光遺伝学的変調型心筋細胞活性の電気機械評価

サマリー

ウサギ心筋細胞におけるGtACR1活性化の電気機械効果を評価するプロトコルを提示する。細胞分離、培養、アデノウイルス伝達、パッチクランプ、炭素繊維技術による機能実験に関する詳細な情報を提供します。

要約

過去20年間、光遺伝学的ツールは、心臓を含む興奮性組織における細胞型特異的活性を調節する強力な手段として確立されてきた。チャネルロドプシン-2(ChR2)は心筋細胞(CM)における膜電位を脱分極する一般的なツールであるが、潜在的に作用電位(AP)を引き出す可能性があるが、CM活性の信頼できるサイレンシングのための有効なツールは欠けている。光遺伝学的阻害のためにアニオン・チャネルロドプシン(ACR)を用いることが示唆されている。ここでは、培養ウサギCMにおけるギラルディア・セタから天然ACR GtACR1を活性化する効果を評価するプロトコルについて述べた。このプロトコルには、ウサギの心臓からのCM分離、最大4日間の細胞の播種および培養、光ゲートクロリドチャネル用のアデノウイルスコーディングによるトランスダクション、パッチクランプおよび炭素繊維の調製、データ収集および分析が含まれる。全セル構成でパッチクランプ技術を使用すると、光作動電流(電圧クランプモード、Vクランプ)とAP(電流クランプモード、I-クランプ)をリアルタイムで記録できます。パッチクランプ実験に加え、細胞内ミリューを乱すことなくCM活性の機能評価のための収縮性測定を行います。そのために、細胞は炭素繊維を用いて機械的にプリロードされ、収縮はサルコメア長さおよび炭素繊維距離の変化を追跡することによって記録される。データ解析には、Iクランプ記録からのAP期間の評価、Vクランプ記録からのピーク電流、炭素繊維測定からの力計算が含まれます。記述されたプロトコルは、CM活性に対する異なる光遺伝学アクチュエーターの生物物理学的影響の試験に適用することができ、心臓組織および心臓全体における光遺伝学的実験の機械学的理解の開発のための前提条件である。

概要

単細胞緑藻^1,2の眼球に初めて記録されたChR媒介光電流。クラミドモナス・レインハルトイChR1およびChR2の遺伝的クローニングおよび異種発現の直後に、ChRは、キセノプス卵母細胞および哺乳類細胞における膜電位を光^3,4によって変化させるツールとして使用された。カチオン非選択的ChR脱分極は、ChRの逆転電位に負の安静膜電位を有する細胞の膜を脱分極する。したがって、ニューロンやCMを含む興奮性細胞でAPを引き出すために使用することができ、光ペーシング^5、6を可能にする。

陽イオンChRと相補的に、光駆動陽子、塩化物およびナトリウムポンプ^7、8、9は、ニューロン活性10、11、12を阻害するために使用されてきた。しかし、後者には限界があり、吸収された光子ごとに1つのイオンが輸送されるように、高い光強度と持続的な照明を必要とする。2014年、Wietekらおよびベルントらの2つの独立した研究は、チャネル細孔^13、14の突然変異を介してカチオン伝導ChRをACRに変換する方法について説明した。1年後、自然ACRはクリプトフィテギラルディアシータ(GtACR)15で発見されました。設計されたACRが残留カチオン伝導を示したように、それらは自然なACRに置き換えられ、大きな単一チャネル伝導度および高い光感度¹⁵によって特徴付けられる。GtACRは、塩化物^16,17の反転電位に向かって膜電位を偏光させることによって神経活動を沈黙させるために用^いた。Govorunovaら他の培養ラット心室CMにGtACR1を適用し、プロトンポンプ^Arch18のような以前に利用可能な阻害ツールを活性化するのに十分ではなかった低光強度レベルで効率的な光抑制を示した。我々のグループは最近、CMのGtACR1媒介光抑制は脱分極に基づいており、GTACR1も^CM19の光ペーシングに使用できることを報告した。

ここでは、培養ウサギ心室CMに対するGtACR1光活性化の電気生理学的および機械的効果を研究するためのプロトコルを提示する。まず、細胞の分離、培養、および伝達について説明します。電気生理学的効果は全細胞パッチクランプ記録を使用して測定される。所定の膜電圧での光媒介電流は、Vクランプモードで評価されます。膜電位ダイナミクスは、CM(Iクランプモード)を電気的または光学的にペーシングしながら測定されます。電気的にトリガされるAPの光学的阻害は、持続光アプリケーションを使用して試験される。機械的効果は、サルコメア長さのイメージングベースの追跡と組み合わせて炭素繊維を使用して測定されます。そのために、光学的にペース可能な細胞は、反対側の細胞端付近の形質膜に2つの炭素繊維を取り付けることによって機械的にプリロードされる。サルコメアの長さの変化は光学か電気ペーシングの間に記録される。最後に、細胞の電界刺激時に光抑制を測定し、発生した力を分析する。

このプロトコルには、図1のフローチャートに示すステップが含まれています:ウサギの深部麻酔、チオペンタール過剰摂取注射、心臓切除、ランゲンドルフ灌流および組織消化、組織の機械的解離から細胞を放出する、CM収量の顕微鏡分析、CMの培養、アデノウイルス5型のトランスダクション、および機能的実験の続く。

図1:電気的および光学的にペース可能なCMを得るために使用されるプロトコルのフローチャート。心臓は生後9〜10週のウサギから切除され、ランゲンドルフのセットアップを使用して心臓組織を浸透させながら消化される。細胞は機械的な攪拌によって解放される。CMの収率は顕微鏡の下で計る。CMは培養され、アデノウイルス5型および機能実験で導入され、48〜72時間の導入後に行われる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべてのウサギの実験は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUに記載されているガイドラインに従って行われ、バーデン・ヴュルテンベルク州の地方自治体(レジエルングスプレシディウムフライブルク、X-16/10R、ドイツ)によって承認されました。

1. 細胞分離のためのソリューション

1. 以下の要件の水で細胞分離のための溶液を準備する (表1)、表2に示したイオン組成物に従って。
   注:CaCl₂およびMgCl₂は1 Mのストックソリューションから追加されます。

	水の要件
25°Cの導電率[μS/cm]	0.055
パイロゲン [EU/mL]	< 0.001
粒子(サイズ > 0.22 μm) [1/mL]	≤ 1
総有機炭素 [ppb]	< 5
微生物 [CFU/mL]	≤ 1
RNase [ng/mL]	< 0.01
DNase [ng/mL]	< 4

