単離されたカエノラブディティス・エレガンス胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成

サマリー

多細胞系の組織複合体は、細胞外キューと個々の細胞挙動との因果関係の同定を混同した。ここでは、C.エレガンス胚ブラストメアと接着剤ポリスチレンビーズを用いて接触依存性キューと分割軸との直接的なリンクを研究する方法を提示する。

要約

多細胞系では、個々の細胞は、隣接する細胞や環境から来る様々な物理的および化学的手掛かりに囲まれています。この組織の複雑さは、外因性キューと細胞ダイナミクスとの間の因果関係の同定を混同する。合成再構成された多細胞システムは、研究者が他の人を排除しながら、特定の手掛かりをテストできるようにすることで、この問題を克服します。ここでは、単離されたカエノラブディティス・エレガンス・ブラストミアおよび接着剤ポリスチレンビーズを用いて細胞接触パターンを再構成する方法を提示する。手順は、卵殻除去、細胞細胞接着を破壊することによってブラストミア分離、粘着性ポリスチレンビーズの調製、および細胞細胞または細胞ビーズ接触の再構成を含む。最後に、この方法の応用により、胚の発達における空間細胞パターニングと細胞運命仕様の調節に寄与する細胞分裂軸の向きを調べる。この堅牢で再現性があり、多目的なin vitro法により、空間セル接触パターンと細胞応答との直接的な関係の研究が可能になります。

概要

多細胞発達の間、個々の細胞の細胞挙動(例えば、分裂軸)は、様々な化学的および物理的手掛かりによって指定される。個々の細胞がこの情報をどのように解釈し、それらが多細胞集合体を創発的性質として調節するかを理解することは、形態形成研究の究極の目標の一つです。モデル生物C.エレガンスは、細胞極^性1、細胞分裂^{パターン1、細胞運命決定2、}および神経^配線3および有機新^生4、5などの組織規模の調節などの形態形成の細胞レベル調節の理解に大きく寄与している。様々な遺伝的ツールがありますが、組織工学の方法は限られています。

C.エレガンス研究で最も成功した組織工学法は、古典的なブラストミア^分離6である。C.エレガンス胚は卵殻および透過性^バリア7に囲まれているので、その除去はこの方法の主要な手順の1つである。このブラストミア単離方法は、簡略化された方法で細胞細胞接触の再構成を可能にしますが、不要な手掛かりを排除することはできません。細胞接触は依然として機械的(例えば、接着性)と化学的手掛かりの両方を有し、それによってキューと細胞行動との因果関係を完全に分析する能力を制限する。

本論文で提示する方法は、リガンドとしてタンパク質を含む任意のアミン反応性分子に共有結合することができるカルボン酸修飾ポリスチレンビーズを使用する。特に、リガンドとしてローダミンRed-Xのアミン反応性を用いて、ビーズを細胞に視覚的に追跡可能かつ接着剤としました。リガンド分子のビーズ表面および第一級アミン基のカルボキシル基は、水溶性カルボジイミド1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)8、9によって結合される。得られた接着剤ビーズは、機械的キューが細胞^{ダイナミクス10}に及ぼす影響を可能にする。この技術を用いて、細胞分裂配^向10に必要な機械的手掛かりを同定した。

