoCropUIプログラムを使用するには、まずゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)12からプログラムをダウンロードします。
- screenCrop.pyを使用した自動トリミング (上記の胚クロップGUIに代わるバッチバージョン。Python に精通したユーザーのみ)10,13
- screenCrop.py使用するには、より大きなデータセットをバッチ形式でトリミングするための Python ソフトウェアバージョンを Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git)から複製またはダウンロードします。
- 適切な仮想環境を構成するための指示を読み、説明されているファイル命名システムに従ってください。どちらも Github リポジトリのREADMEファイルで詳しく説明されています: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md。
- 環境変数と命名規則が適切に確立されたら、parameters.pyを開き、任意のエディターでscreenCrop.pyします。
- ソース コードに触れずに調整可能なパラメータを変更するには、parameters.pyファイルを編集します。
注: screenCrop.pyのヘッダー内でパラメータを直接変更することもできます。- parameters.py構成ファイルを使用する場合は、use_configure設定を True に変更します。screenCrop.py内で直接編集を使用する場合は、use_configure設定を False のままにします。
- parameters.py ファイル内で次の情報を見つけて、必要なイメージング パラメータとファイル構造に合わせて変更を加えます。
- loadFolder (9 行目): ファイルが格納されているドライブに変更します (Z:/、D://など)
- 日付 (7 行目): イメージング セッション用のファイルを含むフォルダに移動します。これは、CSV トラッキング ファイルでは「実験フォルダー名」と呼ばれます (手順を参照)。
- trackingFile (11 行目): 実験情報が格納されている CSV ファイルへのパスに変更します。
- z (ライン 13): z 平面の数として設定します。
- nT (行 14): タイムポイントの数として設定します。
- nWells(19行目):使用する井戸の数として設定します。
- ポイントビジット(ライン 20):ポイント訪問の最大数(ウェルあたり)として設定します。
- 10 行目で、'CV1000/' が現在占有している場所を見つけ、ファイル パスで使用されている外側のフォルダを入力します。問題を回避するには、次の規則 'XXXXXXX/' を使用します。
- 12 行目で、トリミングされたデータの縦横比データを格納するための有効なファイル パスを入力します。
- 15 行目、16 行目、17 行目、および 18 行目で、イメージが次の処理を通過するかどうかをTrue/Falseと入力します。
- 15 行目のドリフト補正の場合は、True または False を入力します。
- 16 行目の背景減算の場合は、True または False を入力します。特徴のサイズは、異なるマーカー株とピクセルサイズに対して経験的に決定する必要があります。ここでの構成では、特徴のサイズは、生殖層株の場合は41、形態形成株では201と定義した。背景の減算は、減衰補正と組み合わせて行う必要があります。
- 17 行目の減衰補正の場合は、True または False を入力します。
- 18 行目の前後回転の場合は、True または False を入力します。
- すべての変更が行われると、トリミングを開始できます。これを行うには、screenCrop.pyに切り替えてツールバーの再生アイコンを選択し、ドロップダウン メニューで [実行] > [Python 実行]を選択します。
- 大規模なデータセット (50 ポイントが 18 z ステップ、3 チャネル、31 タイムポイントを訪問) の場合、トリミングが完了するまでに数時間かかる場合があります。トリミングが完了すると、保存する前にトリミングされた画像のプレビューが小さなウィンドウに表示されます。イメージごとに 3 つのオプションがあります。
- 保存:画像が切り取られて目的の領域が切り取られずに画像が正しくトリミングされている場合は、スペースバーを押して画像を保存します。
- X:画像に関心のある領域が切り取られたように見える場合は、Xキーを押します。イメージは、他のイメージと区別するために、名前の前に X と共に保存されます。
-
削除: Dキーを押して、画像が正しくトリミングされていない場合、または胚が満足できない場合は、トリミングした画像を削除します。
注 : イメージは、ロード フォルダ (プログラムの 9 行目で定義) の "トリミング" という名前のサブフォルダに保存されます。
4. 視覚化 (図 4)
注:OpenandCombine_embsV2.ijm10、12は、特定の歪みと条件のすべての画像からtiffファイルを表示しやすいを構築するImageJマクロです。FIJI/ImageJ14、15のインストールが必要です。このマクロは、ファイル構造に従って実行されます。他のファイル構造で動作するように変更する必要があります。適切なファイル構造と重要な考慮事項の詳細な説明については、Zenodo リポジトリのGUI_Instructions_zenodo_repoV2.docxファイルの末尾にあります。このマクロと最適なインターフェイスにファイルに正しい名前と構造を付けるためにイメージングする前に、これらの手順を完全に読んでください。参考までに、ファイルの場所の構造は次のようになります。
Z:\トリミングされた\ターゲット\ひずみ\Emb#\ターゲット_Emb#_15 桁一意識別子 _W##F#_T##_Z##_C#.tif
次のように、Z:\トリミングされた\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
- ゼノド(https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)からOpenandCombine_embsV2およびGUI_命令_ゼノド_レポV2.docxをダウンロードしてください。
- 次の情報を準備します。
- イメージ フォルダが保存されている場所(トリミング後)。
-処理する特定の条件のイメージ フォルダ名 (EMBD0002 など)。これは、上記の例では「ターゲット」と呼ばれています。
-特定の夜間実験に固有の 15 桁の英数字一意識別子 - この識別子は、データ取得フォルダー名 (20140402T140154) であり、一意の識別子が個々の tiff ファイル名 (EMBD0002_Emb1_20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) その日に画像化されたすべての胚について。このマクロは、この識別子を使用して、同じ日付に取得された胚をチェックし、別々の日付で繰り返し条件を別々の ImageJ ファイルにまとめることができます。 - ImageJ を開き、マクロ ファイルOpenandCombine_embsV2.ijmを ImageJ バーにドラッグ アンド ドロップするか、マクロを直接開きます。