表1:水の要件

	生理食塩水 (1)	低カルシウム、高カリウム溶液 (2)	酵素溶液 (3)	ブロッキング ソリューション
ナクル [mM]	137	137	137	137
KCl [mM]	4	14	14	14
ヘペス [mM]	10	10	10	10
クレアチン [mM]	10	10	10	10
タウリン [mM]	20	20	20	20
グルコース [mM]	10	10	10	10
MgCl2 [mM]	1	1	1	1
アデノシン [mM]	5	5	5	5
L-カルニチン [mM]	2	2	2	2
カクル2 [mM]	1	-	0.1	0.1
ナヘパリン [IU/L]	5000	-	-	-
EGTA [mM]	-	0.096
コラゲラーゼタイプ2,315 U/mg [g/L]	-	-	0.6	-
プロテアーゼ XIV [g/L]	-	-	0.03	-
牛血清アルブミン [%]	-	-	-	0.5
浸透性 [mosmol/L]	325 ± 5	345 ± 5	345 ± 5	345 ± 5

表 2: CM 分離のソリューション

2. 37 °CでpH 7.4にすべてのソリューションを調整し、浸透性を確認してください。
   注:心臓切除の直前に酵素(コラゲローゼ2型とプロテアーゼXIV)を溶解してください。使用前にすべての溶液を酸素化してください。

2. ランゲンドルフ灌流セットアップの準備

注: 使用されているセットアップは、カスタムメイドです。図2に示すように、セットアップは3つのウォータージャケット貯留層(1-3)、1つのスパイラル逆流熱交換器(4)および水ジャケットの灌流容器(5)から成っている。

図2:ウサギ細胞分離に最適化されたランゲンドルフ灌流セットアップ(1-3)水ジャケット貯留層、(1)生理食塩水、(2)低カルシウム、高カリウム溶液および(3)酵素含有心肢溶液。(4)スパイラル逆流熱交換器及び(5)水ジャケット回収槽。ウォータージャケットシステムの流入は、スパイラル熱交換器(熱交換器の端に灌流カニューレを残す溶液の温度は37°Cで一定である必要があります)であり、続いて灌流容器と3つの貯水池が続きます。すべてのソリューションは酸素化(破線)です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

1. 水浴のポンプをオンにして、熱交換システムで38°Cで水を循環させ、すべての溶液を37°Cに予熱します。
   注:(4)の流出時の温度は37°Cで制御し、一定でなければなりません。
2. 3つのリザーバにそれぞれの溶液を充填し、対応する溶液で各ライン(黒)を洗浄します。(1)溶液を使用して気泡なしで端のメイン(青)ラインを埋めます。
   注:前(10分)および使用中に溶液を酸素化してください。低カルシウム、高カリウム溶液で、貯水池(3)からタップまでのラインを充填します。
3. カニューレで大大仏の周りに心臓を結ぶために縫合糸を準備します。

3. 細胞分離

1. 以下の注射器を用意します。
   1. セデレーション/麻酔の場合:0.5 mL/kg体重エスケタミン塩酸塩(25mg/mL)と0.2 mL /kg体重キシラジン塩酸塩(2%)を混合します。
   2. 2つの注射器に12 mLのNaCl溶液(0.9%)を充填します。
   3. 6 mL の 12.5 mg/mL Na チオペンタールを調製し、0.9% NaCl 溶液に溶解します。
   4. 0.2 mLのエスケタミン塩酸塩(25mg/mL)を注射器に充填します。
   5. 0.9%NaCl溶液(終了濃度1,000 IU/mL)の1mLで、Na-ヘパリン(5,000 IU/mL)を0.2mL希釈します。
2. エケタミン塩酸塩およびキシラジン塩酸塩の筋肉内注射を介してウサギを鎮静/麻酔(9-10週間、ニュージーランド白ウサギ、メスまたはオス、〜2kg)(ステップ3.1.1)。
   注意:ウサギは完全に麻酔をするために少なくとも10分を必要とします。正確な持続時間は体重によって異なります。右反射の喪失で麻酔を確認します。
3. 胸と静脈が置かれている耳を剃ります。
4. 柔軟なカニューレを耳静脈に挿入し、テープで固定し、0.9%NaCl溶液で洗い流します。
5. 1 mLのNa-ヘパリン溶液を静脈内に注入し、0.9%NaCl溶液で洗浄します。
6. 0.2 mLのエスケタミン塩酸塩を注入し、再び0.9%NaCl溶液で洗浄し、無呼吸までナチオペンタールを注入する。
   注:ウサギはペダルの撤退反射に応答しないでください。
7. 左側の胸部を開き、心膜を取り除きます。
8. 心臓が切除されたときにタイマーを開始し、生理食塩水で心臓を2回洗います。
   注:心臓組織への偶発的な損傷を防ぐために丸い先端とはさみを使用してください。
9. 生理食塩水で大器官を浴び、すべての組織を溶液に保ちます。ランゲンドルフ灌流システム(生理食塩水(1)、速度24 mL/分)をオンにします。
10. 心臓をランゲンドルフ灌流セットアップに移し、大間をパーフューズノズルに接続し、大開の周りの縫合糸で心臓をカニューレ(<1分)にしっかりと結びます。
    注:生理的な生理食塩水でカニューレを事前に充填し、カニューレーションサイトからランゲンドルフのセットアップへの輸送中にカニューレに入る気泡がないことを確認し、バブルフリー接続します。
11. すべての血液が洗い流されるまで心臓を浸透する(2-3分)。
12. 低カルシウム、高カリウム溶液に切り替える(2)。心臓が鼓動を停止した後、さらに2分間パーフューズし、酵素溶液に切り替えます。
13. 酵素溶液を再循環し始め、消化開始から2分後に、リザーバに戻します。5分消化後に16mL/分に速度を下げます。
14. 組織が柔らかく見える場合(消化の40〜50分)、カニューレから心臓を切断し、左心室を分離します。
15. 細胞を機械的解離(ピペットで組織を穏やかに引き離し、組織を保持するための細かい鉗子)で細胞を遮断する。
16. メッシュ(細孔径^1mm2)と遠心分離機を22 x g(重力加速度)で2分間濾過します。
17. 非筋細胞を含む上清を取り除き、ブロッキング溶液中のCMを再中断する。

4. CMの培養

注:滅菌条件下で次の手順を実行します。

1. 薄いラミニン(エンゲルブレス-ホルム-群れのマウス肉腫基質膜から、1 mg/mL)1:10無菌リン酸緩衝生理食塩水(Ca^2+/Mg2+なし)で、最終濃度100μg/mLにする。
2. 表3に示すように、サプリメントを用いてM199培地で培地を調製する。