プロトコル

1. 接着剤ポリスチレンビーズの調製

注: このプロトコルは無菌技術を必要としません。

1. 1.5 mLマイクロ遠心管内のカルボキシル酸変性ポリスチレンビーズの重量を10mg。
2. ビーズを洗浄するには、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液を1mLチューブに加えます。MES緩衝液はリン酸塩や酢酸塩を含まないので、カルボジイミドの反応性を低下させることができ、タンパク質カップリング反応に用いることが好適である。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
3. ベンチトップ遠心分離機を介して2,000 x gで60 sのチューブを回転させます。
4. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
5. 手順 1.2 ~ 1.4 に従って、MES バッファーを 1 mL 使用してビーズをもう一度洗います。
6. 10 mgのEDACを含むMESバッファーをチューブに1mL加え、表面カルボキシル基を活性化します。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
7. 室温でチューブを15分間回転させてインキュベートします。
8. 2,000 x gで 60 s のビーズをスピンダウンします。
9. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
10. ビーズを洗浄するには、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を1mLチューブに加えます。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
11. 2,000 x gで 60 s のチューブをスピンダウンします。
12. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
13. 手順 1.10~1.12 に従って、1 mL の PBS でビーズをもう一度洗います。
14. 使用されるローダミンの最終的な濃度は、画像化される株に依存する。0.65 mM ローダミン Red-X 原液からローダミン Red-X の 1 mL、10 倍、1000 倍希釈シリーズを準備します。
15. 各シリアル希釈チューブにビーズのピペット20°L。
16. 室温でチューブを5分間回転させてインキュベートします。
17. 手順1.10~1.12を繰り返して、1mLのPBSでビーズを2回洗浄します。
18. チューブに1 mLのPBSを加え、4 °Cで最大6週間保存します。ライブイメージングに使用する顕微鏡でビーズの蛍光強度を確認します。ローダミン赤-Xコハク酸ジミジルエステルの適切な濃度は、撮像条件に依存する(図1)。
    注:ローダミンRed-X治療を行わないビーズは細胞に付着しません。ローダミン赤-Xは、蛍光マーカーならびに接着分子として機能する。正に帯電したローダミンRed-Xと負電荷プラズマ膜との間の静電気的相互作用は、接着の原因である。

2. 口ピペットの組み立て

1. タイゴンチューブをそれぞれ長さ約25cmと40cmに広くカット(内径6.35mm)と狭い(内径3.175mm)(図2)。
2. タイゴンチューブをポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルター(0.2μmの細孔サイズ)で接続します(図2)。
3. 市販のアスピレーターチューブを分解し、キャピラリーホルダーとマウスピースをそれぞれ狭くて広いタイゴンチューブの端に取り付けます(図2)。
   注:PTFEフィルタは、口のピペットを介して次亜塩素酸塩溶液の煙の吸入を防ぐために使用されました。

3. 胚ブラストミアの単離

メモ:漂白液の切断や接触を避けるため、手袋とラボコートを着用してください。

1. マイクロキャピラリーの両端(容量;10°L)を左右の手で持たします。
2. マイクロキャピラリーを両端に引っ張って張力を加え、バーナーの上に毛細血管の中心を持って2本の手で引っ張られた毛細血管を作ります(図3A)。
3. 解剖顕微鏡下の鉗子で手で引っ張った毛細血管の先端をトリミングし、引っ張った毛細血管を口管装置に取り付ける(図2)。2種類のピペットを用意します。ピペットの先端開口部サイズは、胚移植および卵殻除去のためのC.エレガンス胚の短軸長(30μm)の約2倍と1倍である必要があります。
4. ピペット45μLの卵塩溶液をマルチウェルスライドのウェル上に(図4A;底部)。
5. 5-10大人C.エレガンスを卵塩溶液を含む井戸の上に置きます。
6. 初期のC.エレガンス胚を得るためには、C.エレガンス体の左右に2本の針を配置し、針を互いにスライドさせて大人を粉々に切る(図4A;上回路図)。
7. 次亜塩素酸塩溶液のピペット45μLを、卵塩溶液を含む井戸の隣の井戸に(図4B)。
8. 次亜塩素酸塩溶液を含む井戸の隣のその後の3つの井戸にシェルトンの成長培地のピペット45μL(図4B)。
9. 1細胞期および初期の2細胞期胚を、胚移植のための手描き毛細血管を用いてマウスピペットすることにより次亜塩素酸塩溶液に移す(図4B)。
10. 40~55s待ちます。
11. 次亜塩素酸塩溶液からシェルトンの成長培地に胚を移し、胚移植用の手描き毛細血管を用いてマウスピネットして胚を洗浄する(図4B)。
12. 胚移植用の手描きキャピラリーをマウスピネットしてシェルトンの成長培地の新しい井戸に移して胚を再度洗浄する(図4B)。
13. 洗浄した胚を、胚移植用の手描きキャピラリーでマウスピネットすることで、シェルトンの成長培地の新しい井戸に移します。卵殻除去に手描きのキャピラリーを使用して、ピペットを慎重に繰り返します(図4C/中間回路図)。卵殻が正常に除去されると、胚細胞はより球状になります(図4C;右)。
14. 卵殻除去のための手描きキャピラリーで2細胞段階胚性芽球を穏やかに連続的にピペットで分離する(図4D)。

