方法論記事

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

DOI：

10.3791/60548

⸱

2020年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。

要約

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ニューロンは、その機能をサポートするために高エネルギーのための強い要求を持っています。.軸索に沿ったミトコンドリアの輸送がヒトのニューロンで観察され、様々な疾患状態で神経変性に寄与する可能性がある。生きている人間の神経におけるミトコンドリアのダイナミクスを調べることは困難であるが、そのようなパラダイムは神経変性におけるミトコンドリアの役割を研究するために重要である。ここで説明する、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する前脳神経軸索におけるミトコンドリア輸送およびミトコンドリア形態を解析するためのプロトコルである。iPSCは、確立された方法を使用して、テレンスファリックグルタミン酸作動性ニューロンに分化される。ニューロンのミトコンドリアはMitoTracker CMXRosで染色され、軸索内のミトコンドリア運動は細胞培養用インキュベーターを備えた生細胞イメージング顕微鏡を用いて捕捉される。タイムラプス画像は、「マルチキモグラフ」、「バイオフォーマットインポーター」、「マクロ」プラグインを使用してソフトウェアを使用して分析されます。ミトコンドリア輸送のカイモグラフが生成され、前向きおよび逆行方向における平均ミトコンドリア速度がキモグラフから読み取られる。ミトコンドリア形態解析に関しては、ミトコンドリアの長さ、面積、およびアスペクト比がImageJを用いて得られます。要約すると、このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとそれらの形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。

概要

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ミトコンドリアの運動性と分布は、偏光ニューロンにおける可変および特殊なエネルギッシュな要求を満たす上で重要な役割を果たします。ニューロンは、Ca2+バッファリングとイオン電流に高レベルのエネルギーを必要とするシナプスの形成を通じてターゲットと接続するために非常に長い軸索を拡張することができます。ソマから軸索へのミトコンドリアの輸送は、ニューロンの軸索およびシナプス機能をサポートするために重要です。空間的および時間的に動的なミトコンドリア運動は、毎秒数マイクロメートルの速度で速い軸索輸送によって1.

具体的には、キネシンやダイネインなどのモーターまたはアダプタータンパク質は、ミトコンドリア2,3の動きを制御するために微小管に沿って速いオルガネラ輸送に関与する。正常な神経活動は、新たに組み立てられたミトコンドリアを神経細胞の体から遠位軸(前向き軸索輸送)に適切に輸送し、遠位軸から細胞体に戻ってミトコンドリアを逆輸送する必要があります。.最近の研究では、不適切なミトコンドリアの割り当てが神経細胞欠損および運動ニューロン変性疾患4、5と強く関連することが示されている。したがって、神経変性におけるミトコンドリアの役割を解剖するためには、生きた培養における軸索に沿ったミトコンドリアの動きを調べる方法を確立することが重要である。

ミトコンドリアの追跡を調べて分析する際には、(1)すべてのフレームの背景からミトコンドリアを特定すること、(2)すべてのフレーム間の接続を分析して生成するという2つの主な課題があります。第1の課題を解決する際に、ミトトラッカー色素や蛍光融合ミトコンドリアターゲティングタンパク質(例えば、mito-GFP)6,7,8などのミトコンドリアを背景から区別するために蛍光標識アプローチが広く用いられている。フレーム間の関連性を分析するために、いくつかのアルゴリズムとソフトウェアツールが、以前の研究9で説明されました。最近の論文では、研究者は4つの異なる自動化ツール(例えば、Volocity、イマリス、wrMTrck、および差トラッカー)をミトコンドリア輸送を定量化するために比較しました。その結果、トラック長、ミトコンドリア変位、運動継続時間、および速度の不一致にもかかわらず、これらの自動化ツールは、処理10後の輸送差を評価するのに適していることを示した。これらのツールに加えて、ImageJ用の統合プラグイン「マクロ」(リートドルフとザイツによって書かれた)は、ミトコンドリア輸送11の分析に広く使用されています。この方法は、前向きと逆行方向の両方の速度を含むミトコンドリアの動きを分析するために使用できるキモグラフを生成します。

ミトコンドリアは、生理学的および病理学的状態の両方に応答して、数と形態の絶えず変化する非常にダイナミックなオルガネラです。ミトコンドリアの核分裂と融合は、ミトコンドリアの形態とホメオスタシスをしっかりと調節します。ミトコンドリア核分裂と融合の不均衡は、ミトコンドリアの機能を損ない、神経活動や神経変性の異常をもたらす可能性がある、非常に短いまたは長いミトコンドリアネットワークを誘導することができます。ミトコンドリアの輸送や形態の障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、遺伝性痙攣対麻痺(HSP)12、13、14、15などの様々な神経変性疾患に関与している。HSPは、下肢筋16、17を制御するコルチコ脊柱およびそれに続く障害の変性を特徴とする遺伝性神経障害の異種群である。本研究では、iPSC由来前脳ニューロンを用いて、HSPにおけるミトコンドリアの輸送および形態を評価する。この方法は、生きた培養における神経軸索のミトコンドリアダイナミクスを調べるためのユニークなパラダイムを提供する。