	M199培地中の細胞培養培地
クレアチン [mM]	5
L-カルニチン塩酸塩 [mM]	2
タウリン [mM]	5
ナピルヴァット [mM]	1
インスリン(ウシ膵臓)[U/L]	0.25
シトシン-β-D-アラビノフラノシド [mM]	0.01
ゲンタマイシン [mg/mL]	0.05

表3:細胞培養培地。

3. 滅菌フィルター溶液(0.22 μm)を加え、5%の胎児ウシ血清を加えます。
4. パッチクランプ実験用オートクレーブカバーリップø 16 mm、厚さ0番は、培養前に100 μg/mLラミニンでコーティングします。
5. 炭素繊維実験では、ペトリ皿表面にポリ(2-ヒドロキイェチルメタクリレート)(ポリ-HEMA、0.12 g/mL(95:5 EtOH:H₂0)をコーティングし、固めます。
   注:細胞はポリヘマコーティングされたペトリ皿に「固執」しません。これは、細胞力学研究における摩擦のない収縮にとって極めて重要である。
6. CMを再懸濁後(10〜15分程度)、上清を取り除き、培養液中のCMを再懸濁させた。
7. ノイバウアーチャンバーを備えたCMをカウントし、ラミニンコーティングされたカバーリップまたはポリHEMAコーティングされたペトリ皿のいずれかで、17,500セル/mLの目標密度で種子を数えます。
8. 37°Cで細胞をインキュベートし、5%CO2を3〜4時間用いた。カバースリップシード細胞の培地(37°C)を交換する。
9. 75の多重度の感染(MOI)でGtACR1-eGFPのコードを付加し、48時間後に機能実験を開始する。
   注:トランスダクション後、細胞を暗闇の中に保管してください。青色または緑色の光活性化タンパク質を操作する場合は、赤色の照明を使用します。市販のアデノウイルス送達システム(表を参照)は、GtACR1-eGFPをコードする遺伝子をアデノウイルスベクターにクローン化するために使用される。目的の挿入物としては、ここでGtACR1-eGFP、PCR増幅し、次いで、IN-フュージョンクローニング反応におけるCMVプロモーターを含むアデノウイルスベクターと組み合わせる。CMV(ヒトサイトメガロウイルス)プロモーターは、哺乳類細胞における遺伝子導入の過剰発現を促進するために一般的に使用される。eGFPは、最大488nmの励起および507 nmの放出の最高のエーコレアビクトリアから誘導される高められた緑色の蛍光タンパク質である。アデノウイルス(タイプ5)は、チャリテ大学ベルリン、ベルリン国立大学ファーマコロジー研究所、マイケル・シュップ教授で外部生産されました。
   注意: アデノウイルス伝達はBSL-2安全レベルの作業として分類され、適切な安全対策が法的に要求されます。

5. 機能実験

メモ:逆蛍光顕微鏡を使用して録音を行います。透過光を凝縮器の赤色バンドパスフィルタ(630/20 nm)でフィルタリングし、GtACR1の共活性化を避けます。

1. パッチクランプのセットアップ
   1. アンプとアナログからデジタルへのコンバータを組み合わせて使用します。データ取得ソフトウェアを使用して電流データと電圧データを記録します(資料表を参照)。
      注:記録されたデータは10 kHzでデジタル化され、5 kHzでフィルタリングされます。
2. カーボンファイバーのセットアップ
   1. カメラを使用して、光学コントラストの変化を追跡することで炭素繊維位置とサルコメアの長さを検出します(炭素繊維は、縞模様の上に重ね合わせ、より暗い構造として表示されます)。図3に、セットアップの概略図を示します。
      注:サルコメアの長さは、ストリエーションパターンのパワースペクトルの高速フーリエ変換(FFT)を使用してリアルタイムで計算されます。

図3:炭素繊維測定の実験設定を描いたスキーム(図面はスケールではありません)。2つの炭素繊維が細胞に取り付けられ、その位置はピエゾポジショによって制御される。ペーサーは電界刺激のために使用される。多色LEDは、物体平面内の細胞の照明のために反転顕微鏡の蛍光ポートに結合される。LED電源は、デジタルアナログコンバータ(DAC)のデジタル出力を介してデジタルパルスを受信する専用の制御ボックスを介して制御されます。DACは、蛍光システムインターフェースとアナログ出力を介して通信します。セルラーイメージング用の白黒カメラ(774×245ライン)をコンピュータに接続して、サルコメアの長さと炭素繊維の曲げを追跡します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. 時を合わせた照明
   1. 異なる色の3つのLEDを含む外部カスタムメイドのLED制御ボックスを介して蛍光顕微鏡と光ゲートイオンチャネルの活性化のための光を提供する(460 nm、525 nm、640 nm、材料表を参照)。
   2. データ収集ソフトウェアプロトコルで生成された外部 Time to Live (TTL) パルスを介して LED を制御できるように、コントロールボックスのマイクロコントローラおよびグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)コードを変更します(資料表を参照)。デジタルアナログコンバータを介して、TTLパルスをLED制御ボックスに送信します。
   3. LEDを駆動し、GUIを介してパルスの数を選択します。GUIからコマンドを受け取ると、マイクロコントローラは新しいコア上でプロセスを開始します。このプロセスでは、TTL入力とGUIから設定された制御スイッチが継続的にチェックされます。
   4. TTL 入力が正の場合、マイクロコントローラは LED をオンにしてから TTL 入力のチェックを再開します。TTL信号がゼロに戻ると、マイクロコントローラはLEDをオフにして、残りのパルスの数を1つ減らします。コントロールスイッチが偽であるか、パルス数がゼロの場合、マイクロコントローラは、GUIから新しいコマンドを受信するまでこのプロセスを停止します。
   5. 直接顕微鏡のバックポートにLEDを結合します。
4. オブジェクト平面の光強度の決定
   1. ステージマイクロメーターで照らされた領域を測定します(目標倍率40倍、A = 0.8 mm^2)。
   2. 光パワーメーターを使用します(材料表を参照)。
   3. 実験の設定を定義:励起波長(525 nm)、客観的拡大(40倍)、励起フィルタ(530/20 nm)またはミラー、および様々なLED入力電圧で光パワー[W]を読み出す。
   4. 光の強さ [W]を照らされた領域 [mm 2] で割って光強度 [W/mm^2]を計算します(ここでは 0.8 mm^2)。
      注: ステップ 5.6 の各プロトコルで実際の光パワーを測定して、10 ミリ秒の短い光パルス持続時間と長い時間の間に設定値が保持されているかどうかを確認します (補足図 1)。
5. パッチクランプ実験の準備
   1. 次の外部ソリューションと内部ソリューションを準備します (表 4; 水の要件については表 1を参照してください ) 。
   2. 内部溶液を300±5 mOsmol/L.アリコートにグルコースで浸透モルモルを調整し、-20°Cで保存します。
      注:記録の日のために氷の上に内部ソリューションを保ちます。外部ソリューションを室温に保ちます。ここで説明したパッチクランプ溶液は、以前に使用された溶液に基づいており^、Cl-濃度は低く、より生理学的なレベル⁷に変更された。それぞれの光遺伝学アクチュエータのイオン選択性の特性評価については、細胞外および細胞内溶液¹⁹における主要イオンの濃度(例えば、Cl-、Na+、K+、H+)を変化することを提案する。
   3. ピペットホルダーから記録電極を外し、非常に細かいサンドペーパーで銀線から塩化銀層を取り除きます。
      注: このステップは、各測定日の始めに行います。
   4. ワイヤを1.5Vバッテリーの正極に接続し、3 M KCl溶液に浸して塩化銀コーティングを10分間浸します。
      注: マイナス極は、3 M KCl溶液に浸したリファレンスシルバーのワイヤに接続されています。
   5. 測定チャンバーを準備する:測定チャンバーのフレームにシリコングリースを置き、チャンバーが密封されているフレームの上部にカバースリップ(直径:50mm、厚さ0番)を置きます。
   6. リファレンス銀/塩化銀ペレット電極を槽に入れ、ヘッドステージに接続します。
   7. マイクロピペットプーラーを使用して、ソーダライムガラスキャピラリー(外径:1.55mm、内径:1.15mm)から1.7~2.5 MΩのパッチピペットを引き出します(材料表参照)。
   8. データ収集ソフトウェアを起動し、膜試験を調整します(パルス10 mV(15 ms、ベースライン0 mV)

