Method Article

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

DOI:

10.3791/60362

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October 29th, 2019

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1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、80~100 C.エレガンス胚の3Dタイムラプスイメージングを1回の夜間実行で可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。さらに、データ分析を合理化するために、画像処理ツールと視覚化ツールが含まれています。カスタムレポーター株とこれらの方法の組み合わせは、胚発生の詳細なモニタリングを可能にします。

Abstract

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C.エレガンスは、胚発生時の細胞運命仕様と形態形成過程の系統的解析のための最高のシステムです。1つの課題は、胚発生が約13時間にわたって動的に展開することです。この半日のタイムスケールは、画像化できる胚の数を制限することによって実験の範囲を制限している。ここでは、1回の夜間実行で、中程度の時間分解能で80~100個の胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にするセミハイスループットプロトコルについて説明します。プロトコルは簡単で、ポイント訪問容量の顕微鏡へのアクセスを持つ任意の実験室によって実装することができる。このプロトコルの有用性は、生殖層の仕様および形態形成の主要な側面を視覚化するために最適化された蛍光マーカーを発現する2つのカスタム構築された株を画像化することによって実証される。データを分析するために、すべてのチャネル、Z ステップ、およびタイムポイントで、より広い視野から個々の胚をトリミングし、各胚のシーケンスを別々の tiff スタックに保存するカスタム プログラムが作成されました。ユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を含むプログラムは、可視化または自動分析の準備のために個々の胚を分離、前処理、均一に指向することにより、データ処理を合理化します。また、個々の胚データをマルチパネルファイルにコンパイルし、各時点で各胚の最大強度蛍光投影と明視野画像を表示するImageJマクロも提供されています。本明細書に記載されているプロトコルおよびツールは、40の前に説明した発達遺伝子のノックダウン後に胚発生を特徴付けるためにそれらを使用することによって検証された;この分析は、以前にアノトされた発達表現型を可視化し、新しいものを明らかにした。要約すると、この研究では、クロッピングプログラムとImageJ可視化ツールを組み合わせた半ハイスループットイメージング法の詳細を説明し、有益な蛍光マーカーを発現する株と組み合わせることで、実験を大幅に加速して分析します。胚。

Introduction

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C.エレガンス胚は、機械学的細胞生物学のための重要なモデルシステムであり、胚発生を駆動する細胞運命の仕様と形態形成過程の解析1、2、3、4 ,5,6,7,8,9.現在までに、胚における細胞レベルの事象と細胞運命仕様の両方の特徴付けの多くは、比較的高い時間分解能を1回に1回のイメージング実験(すなわち、10~100s毎に取得)を用いて達成されてきた。蛍光マーカー。数秒から数十分の順序でのイベントには適していますが、このアプローチは、時間単位から数日の順序で、より長いプロセスの特性評価を技術的に制限するようになります。最初の切断から伸びの終わりまでの胚の発達は約10時間かかります。この時間スケールでは、胚のより大きなコホートの同時に低い時間分解能イメージング(すなわち、5〜20分の時間間隔での取得)を可能にするセミハイス....

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Protocol

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1. セミハイスループットイメージングのためのC.エレガンス胚の準備

注:プロトコルのこの部分の目的は、半同期(2〜8細胞段階)C.エレガンス胚の集団を、適切なマーカー株から解剖し、イメージング用のガラス底384ウェルプレートにロードすることです。他のプレートフォーマットも機能する可能性がありますが、384ウェルプレートは、小さなウェルサイズが比較的小さな領域への胚の広がりを制約するため、タイムラプスイメージングのために複数の胚を含むフィールドの同定を容易にするため、好ましい。胚を大まかに同期させることで、現場の胚ごとに開発の完全な過程が確実に捕捉されます。

  1. 氷冷M9培地に溶解したテトラミソール塩酸塩(TMHC)麻酔薬の0.1mg/mL溶液を5~10mL調製し、氷冷M9培地(0.45M Na2HPO4∙7H2O、0.11 M KH2PO4、0.04M NaCl、0.09 MNH4Cl)を使用する解剖およびイメージング。この媒体は、孵化した幼虫を動かすことが初期の発達段階で胚のイメージングを妨げないことを保証する麻酔薬を含む。
    注:トリミングおよび可視化ツールを....