-
マクロを開いたら、3 行目と 4 行目を見つけます。次の手順に従って、(セクション4.2)で収集した情報を入力します。
- 3 行目 (RNAL) に、処理するイメージのターゲット名を入力します。次の構造体に各ターゲットを入力します。見積を含めます。一度に複数の条件を実行するには、コンマで区切り、すべてのターゲット名をかっこ内に収めます (つまり、newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/")。
- 4 行目 (日付) に、15 桁の英数字の一意の識別子を引用符で入力します(例: newArray("20140402T140154)。
- マクロ ウィンドウの左下にある[実行]をクリックします。ウィンドウが表示され、トリミングされたイメージ フォルダ (4.4.1 で指定) を含む外側のフォルダに移動するように求めるプロンプトが表示されます。
-
選択すると、別のウィンドウが表示され、イメージングパラメータを指定できるようになります。
- チャンネル数、Z スライスの数、コンパイル済み画像のラベル付けに使用されるテキストのフォントサイズ、および各チャンネルの色を入力します。
- すべてのチャンネルで自動コントラストのオン/オフをオン/オフします。
- すべてのパラメータを指定したら、ウィンドウの下部にある[OK]をクリックします。 複合ファイルのアセンブルが開始されます。この操作が完了するまでに数分かかります。
- 完了したら、必要に応じて開いたままのファイルを確認します。マクロは、次の方法で名前が付けられた新しく作成されたフォルダにファイルを保存しているので、保存せずに閉じることができます: 外部フォルダ名 (セクション 4.5 のプロンプトで指定) + "-fiji-processed-output" (つまり、Z:\トリミングされたフィジー処理出力\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif)。
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結果
C.エレガンス胚発生に対する分子摂動の影響を特徴付ける上で重要な課題は、胚が最初の切断から20°16で伸びの終わりまで進行するのに約10時間かかることです。胚の大きなコホートを同時に画像化できるセミハイスループット法は、各条件に対して十分なアンサンブルサイズと並行して複数の条件をイメージングできるため、このタイムスケールのイベントに役立ちます。定量分析 (図 1A)
セミハイスループットイメージング法とマルチマーカー株
ここで説明するセミハイスループットイメージング方法(図1Bで概説)は、384ウェルガラス底板を採用しています。マルチウェル形式では、最大14の条件を並列に配列することができ、井戸の小さなサイズは、高解像度イメージングのための胚を含むフィールドの識別を簡素化し、検索領域を制約しま...
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ディスカッション
この研究では、C.エレガンスにおける胚発生における遺伝子の機能をプロファイリングするために、より大規模な取り組みを可能にするために開発された一連のツールと方法について説明します。当社のセミハイスループット法により、1回の実験で80~100個の胚に対して20分分解能で胚発生の3Dタイムラプスイメージングが可能です。このプロトコルは任意の所望のマーカー株で使用するために適応することができますが、この研究は、胚発生中のイベントを監視するために開発された2つのカスタム株を使用する方法の可能性を示しています:(1)生殖層レポーター株、組織特異的プロモーターは、内胚葉、中胚葉および外胚葉核をマークするために蛍光ヒストンの発現を駆動し、(2)細胞接合部の蛍光マーカーの発現を駆動するために表皮および神経プロモーターを使用する形態形成レポーター株、プラズマ膜。2つの株をイメージングすることにより、細胞運命の仕様および形態形成事象に対する分子摂動の結果を顕著な詳細に捕捉することができる。この方法で生成されるデータの量によって提示される課題に対処するために、データ処理と視覚化を合理化するためにカスタムツールが開発されました。最初のツールは、...
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謝辞
S.D.O.は、カリフォルニア州サンディエゴ大学サンディエゴ機関研究・学術キャリア開発賞(NIH/IRACDA K12 GM068524)の支援を受けています。A.D.とK.O.は、この研究を支援するために使用される研究資金を提供したルートヴィヒ癌研究所によって支援されました。私たちは、このプロジェクトの初期段階での彼のアドバイス、最初の方法開発段階の後にこのプロジェクトに貢献したロナルド・ビッグス、およびデイブ・ジェンキンスとアンディ・シーアウが小分子発見をサポートし、アクセスするために、彼のアドバイスに感謝していますグループのハイコンテンツイメージングシステム。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アスピレーターチューブアセンブリ | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| 校正済みピペット (25 mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | 横河電機株式会社 | CV1000 | |
| コニカルチューブ (15 mL) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 顕微鏡 | 横河電機株式会社 | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| 解剖顕微鏡 | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab 準備済み | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| マイクロ遠心チューブ (1.5 mL) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom,ガラス底 | Greiner Bio-One | 781855 | |
| テトラミソール塩酸塩 | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo 対物レンズ (10回; 0.4 NA) | オリンパス | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo 対物レンズ (60回; 1.35 NA) | オリンパス | 1-U2B832 |
参考文献
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