4. ブラストミアとビーズによる接触パターンの再構成

メモ:ビーズからの細胞の解離を避け、タイムリーな画像取得を容易にするために、イメージング顕微鏡の下で作業します。

1. 反転顕微鏡を用いて観察するには、図5のように撮像室を用意する。
   1. カバースリップをカバースリップホルダーに置きます(図5A)。
   2. カバースリップの端にテープを貼って安定させます。テープ付きの側面は「背面」側です(図5A,B)。
   3. カバースリップホルダーを「前面」側に反転し、疎水性ペンでカバースリップに円を描きます(図5C)。
      注:胚が口のピペットによって操作可能である場合、任意のガラス底皿も動作します。
2. 疎水性マーカーによって描画された円の中にシェルトンの成長培地を追加します(図5D)。
3. 単離されたブラストミアを撮像室に移す。
4. 胚移植用の手描きキャピラリーを使用して、化学的に機能化されたビーズの少量を分配する。
5. ビーズが単離されたブラストミアに付着するまで、手描きの毛細血管に吹き込むことによって、ポリスチレンビーズの位置を制御します。
6. 媒体の蒸発を避けるためにカバースリップを取り付ける(図5E)。ライブ イメージングを実行します。

5. 重要試薬の調製

1. 卵塩溶液(10mL):5 M NaClの235 μLと2M KClの240°L_をdH2Oの9525°Lと組み合わせます。
2. 次亜塩素酸塩溶液(10mL):クロロックス(次亜塩素酸ナトリウム約7.5%を含む)を10 N NaOHの2.5 mL(次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度は約5.625%)と組み合わせます。
   注:多くの公表された方法はキチナゲを用いてキチナスの卵殻を消化しているが、次亜塩素酸塩^溶液11を用いた方法を採用した。チチナゼ活性のバッチ間の変動を回避することにより、この方法はより再現性と費用対効果の高いアプローチであると考えています。
3. 0.81 mM イヌリン溶液 (40 mL)
   1. 0.2 gのイヌリンを dH₂O の 40 mL に加えます。
   2. 溶解するオートクレーブ。
      注:4°Cで1ヶ月間保持します。
4. 0.5 M MES バッファ(500 mL)
   1. 48.81gのMESを蒸留水400mL(dH2O)に溶解する。
   2. pH を 6.0 に調整します。
   3. dH₂Oで総容積を500mLにします。
5. PBS溶液(1 L)
   1. 10倍のPBS溶液を作製するには、pbSプレミックス粉末の1パッケージ_をdH2Oの1Lに溶解する。
   2. 10 倍の PBS 溶液を dH₂O の 900 mL と組み合わせます。
6. 5% ポリビニルピロリドン (PVP) 溶液 (4 mL)
   1. 滅菌条件下で、ショウジョウバエシュナイダーの培地の4 mLにPVPの0.2gを溶解する。
      注:常にティッシュ培養(TC)フードでシュナイダーのミディアムストックを開きます。4 °Cで1ヶ月間保管してください。
7. 0.65 mM ローダミン レッド X ストックソリューション (2 mL)
   1. ローダミン赤-Xの体重1mg。
   2. 2 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) を加えた溶解します。
   3. アリコートと-20°で保存します。
8. シェルトン成長培地 (SGM) (10.25 mL)
   1. 滅菌条件下では、ショウジョウバエシュナイダーのミディアム8mL、PVP溶液1mL、イヌリン溶液1mL、基底培地イーグル(BME)ビタミン1mL、ペニシリンストレプトマイシン50μL、脂質100μLを一緒に濃縮します。
   2. 1.5 mLマイクロチューブにSGMのアリクォート325°L。
      注:4°Cで約1ヶ月間保管してください。
   3. ブラストミア単離の日に、175 μLの胎児ウシ血清(FBS)をSGMに加えます(総体積は500°L)。
      メモ:FBSは-20°Cに保管し、使用前に解凍してください。FBS は熱殺される必要はありません。

結果

ビーズ調製のために、GFP-ミオシンIIおよびmCherry-ヒストンを発現するトランスジェニック株に対するローダミンRed-Xコハクシニルエステルの最適量を決定した(図1A-D)。細胞周期進行のマーカーとしてmCherryタグ付きヒストンを使用しました。ローダミン赤-XとmCherryの両方が561nmレーザーで照らされるため、ローダミンRed-X信号の最適強度は、細胞とビーズの同時イメージングを可能にするヒストンの強度に匹敵します。例えば、0.005μg/mLローダミンRed-Xコハジミジルエステルで処理したビーズからの蛍光シグナルは弱すぎてビーズを可視化できませんでした(図1A)。一方、5μg/mLローダミンRed-Xコハシニジルエステルで処理したビーズからの蛍光シグナルは、mCherry-histoneを画像化するには強すぎました(図1D)。0.5μg...