	外湯溶液	内部ピペット溶液
ナクル [mM]	140	-
KCl [mM]	5.4	11
カクル2 [mM]	1	-
MgCl2 [mM]	2	2
グルコース [mM]	10	-
ヘペス [mM]	10	10
K-アスパルテート [mM]	-	119
Mg-ATP [mM]	-	3
EGTA [mM]	-	10
博士	7.4 (NaOH)	7.2 (KOH)
浸透性(グルコースで調整)[mOsmol/L]	300 ± 5	300 ± 5

表 4: パッチクランプソリューション

6. パッチクランプ測定用プロトコル
   1. Vクランプモードで-74 mVの保持電位で光活性化プロトコルを記録します。300 ms の光パルスを使用します。
      注:培養されたCMの静止膜電位に近いVクランプ記録を実行することをお勧めします(Iクランプで確立され、トランスデューシングCMと非トランスデューシングCM¹⁹の両方に対して-79 mVと-77 mVの間で手で確立されています)。新たに単離された細胞は、-79 mVの平均安静膜電位を示す(補足図2、液体接合電位の補正後の全ての値)。
   2. 0 pA の I クランプ モードで AP を録音します。
      1. 電気ペーシングの場合、電流パルスを10 ms(0 pAから10 ms以内の設定値までランプ)に注入し、0.25 HzでAPを引き出すしきい値を求めます。
      2. 光ペーシングの場合は、信頼性の高いAPを引き出すために、最小の光強度で10 ms、0.25 Hzの光パルスを使用します。
   3. 0 pA で I クランプ モードで光抑制を記録します。ステップ 5.6.2.1 で説明したように AP を引き出し、15 の電気的にトリガされた AP の後に 4 mW/mm²で 64 s に持続光を適用します。
      注:図 6Fは、持続光の間に高電流注入が適用される光抑制プロトコルを示しています。しきい値の1.5倍(ここでは0.7 nA)から、注入電流は0.1 nA(最終レベル:2.2 nA)のステップで増加しました。試験された電流振幅すべてで、持続光アプリケーションはAP生成を阻害した。
      1. 制御実験として、光応用を行わずに64sの電気刺激を一時停止する。
7. パッチクランプ実験
   注:暗闇の中で次の実験を行います(赤色の光は、青色/緑の光起動ツールに使用できます)。
   1. 外部溶液を使用して測定室にセルを入れてカバースリップを置き、蛍光CMを選択します。
      注:eGFP陽性細胞は、バンドパス励起フィルタ(450 nm - 490 nm)、510 nmの二色性ミラー、515 nmロングパスエミッションフィルタと組み合わせて青色LED(460 nm)を使用して検出できます。他の蛍光タグを使用する場合は、対応するLEDおよび蛍光フィルタセットを使用してください。高いトランスダクション効率が達成された場合(GtACR1アデノウイルスで99%を当社の手で)、機能実験の前にeGFP蛍光をチェックする必要はありません。これにより、GtACR1 の事前アクティベーションが回避されます。
   2. パッチピペットに内部溶液を充填します。先端に気泡がないことを確認します。
   3. ピペットホルダーにピペットを取り付け、内部溶液に記録銀塩化物被覆銀線を挿入します。
   4. セル接続構成に到達した後、-74 mVの保持電位を持つデータ収集ソフトウェアで全セルモードに切り替えます。細胞全体の構成にアクセスするために穏やかに負圧を加えることによって膜を破裂させる。これは、測定された静電容量の即時増加によって示される。
   5. セクション 5.6 で説明されているプロトコルを実行します。
8. 炭素繊維技術
   1. 炭素繊維を製造する。
      1. ガラスの毛細血管を使用して次のパラメータを使用: 2.0 mm, 内径: 1.16 mm, 長さ: 100 mm (材料表を参照) 。マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリーを同じ長さの2つのピペット(全テーパ長〜11mm、図5)に引き込み、最終的な内径を〜30μmにします。
         注:最初と2番目のプルに使用される設定は、それぞれ85.2%(プーラーの最大出力に比例)と49.0%です(フィラメントのプーラー、タイプ、年齢によって異なります)。
      2. 12 V、24 Aの設定を使用して、自作のマイクロ鍛けでピペットを最大45°まで曲げます(ピペットベンディング設定の詳細については図4を参照)。
         1. 配向円(5)の赤線上にキャピラリー(2)を揃え、毛管の位置を一定に保ち、曲げ部品の長さが方向円の中心(半径4.5mm)の後に常に同じになるようにします。
         2. キャピラリーの先端をベンダー(3)で押し下げてキャピラリーを45°(緑色の線)まで曲げ、フィラメント(4)を加熱して、ベンダーが取り外された後でも45°の角度を取り込むまで鍛重します。
      3. 炭素繊維(ジャン=イヴ・ル・グエンネック教授から提供)を、ステレオ顕微鏡下でガラスキャピラリーの細かい先端に収める。グリップを高め、繊維を損傷するリスクを減らすには、最後に柔らかいチューブで細かい鉗子を使用してください。
         注:これらの繊維は、繊維と細胞の間の接触面を増加させる微細構造によって特徴付けられるため、接着性^が20に改善される。
      4. 炭素繊維を2mmの長さで切り、スーパーグルー(シアノアクリル酸)を使用して毛細血管の前部に固定します。
         注: ファイバーが長くなるほど、同じ力を適用すると曲がります。
   2. 炭素繊維を調整する。
      1. 0.05 mN/Vの感度と0-0.5 mNの力範囲を用いて、炭素繊維を校正します(材料表を参照)。
         注: このセットアップは、圧縮を測定するために「プル」ではなくカスタムメイドです。
      2. マイクロマニピュレーターとピエゾモーターで制御されるホルダーに、キャピラリーを炭素繊維で取り付けます。
      3. 力センサーに接触する繊維の先端を置くが、力を生じさせることなく、センサに向かって10 μm(総移動60μm)のステップで圧電モーターを動かし、ボルトの測定電圧(E)を読み出す。
         注:力トランスデューサがカーボンファイバーの自由端の先端から接触していることを確認してください。
      4. これらの測定を3回繰り返します。
      5. 数式 1 を使用して、ピエゾ位置ごとの力を計算します (ピエゾモータステップ間の測定電圧のΔΕ差)。
         