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プロトコル

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1. iPSCからのテランサレンスグルタミン酸作動性ニューロンの生成

注: iPSCを維持するための詳細なプロトコルと、それらの分化を脳細胞のグルタミン酸作動性ニューロンに分ける方法は、前述の18と同様です。ここで、ヒト多能性幹細胞の分化中の重要なプロセスが導入され、強調表示される。

  1. ヒト胚性幹細胞(hESC)培地中のマウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー上の培養iPSCは、線維芽細胞増殖因子(bFGF、4 ng/mL)を補充した。
  2. ディスパーゼ(1 mg/mL)を3分間インキュベートした後、iPSCを小さな塊に解き分けます。次いで、hESC培地中でiPSC凝集体を4日間培養した。このタイムポイントを参照し、iPSCがサスペンション文化として開始される際、1日目(D1)として参照してください。4日間、毎日媒体を変更します。
  3. D5では、2分間200xgで遠心分離後のiPSC凝集体を収集し、神経誘導培地(NIM)で3日間培養する。細胞を2日ごとに培地の半分を交換して3日間懸濁液中で培養する。DMH-1 (2 μM) および SB431542 (2 μM) を NIM 培地に追加して、ニューラル誘導効率を高めます。
  4. D8では、200 x gで2分間遠心分離した後にiPSC凝集体を集め、10%FBS(またはラミニンコートプレート)でNIMで培養することで、6つのウェルプレート(プレートあたり約20〜30の凝集体)に付着させます。翌日に古いメディアを取り外し、D17 まで 2 日ごとに NIM に変更します。
    注:ロゼット構造を有する柱状細胞の形成によって示される神経上皮細胞の生成は、この期間に観察される。
  5. D17では、コロニーの中心にある神経上皮細胞を機械的に分離(コロニーの中心に小さな圧力を加えて直接持ち上げる)または酵素的に(ディスパーゼで処理する)。B27(1x)、cAMP(1μM)、およびIGF(10ng/mL)を加えて8 mLのNIMを含む非処理組織培養T25フラスコに、単離された神経上皮細胞を移管する。
    注:懸濁液培養は細胞が皮質投影神経前駆体で富化された神経球を形成することを可能にする。
  6. D35の後、ポリオルニチンおよびLDEVフリーの減成長因子基底膜マトリックス(材料表)コーティングされた35mmガラス底底の皿に神経球をプレートし、テレンスファールグルタマテジキシーニューロン(皮質投影ニューロン)を生成する。めっき前に、37°Cで1mg/mL細胞剥離溶液を2分間インキュベートすることにより、神経球を小さなクラスターに解離します。
  7. 遠心分離により細胞剥離液を除去し、1 mLの神経分化培地(NDM)で再懸濁する。ガラス底の皿のプレートセル(1皿あたり100μLの媒体で約5つのクラスター)を取り付けます。次に、NDM(1皿あたり1mL)を加え、B27(1x)、cAMP(1μM)、IGF(10ng/mL)、hBDNF(10 ng/mL)、およびGDNF(10ng/mL)を含むNDMで細胞を培養する。
    注:小さなクラスターは、彼らがよく生き残り、長い投影ニューロンを生じさせるので、メッキされています。あるいは、細胞を解離し、より良い分離のために1皿あたり約20,000個の細胞の密度でメッキすることができます。
  8. Tbr1およびβIII-チューブリンマーカーを免疫染色することにより、テレンスファリックグルタミン酸作動性ニューロンを特徴付ける。