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Results

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C.エレガンス胚発生に対する分子摂動の影響を特徴付ける上で重要な課題は、胚が最初の切断から20°16で伸びの終わりまで進行するのに約10時間かかることです。胚の大きなコホートを同時に画像化できるセミハイスループット法は、各条件に対して十分なアンサンブルサイズと並行して複数の条件をイメージングできるため、このタイムスケールのイベントに役立ちます。定量分析 (図 1A)

セミハイスループットイメージング法とマルチマーカー株
ここで説明するセミハイスループットイメージング方法(図1Bで概説)は、384ウェルガラス底板を採用しています。マルチウェル形式では、最大14の条件を並列に配列することができ、井戸の小さなサイズは、高解像度イメージングのための胚を含むフィールドの識別を簡素化し、検索領域を制約しま.......

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Discussion

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この研究では、C.エレガンスにおける胚発生における遺伝子の機能をプロファイリングするために、より大規模な取り組みを可能にするために開発された一連のツールと方法について説明します。当社のセミハイスループット法により、1回の実験で80~100個の胚に対して20分分解能で胚発生の3Dタイムラプスイメージングが可能です。このプロトコルは任意の所望のマーカー株で使用するために適応することができますが、この研究は、胚発生中のイベントを監視するために開発された2つのカスタム株を使用する方法の可能性を示しています:(1)生殖層レポーター株、組織特異的プロモーターは、内胚葉、中胚葉および外胚葉核をマークするために蛍光ヒストンの発現を駆動し、(2)細胞接合部の蛍光マーカーの発現を駆動するために表皮および神経プロモーターを使用する形態形成レポーター株、プラズマ膜。2つの株をイメージングすることにより、細胞運命の仕様および形態形成事象に対する分子摂動の結果を顕著な詳細に捕捉することができる。この方法で生成されるデータの量によって提示される課題に対処するために、データ処理と視覚化を合理化するためにカスタムツールが開発されました。最初のツールは、.......

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Acknowledgements

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S.D.O.は、カリフォルニア州サンディエゴ大学サンディエゴ機関研究・学術キャリア開発賞(NIH/IRACDA K12 GM068524)の支援を受けています。A.D.とK.O.は、この研究を支援するために使用される研究資金を提供したルートヴィヒ癌研究所によって支援されました。私たちは、このプロジェクトの初期段階での彼のアドバイス、最初の方法開発段階の後にこのプロジェクトに貢献したロナルド・ビッグス、およびデイブ・ジェンキンスとアンディ・シーアウが小分子発見をサポートし、アクセスするために、彼のアドバイスに感謝していますグループのハイコンテンツイメージングシステム。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アスピレーターチューブアセンブリDrummond Scientific2-000-000
校正済みピペット (25 mL)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager Software横河電機株式会社CV1000
コニカルチューブ (15 mL)USA Scientific1475-0501
CV1000 顕微鏡横河電機株式会社CV1000
Depression slide (3-well)Erie Scientific1520-006
解剖顕微鏡NikonSMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJIOpen Sourcehttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab 準備済みhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM PlatesLab Preparedhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom,ガラス底Greiner Bio-One781855
テトラミソール塩酸塩Sigma AldirchT1512-10G
Tweezers, Dumont #3Electron Microscopy Sciences0109-3-PO
U-PlanApo 対物レンズ (10回; 0.4 NA)オリンパス1-U2B823
U-PlanApo 対物レンズ (60回; 1.35 NA)オリンパス1-U2B832
に付属)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

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