         注:力トランスデューサの感度は、トランスデューサのモデルに依存します(ここでは0.05 mN/V = 50 μN/V)。ゲインはコントローラで設定できます。
      6. 圧電位置に対して力[μN]をプロットします。勾配は繊維剛性[μN/μm]に対応します。
   3. CMを契約する記録的な力。
      注:暗闇の中で次の実験を行います(赤色の光は、青色/緑色の光起動ツールに使用できます)。
      1. 測定チャンバーの表面をポリヘマでコーティングします。測定チャンバーを外浴液で満たし、培養細胞懸濁液を数滴チャンバーに入れる(ステップ4.9)。
      2. ステージマイクロマニピュレータに炭素繊維を使用した毛細血管を取り付けます。短い緑色光パルスの適用により収縮を誘導する能力をチェックして、GTACR1発現CMを選択します。炭素繊維を測定室の表面に近い水平に位置合わせします。
      3. 最初の繊維を細胞表面に下げます。CMのもう一方の端にある第 1 のファイバに 2 番目のファイバを平行に接続します。理想的な位置合わせは、セル軸に対して垂直に近い位置にあります。
         メモ:セルを底面に軽く押して、繊維を取り付けます。2番目の繊維を取り付ける前に圧力を解放します。第2繊維を取り付けてセルを伸ばさないで下さい。
      4. 両方の繊維がセルに取り付けられた後、繊維を持ち上げるので、セルはもはやチャンバー表面に接触せず、摩擦なしで収縮することができます。
      5. サルコメアをデータ収集ソフトウェア(材料表を参照)に焦点を当て、繊維間のサルコメア長さの追跡ウィンドウ(図7A I(3)))を設定します。
         注: 結果として得られる FFT パワースペクトル(図 7AI (2) )は、平均サルコメア長さを表す 1 つの鋭いピークを示す理想的な値です。
      6. エッジ検出モジュールを使用してファイバーベンディングを追跡します。検出領域を赤と緑のウィンドウで設定し、光強度トレースの第1導関数で閾値(赤と緑の水平線)を定義する(図7A III)。
      7. 0.25 Hz(可能であれば、より速いペーシングレートを試す)でセルを光学的にペースし始め、サルコメアの長さとファイバー曲げを追跡します。
         注:ファイバーホルダーの位置、LEDトリガー、電気刺激パルスは、データ取得ソフトウェアを介して制御されます(材料表を参照)。
      8. 少なくとも15の光学的に引き出された収縮を記録した後、細胞を電気的に電界刺激する(材料表を参照)。1.5倍のしきい値電圧を印加することで、収縮を引き出して記録するしきい値を見つけます。
      9. 阻害プロトコルの場合、収縮を引き出すために電気刺激を適用し、64 sの持続光(様々な光強度で)に露出する。

図4:ピペットのベンディング設定。(1) 左側のマイクロマニピュレーターを使用して毛細血管の位置を制御し、右側の 2 つ目のマイクロマニピュレータを使用して、キャピラリーを曲げる。(2) 毛細血管。(3)ベンダー。(4) マイクロフォージ。(5) オリエンテーションサークル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:炭素繊維を用いたピペットこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

6. データ分析

1. パッチクランプ録音
   メモ:実験後の液体接合の電位に関して、記録されたすべての電圧とコマンド電圧を修正します。ツールジャンクション電卓(表4:21°Cで14.4 mV)に記載されているパッチクランプソリューションの場合)を使用して、データ取得ソフトウェアの液体ジャンクション電位を特定します。記録された/コマンド電圧から液体接合電位を引きます。
   1. I-クランプ AP の記録の場合は、電気ペーシングと光ペーシングを確認します。カスタムスクリプト(補足資料)を使用して、APの持続時間(APD)を20%および90%の再分極で計算します。安静時膜電位とAP振幅を決定します。
      注: ApD を確認する:Wang K. ら²¹ .abf ファイルを読み込むスクリプトは、一般的に次のリンクhttps://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfloadを介してアクセスできます。6 AP 以上の平均 APD 値。
   2. Vクランプの光の活性化のために、ベースラインが0 pAにあるかどうか確認して下さい。ベースラインをゼロに調整しない場合。-74 mVで300 msの光パルスによってトリガされた記録電流を解析します。データをデータ分析ソフトウェアに転送し、ピーク時と平均定常電流を決定します。
2. 炭素繊維実験
   1. 光ペーシング中の収縮記録: 記録されたデータをデータ取得ソフトウェアにロードし、炭素繊維の曲げとサルコメアの長さの変化のベースラインと最大を読み出します。
      メモ:安定した記録の10収縮の平均値。
   2. セル幅を測定し、楕円断面を仮定してセルの断面積を計算する(図7BII)。
      注: 楕円の面積の式は A = π·a·b (式 2) で、a は中心から頂点までの距離、b は中心から共頂点までの距離です。この場合、a = (セルの幅)/2 と b = (セルの厚さ)/2 を意味します。西村らの²²によれば、CMの厚みは細胞幅の3分の1と推定され、A=π·(1/2)・幅・(1/2)・厚み=π·(1/4)・幅・(1/3)・幅=π·(1/12)・幅^2.
   3. 終収縮力(F)を計算します。
      