2. テレンセファリックグルタミン酸作動性ニューロンの軸索に沿ったミトコンドリア輸送の検討

  1. NDMを温め、37°Cおよび5%CO2に設定された蛍光顕微鏡用インキュベーターをオンにします。
  2. 前脳ニューロンの軸索に沿ったミトコンドリアを可視化するには、50 nM赤蛍光色素を有するニューロンをインキュベートし、生細胞中のミトコンドリア(例えば、MitoTracker CMXRos)をNDMで37°Cで3分間染色する。次に、温めたNDMで細胞2xを洗浄する。ニューロンはNDMでインキュベートされる。
  3. 軸索に沿ったミトコンドリア輸送を記録するために、蛍光顕微鏡で40倍の目的を用いてミトコンドリア運動のタイムラプス画像を撮ります。
    注:培養を安定化するために、ミトコンドリア染色後20分間インキュベーターで細胞をインキュベートした場合に、生細胞イメージングを行います。
  4. 位相場では、形態学的特性に基づいて軸索を特定します(神経細胞の体から直接出現し、分岐のない一定の細い長い神経突起)。ミトコンドリアは、前向き(細胞体から遠位軸へ)および逆行方向(軸索末端から細胞体まで)で移動します。軸索に沿ったミトコンドリア運動の方向を区別するために、ニューロンの細胞体を明確に識別する。このステップでは、位相場の下に軸索を焦点を合わせ、フォトブリーチングを減らします。
  5. 細胞体と軸索を区別した後、軸索中のミトコンドリアの露光時間と焦点を調整します。その後、5分の総持続時間のために5sごとに軸索内のミトコンドリアの輸送をキャプチャし、60フレームを生み出す。各ディッシュに対して少なくとも5つの場所をランダムにキャプチャし、各グループに対して3倍繰り返します。

3. 皮質ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態のデータ解析

注: 画像解析ソフトウェア (ImageJ または MetaMorph19など) を使用して、ミトコンドリア転送に関する収集データを分析します。ImageJ は簡単に入手できるので、ImageJ を使用してミトコンドリアの輸送および形態の解析をマルチキモグラフ、マクロ、および粒子の分析プラグインで実行します。