ディスカッション

簡略化された細胞接触パターンの再構成により、研究者は形態形成のさまざまな側面における特定の細胞接触パターンの役割をテストすることができます。この技術を用いて、細胞分裂軸が接着^ビーズ10との物理的接触によって制御されることを示した。分裂軸仕様は、形態^形成14、幹細胞分裂15、16、および組織恒常^性15、16に寄与することにより多細胞発達にとって重要であるため、この方法は、動物組織形成の新しいメカニズムを照らすことができるべきである。

細胞分裂の向きに加えて、この方法は機械的手掛かりと細胞運命との関係をテストするプラットフォームとなる可能性がある。以前の研究では、機械的なキューがセルの運命仕様を制御することを報告しました。ヒト間葉系幹細胞は、異なる剛

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩	Alfa Aesar	AAA1080703	ビーズ調製用
アスピレーターチューブアセンブリ	Drummond	21-180-13	割球分離用。
線虫株:N2、野生型	Caenorhabditis 遺伝学センター	N2	この研究で使用された
線虫株:KSG5、遺伝子型:zuIs45; itIs37		この研究で使用された	KSG5
校正されたミルコピペット、10 & micro;L	Drummond	21-180-13	割球単離用
カルボン酸変性ポリスチレンビーズ(30 µm直径)	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	ビーズ調製
用 CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	割球分離用。組織培養フードで作業します。
クロロックス	クロロックス	N. A.	割球分離用。次亜塩素酸塩処理がうまく機能しない場合は、新しいボトルを開けてください。
カバースリップホルダー	インハウス	N.A.	割球分離用。
解剖顕微鏡:Zeiss Stemi 508(Mスタンド付き)。光源はLED内蔵。接眼レンズの倍率は10倍です。	カールツァイス	ステミ508	割球分離用。
ウシ胎児血清、適格ワンショット、カナダ原産地	Gibco	A3160701	割球分離用。組織培養フードで作業します。
一般的な使用と精密 グライド 皮下注射針、25ゲージ	BD	14-826AA	割球単離用
イヌリン	アルファ アエサル	AAA1842509	割球単離用
MEM ビタミン溶液 (100x)	Gibco	11120052	割球単離用。
MES (Fine White Crystals)	Fisher BioReagents	BP300-100	ビーズ調製用
Multitest スライド 10 ウェル	MP Biomedicals	ICN6041805	割球単離
用 PBS、リン酸緩衝生理食塩水、10 x 粉末	Fisher BioReagents	BP665-1	ビーズ調製用
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	割球分離。
ポリビニルピロリドン	フィッシャーバイオ試薬	BP431-100	割球分離用
塩化カリウム	ショップ	POC888	割球分離用
ローダミンレッドX、スクシンイミジルエステル、5-異性体	分子プローブ	R6160	ビーズ調製用
シュナイダー's ショウジョウバエ 滅菌 ミディア	Gibco	21720024	割球単離用。組織培養フードで作業します。
塩化ナトリウム	Bioshop	SOD001	割球単離用
水酸化ナトリウム溶液、10 N	フィッシャーケミカル	SS255-1	割球単離用
スピニングディスク共焦点顕微鏡:横河電機CSU-X1、ツァイスアクシオバート倒立スコープ、Quant EM 512カメラ、63X NA 1.4 プランアポクロマート対物レンズ。システムはSlidebook 6.0によって制御されていました。	インテリジェントイメージングイノベーション	N.A.	ライブイメージング用
シリンジフィルター、PTFE、非滅菌	バシックス	13100115	割球分離用。
タイゴンS3ラボラトリーチューブ、、製剤E-3603、内径3.175 mm	サンゴバンパフォーマンスプラスチック	89403-862	割球分離用。
タイゴンS3ラボラトリーチューブ、製剤E-3603、内径6.35 mm	サンゴバンパフォーマンスプラスチック	89403-854	割球単離用。