   4. 終シストリックセル変形(ESD)を計算します。
      
      注:さらに収縮パラメータを分析することができます:安静時サルコメアの長さ、ピークまでの時間、90%緩和までの時間、分数サルコメアの短縮、収縮および緩和の最大速度(ソフトウェア取得マニュアルを参照)。

結果

GtACR1-eGFPは培養ウサギCM(図6挿入)で発現し、パッチクランプ技術で光電流を測定した。GtACR1の光活性化は、-74 mVでの大きな内向きの電流を示しています。図6では、4 mW/mm² のピーク電流(I_P)は245 pAである。APは、電気的に(図6B)または光学的に(図6C)電流注入をしきい値の1.5倍、または短い脱分極光パルスをそれぞれ10ミリ秒でトリガした。APD値を分析すると、電気的にペースが速いCMは、0.24±0.08 sのAPD 20と0.75±0.17sのAPD 90を示し、 光学ペースのCMは0.31 ±0.08 sのAPD 20および0.81 ±0.19 sのAPD 90を示すのに対し(SE,n = 5,N = 2,ここで提示した例APD 20_電気=0.17 s;APD 20_{光 =} 0.27 s および APD 90_{電気 =} 0.61 s;APD 90_{光 =} 0.68 s;図 6D)。光ペースのCMは遅いAPの発症を示す(図6D)。CM活性化は、塩化物の反転電位に向けて膜電位を偏光させることにより、持続型照明(64s、4 mW/mm2)で阻害された、ここで-58 mV(図6E)。しきい値の 1.5 倍より高い電流注入は AP 生成を引き起こさない(図 6F)。発生したピーク力は、炭素繊維の曲げから求めた(図7B,C,E)。CMは、電気ペーシング時に232 μN/mm²を生成し(図7B)、261 μN/mm²を光ペーシングに続く(図7C)。長時間の緑色光パルスは収縮を阻害する(図7E)。64sの光学的阻害に続いて、再発収縮は収縮力を低下させ、かつ、ウサギCMからの拡張期カルシウム損失に合わせて、収縮(0.25Hzでのペース、図7D)を10度後に力値がベースラインに回復する。

図6:電気および光学的にペース/阻害されたCMの代表的なパッチクランプ記録。(A)300 ms、4 mW/mm²の光パルスを使用して-74 mVで代表的な光電流。I_Pはピーク電流を示す。挿入物はGtACR1-eGFP陽性の細胞を示す。(B)10msの電流ランプを使用して0pAでの代表的AP記録、CMを電気的にペースする0.6 nA(C)10ms、0.4 mW/mm2の光パルスを用いて0pAでの代表的AP記録。(D)上グラフは、電気(青)と光学的(緑色)活性化CMの10^番目のAPのオーバーレイを示しています。下のグラフは、光学的および電気的にトリガされるAP(E_光-E電気)との膜電位差を示す。(E) 電気的にトリガされた AP は、64 s,4 mW/mm²の持続光下で阻害された。APは、持続光下での閾値の1.5倍(0.1 nAから2.2 nAのステップで0.7 nAから)より高い電流注入によって阻害される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:光および電気的にペース/阻害されたCMの炭素繊維記録からの代表的なデータ。(A) データ収集ソフトウェアに表示されます。画像(I)は、サルコメア長さを算出するための窓を有する測定されたCMを示す。セルの幅はオレンジ色で表示されます。(1) 関連する周波数の範囲。(2)FFTパワースペクトルは、セル上のサルコメア間隔の周波数を示す。平均サルコメア長さはピーク周波数から計算されます。(3)サルコメアの長さの追跡ウィンドウ。(4) 強度トレース。(5) ハミングウィンドウを掛けた強度トレースは、ウィンドウの強度トレースです。スキーム(II)は、セルの楕円断面を示す。オレンジ色の幅と、青の破線で太い。画像(III)は、それぞれの検出ボックスを有する炭素繊維の位置を示し、緑色で赤色、右に左に表示する。(6) 強度トレース。(7) 強度トレースの第1の導出物(データ取得ソフトウェアマニュアル参照)。(B)電気的に引き出された収縮の代表的な痕跡。パネル(I)は、サルコメア長短さを示し、パネル(II)は2つの炭素繊維間の距離を示す。(C) 光学的に引き出された収縮の代表的なトレース (525 nm, 0.25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm²).パネル(I)は、サルコメア長短さを示し、パネル(II)は2つの炭素繊維間の距離を示す。(D) AP生成の阻害によって生じた一時停止後の収縮1から11までのピーク力を発生させる。(E) 持続的な照明下での収縮の光学的阻害の代表的な痕跡 (525 nm, 64 s, 6 mW/mm²)。パネル(I)は、2つの炭素繊維間の長さのサルコメア長短さ、パネル(II)を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

A	領域
Acr	アニオンチャネルロドプシン
Ap	行動の可能性
Apd	アクションの潜在的な期間
Cfu	コロニー形成ユニット
Chr	チャネルロドプシン
Cm	心筋細胞
eGFP	強化された緑色蛍光タンパク質
Esd	エンドシストリックセル変形
Eu	内毒素単位
F	力
Fft	高速フーリエ変換
GtACR	ギラルディア・シータアニオン・チャネルロドプシン
Gui	グラフィカル ユーザー インターフェイス
Iクランプ	電流クランプ
Iu	国際単位
Moi	感染の多重度
ポリヘマ	ポリ(2-ヒドロキジエチルメタクリレート)
Vクランプ	電圧クランプ

表5:略語の一覧。

補足図1:光パワーメータによる光強度測定(A)4 mW/mm2で10ミリ秒の光パルスを測定する。(B)4 mW/mm2で64sの持続型照明の測定この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図2:分離したばかりのCMの特性と、培養におけるそれらの構造適応(A)新たに分離された CM の AP 記録(APD 20 の 1.11 ± 0.34 s、APD 90 の 1.96 ± 0.32 s、n = 7、N = 2)。平均安静膜電位は-79.3±0.8mV(n=7、N=2)です。(B)電気的にペースを合たたして分離されたCMの炭素繊維記録。平均ピーク力は205±78μN/mm2(n = 7、N=2)。(C) 新たに分離された CM の共焦点画像 (I);培養後48時間後に未伝達(II)および(III)CMをトランスフェクトした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足材料:MATLabスクリプトは、APDと安静時膜電位を決定します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

光遺伝学的ツールは非侵襲的な方法で興奮性細胞電気生理学の変調を可能にするのに対し、それらは特定の実験計画のための最良の利用できるツールを選び出すことを可能にする異なった細胞タイプ(例えば、CM)での徹底的な特徴付けを必要とする。パッチクランプ技術は細胞の電気生理学を評価するための標準的な方法である。全細胞構成では、光刺激/阻害後の細胞膜全体の光活性化電流または膜電圧の時間的変化を記録することができます。電気励起の光遺伝学的操作もCM収縮に影響を与える。サルコメア追跡と炭素繊維支援力測定を用いて、光の問い合わせが筋細胞の機械的活動に及ぼす影響を定量化します。

光ゲートクロリドチャネルGtACR1の基本効果をCMで特徴付けるプロトコルについて説明する。モデルシステムとして、我々は、その電気生理学的特性(例えば、AP形状および耐火期間)がげっ歯類CMよりもヒトCMで観察されるものに類似しているウサギCMを選んだ。さらに、ウサギCMは、腺ウイルスの送達およびGtACR1-eGFPの発現に十分な長さの数日間培養することができる。特に、分離されたCMは、細胞終末の丸めおよび交差線の緩やかな喪失、T管状システムおよびカヴェノラ^23、24を含む、培養におけるそれらの構造的特性を経て変化させる。これに伴い、培養されたCMでは、静置膜電位の脱分極、APの延長、細胞^Ca2+処理の変化など、機能的変化が報告されている。培養における細胞適応のレビューについては、Louchらの²⁵を参照してください。補足図2は、培養されたCMで観察されたものと比較するための、新たに分離されたCMの例示的なAPおよび収縮測定を示す(図6、図7)ここで提示されたプロトコルを用いた。

全細胞パッチクランプ記録により、光電流特性(振幅や運動論など)や高い時間分解能での膜電位やAP特性の光誘起変化を直接測定できます。しかし、このような記録にはいくつかの制限があります:まず、細胞質は全細胞記録においてピペット溶液に置き換えられ、イオン電気化学的勾配を制御するのに有利であるが、細胞小器官、タンパク質および他の化合物を洗浄する本質的な欠点を有し、細胞の電気応答に影響を与える可能性がある。第二に、非生理学的に長い脱分極(例えば、光ゲートイオンチャネルの遅い時間定数)に起因する追加のイオンチャネルの活性化のような副作用は、我々の方法がAPDの変化を検出することしかできないが、電気生理学的に関連する細胞コンパートメントにおけるイオン濃度の直接測定を行わないので評価することは困難である。これは蛍光インジケーター(例えば、Ca²⁺センサー)またはイオン選択電極で行うことができる。さらなる特徴付けには、光強度滴定、pH依存性の決定、異なる膜電位での光電流運動論、および反復光刺激時の回復運動薬が含まれ得る。

パッチクランプ記録とは対照的に、単細胞力測定は、細胞内ミリューに影響を与えることなく、無傷の筋細胞の細胞収縮の分析を可能にする。イオン濃度に対する二次的効果(例えば^、Ca2+)は、生成された力振幅およびダイナミクス(例えば、収縮および弛緩の最大速度;ここでは分析されない)を決定することによって間接的に評価することができる。炭素繊維技術による力測定は、プリロードされた細胞(すなわち、インシチュまたはインビボ設定と類似した条件)において受動的および活動的な力に関する直接的な情報を提供するので、自由収縮細胞よりも有利である。機械的プリローディングは、ストレッチが力の生産とリラクゼーション^26、27に影響を与える細胞収縮性を分析する際に特^に重要です。

光遺伝学的アプローチは、単一CMおよび無傷の心臓組織の両方で、細胞膜電位の空間的に正確な操作を可能にする。古典的に、ChR2は、光ゲート陽イオン非選択的チャネルであり、膜電位の脱分極に使用されてきたのに対し、光駆動プロトンおよび/または塩化ポンプは膜過分極に使用された。光遺伝学的アクチュエータの両方のグループは、ChR2が本質的に低い単一チャネル伝導度²⁸と光駆動ポンプが吸収光子あたり1イオンを最大輸送することを特徴とするので、高い発現レベルを必要とする。さらに、CMにおけるChR2の長時間の活性化は^、Na+および/または^Ca2+過負荷を引き起こし、光駆動ポンプはトランスサルコレム^H+または^Cl-勾配^29、30を変化させる可能性がある。CM活性の光遺伝学的制御のための代替ツールを探すに、我々は最近、ChR2のようなカチオンChRと比較して優れた単一チャネル伝導度および高い光感度を特徴とする自然アニオンチャネルロドプシンGtACR1を試験した。GtACR1活性化はCMを脱分極し、光パルスのタイミングと持続時間に応じて光ペーシングおよび阻害に使用できることを発見した。カチオンChRの代わりにACRを使用する追加の利点は、Clのより負の反転電位である可能性があります^- Na⁺と比較して、人工的に導入されたイオン電流を減少させる。既に示したように、GtACR1による光ペーシングは、GtACR1チャネル閉鎖の遅い成分の結果としてAP延長を招く可能性があり、これはより速いGtACR1変異体¹⁹を用いて克服できる。しかし、低い、より生理的な細胞内^Cl-濃度を使用する場合、AP延長ははるかに顕著ではない(図6を参照)。さらに、長い照明によるGtACR1媒介阻害は深い膜脱分極をもたらし、二次^Na+および^Ca2+流入を再び活性化させ、それによって電圧ゲートチャネルの活性を変化させる。我々の測定では、APおよび収縮パラメータは、1分間の光誘発阻害後に40s以内のベースラインに回復することを発見した(Kopton et al. 2018,図6,図7を参照)。ライトゲート^K+チャネルは、CMの静止膜電位³¹に影響を与えることなくCMをサイレンシングするための強力な代替手段を提供する。

今後は、さまざまな光遺伝学的ツールを定量的に比較して、心臓活動を阻害する可能性を比較したいと考えています。このため、ACR、ChR2および赤シフトChRバリアント³²を含む様々な光ゲートイオンチャネル、ならびにハロロドプシンまたはライトゲート付きアデニルシクラーゼbPACなどの超分極アクチュエータをカリウムチャネルSthK(PAC-K)31と組み合わせて試験する。

ここで提示されるプロトコルはCMの電気機械特性の詳細な特徴付けのために使用することができる。これは主に他の種からのCMにも適用可能であり、疾患を持つ心筋から分離されたCMにも適用される。光刺激はCMを異なる周波数でペースを上げることができ、炭素繊維収縮実験の間に異なるプリロードをテストすることができる。興味深い実験は、疾患進行中の心臓組織リモデリングの開発中に観察されるように、静止膜電位の徐々に増加を模倣するために、閾値下偏光のための低強度照明を使用することである。最後に、機能的測定をCa²⁺イメージングと組み合わせて、励起収縮結合に関するさらなる洞察を得たり、薬理学的介入を行ってCM活性に対する異なる薬物の影響を評価したりすることが可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
機器 - 細胞単離/培養/形質導入
Adeno-X アデノウイルスシステム 3 CMV	TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
大動脈カニューレ	Radnoti		4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L
mm カバースリップ & オスラッシュ; 16 mm, Thickness No. 0	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0151	ホウケイ酸ガラス
グリフィンシルク、ブラック、長さ2 m、サイズ3、0.5 mm	Samuel Findings、ロンドン、英国	TSGBL3
インキュベーター	ニューブランズウィック州、エッペンドルフ、Schöネンブーフ、スイス	ギャラクシー170S
Langendorff-perfusion set-up	Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei、フライブルク、ドイツ		カスタムメイド
のランゲンドルフポンプ	Ismatec、Labortechnik-Analytik、Glattbrugg-Züリッチ、スイス	ISM444
メッシュ:ナイロンモノデュール濾布	Cadisch Precision Meshes Ltd		800 & マイクロ;m holes, 1 m wide
Neubauer chamber	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	717806
Rabbit, New Zealand White	Charles River	Strain Code: 052
Scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BC774R	Bauchdeckenschere ger. 18cm
滅菌フィルター, 0.22 & micro;m	Merck, Darmstadt, Germany	SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier	AxonInstruments, Union City, CA, United States	Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0178	ホウケイ酸ガラス
デジタイザー Axon Digidata	Molecular Devices, San José, CA, United States	1550A
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878	BZ:00
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Headstage	AxonInstruments, Union City, CA, United States	CV203BU
Interface	Scientifica,英国アックフィールド	1U ラック、352036
LED 525 nm	Luminus Devices、カリフォルニア州サニーベール、米国	PT-120-G
LED制御ソフトウェア	Essel Research and Development、トロント、カナダ
LED制御システム	カスタムメイド
のマイクロピペットプーラー	成重株式会社、東京、日本	PP-830
反転	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
Motorised Micromanipulator	Scientifica, Uckfield, UK	PatchStar
Optical power meter	Thorlabs, Newton, NJ, United States	PM100D
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Silver wire	A-M Systems, Sequim, WA, United States	787500	シルバー、裸 0.015インチ、コーティング 0.0190インチ、長さ 25 フィート
ソーダ石灰ガラス キャピラリー	Vitrex Medical A/S、Vasekaer、デンマーク	160213 BRIS、ISO12772	1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp	Molecular Devices、San José、CA、United States	バージョン 10.5
ソフトウェア MatLab2017	The MathWorks, Inc.
ステージマイクロメーター	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Equipment - Carbon fibers
Carbon fibers	provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec		BZ:00
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States	1550B
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878 Filter
(630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Fluorescence System Interface	IonOptix, Milton, MA United States	FSI-800	2.0 OD x 1.16 ID x 100 L
mm Force Transducer System	Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada	406A
力用ガラス毛細管測定	ハーバード・デバイス、マサチューセッツ州ホリストン、米国	GC200F-10
インターフェース ナショナルインスツルメンツ	ナショナルインスツルメンツ、ブダペスト、ハンガリー	BNC-2110
LED 525 nm	ルミナスデバイス、カリフォルニア州サニーベール、米国	PT-120-G
LEDコントロールボックス	エッセル研究開発、トロント、カナダ
LEDコントロールシステム	カスタムメイド
	Microcontroller Parallax Inc., Rocklin, California, United States	Propeller
Micropipette Puller	Narishige Co., Tokyo, Japan	PC-10
Microscope inverted	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
MyoCam-S camera	IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S カメラ Power	IonOptix, Milton, MA, United States	MCS-100
MyoPacer Field Stimulator	IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States	MYP100
Piezo Motor	Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	E-501.00
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Software Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, United States	Version 10.5
Software IonWizard	IonOptix, Dublin, Ireland	Version 6.6.10.125
Software MatLab2017	The MathWorks, Inc.
ステージマイクロメーター	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Chemicals
Adenosine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A9251-100G
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A7030-50G
CaCl2	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA	21114-1L
L-カルニチン塩酸塩	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C9500-25G
コラゲナーゼ2型, 315 U/mg	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS004177
Creatine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C0780-50G
Cytosine-β-D-アラビノフラノシド	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C1768-100MG
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	3054.3
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL	Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany	PZN-07829486
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	F9665
ゲンタマイシン 50 mg/mL	Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA	15750-037
Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	G7021-1KG
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL	Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	PZN-03029843
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	H3375-1KG
インスリン (ウシ膵臓)	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	I6634-50MG
K-アスパラギン酸	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	A6558-25G
KCl	VWR International GmbH、ルーヴェン、ベルギー	26764.260	1 mg/mL
KOH	Honeywell Fluka、マスキーゴン、ミシガン州、米国	35113-1L
Engelbreth-Holm-Swarm マウス肉腫のラミニン基底膜	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	L2020-1MG
M199-Medium	Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States	M4530
Mg-ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A9187-1G
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	63069-500ML
NaCl	Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK	10428420
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lö歌われる 0.9%	ブラウン メルズンゲン AG、メルスンゲン、ドイツ	3200950
NaOH	AppliChem GmbH、ダルムシュタット、ドイツ	A6579	Ca2+/Mg2+
>Na-pyruvat	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズー	P2256-100MG
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国	D1408-500ML
ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)	Sigma、プール、英国	192066
Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ	P5147-1G
Taurine	Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国	T0625-500G
Thiopental Inresa 0.5 g	Inresa Arzneimittel GmbH、フライブルク、ドイツ	PZN-11852249
塩酸キシラジン、Rompun 2%	Bayer Vital GmbH、レバークーゼン、ドイツ	PZN-01320422