  1. ImageJ を使用したミトコンドリア転送の分析
    1. ミトコンドリア運動のタイムラプス画像を撮影した後、MultiKymographプラグインを使用してミトコンドリアの速度と動きを分析します。画像は.tiff形式のファイルとして保存され、以前に報告された方法20に従ってフィジーのソフトウェアによって分析されます。
    2. フィジーソフトウェアをダウンロードします。キモグラフからミトコンドリア移動速度を分析するために必要なプラグインをダウンロードしてください。これらの4つのクラスプラグインと一緒にバイオフォーマットパッケージとキモグラフプラグインをダウンロードしてください:複数Kymograph.class、複数オーバーレイクラス、スタックディファレンスクラス、およびWalkingAverage.class (マテリアルのテーブル) を含みます。これらのファイルをフィジープラグインフォルダに移動します。プラグインフォルダに"tsp050706.txt"プラグインをダウンロードします。ファイルが plugins フォルダに移動されたら、フィジーソフトウェアを再起動します。
    3. フィジーのソフトウェアを開きます。プラグインを選択し、バイオフォーマットの下のバイオフォーマットインポーターを通して.tiffシリーズの画像をインポートします。[スタック表示で標準 ImageJ]を選択し、[すべてのシリーズを開く] を選択して、[自動スケール] をオンにし、[OK]をクリックします。画像の上部に表示されるピクセル単位のフレーム番号とサイズをメモしておきます。
      メモ:1画像あたり60フレームを取ります。
    4. 60 フレームすべてについて、[イメージ] メニューの明るさ/コントラストを調整して、画像をより鮮明にすることを検討してください。
    5. 線ツールを右クリックしてセグメント化された線を選択し、セルのボディから始まり、終端の軸索で終わるセグメント化された線を描画します。プラグインの下でマルチプレタキルモグラフを選択して、キモグラフを生成します。ライン幅の選択は、マルチキモグラフを選択した後にプロンプト表示されます。これが奇数であることを確認してください。線幅として1を選択します。このステップの後に、キモグラフが生成されます。
      注:いくつかの重要な情報は、キモグラフから読み取ることができます。kymographのY軸は、60フレームの持続時間(5分)です。x 軸は、選択した軸索の位置を表します。
    6. キモグラフの斜線を使用して、ミトコンドリアの移動方向(前向き、逆行性、安定値)を決定します。たとえば、Y 軸に沿って右に下がった線は前向きの移動を示し、y 軸に沿って左に下がった線は逆行の動きを示します。垂直線は、ミトコンドリアに動きが見られなかったことを示します。
    7. フィジーソフトウェアのMacrosプラグインを使用して、移動するミトコンドリアの距離、時間値、速度を測定します。プラグイン | マクロ |インストール |tsp050607.txt. キモグラフ上のミトコンドリア運動の痕跡の上にセグメント化された線を描画し、常に上位から下位領域(Y軸)に線を引きます。
    8. 線を描いた後、プラグイン |マクロ |小さじから速度を読み取る。トレースに沿ったセグメント化された線が描画されるため、プラグインは線に対応するセグメント化された速度を読み取ります。
      注: すべてのデータの単位はピクセルです。dy sumは開始点から消費される時間で、dx sumは x 軸で移動するミトコンドリアの距離を示します。dy とdx は、各セグメントの期間時間と移動距離をそれぞれ示すようになりました。実際の速度は、すべてのセグメントの速度を示しています(dx now/dy今)。平均速度はミトコンドリア移動の平均速度を示します(dx和/dy sum)。
    9. dxの単位をピクセルからμmに変更し、ピクセル(μm)の比率をμm単位でスケールバーで測定します。画像のスケールバーを測定することで、ピクセルからμmまでの距離の単位を変換します。線ツールを使用して縮尺バーに沿って線を描画し、[分析]の [メジャー] を選択して線の長さを測定します。この実験では、時間をピクセルから秒に変更します(1 ピクセル = 5 秒)。
    10. スプレッドシート ファイルで、平均速度を計算し、それに応じて逆行または前向きの移動にラベルを付けます。前向きまたは逆行移動速度の平均値。
    11. キモグラフから静止および運動性ミトコンドリアの割合を決定します。前向きまたは逆行性の移動ミトコンドリアは、全期間21の間に原点から5μm前後移動すると定義される。ミトコンドリアは、5分の間に5μm以上動かなかった場合、静止していると考えられます。
  2. ImageJを用いたミトコンドリア形態の解析
    注: ImageJ を使用してミトコンドリアの長さ、面積、およびアスペクト比を測定して、ミトコンドリアの形態を決定します。これを行うには、次の手順に従います。
    1. 軸索内のミトコンドリアの長さと面積を分析するために、ImageJウェブサイトからStraighten_.jarプラグインをダウンロードし(資料の一覧を参照)、プラグインのフォルダに移動します。ImageJ ソフトウェアを再起動します。
    2. [ファイル] の下の[開く] 関数を通じて画像を開き、[イメージ] の下の[種類] を使用して 32 ビットのイメージを 8 ビットに変換します。
    3. 軸索に沿ってセグメント化された線を描画します。[プラグイン] の下で[ストレート]を選択し、[フィラメントの幅/ワイドライン] に 50 ピクセルを設定します。これにより、まっすぐな軸索が生成されます。
    4. [画像] の下のしきい値を調整し、[領域] を選択して[分析] で測定を設定します。境界 |楕円をフィットする |シェイプ記述子:
    5. ライン関数を使用して縮尺バーを測定し、[ピクセルで距離を入力して分析する] でスケールを設定し、距離を知り、長さの単位を設定します。次に、[グローバル] を選択して、この縮尺設定を設定します。
    6. [解析]の下の[パーティクルを解析]を使用して、領域を決定します。プロンプトパラメータは、サイズ(ピクセル^2)= 0.20-無限大、円形=0.00~1.00、および表示 = 楕円です。[結果を表示]を選択します。
      注: 測定は、面積、周囲、長さ(メジャー)、幅(マイナー)、アスペクト比(AR)を含む複数のミトコンドリア形態パラメータの結果を生成します。対応するミトコンドリア番号もリストされます。
    7. ミトコンドリア数を軸長で割った値を使用して、軸索あたりのミトコンドリア数 (μm) を計算します。

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結果

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ここで、ヒトiPSCは、Tbr1およびβIIIチューブリンマーカーによる免疫染色によって特徴付けられたテレンスファリックグルタミン酸作動性ニューロンに分化した(図1A)。ミトコンドリアの軸索輸送を調べるために、これらの細胞を赤色蛍光色素で染色し、タイムラプスイメージングを行った。ImageJは容易に入手でき、入手しやすいので、ミトコンドリア輸送は、図1に示す「マルチキモグラフ」および「マクロ」ImageJプラグインを用いてさらに分析した。

ミトコンドリア運動には、静的、前向き、逆行運動を含む3つの状態があります(図1B,C)。単一のミトコンドリアは、軸索内で前向きまたは逆行方向に静的または移動することができ、ここでは、速度を決定するためにミトコンドリア運動のトラックに沿ってセグメント化された線を描いた(

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ディスカッション

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本稿では、赤蛍光色素とImageJソフトウェアを用いて神経軸索におけるミトコンドリア輸送と形態を解析する方法について説明し、いずれも神経変性疾患における軸索変性とミトコンドリア形態を研究するユニークなプラットフォームを提供する。プロトコルには、ミトコンドリアの染色、生細胞イメージング、画像の分析など、いくつかの重要なステップがあります。この方法では、ミトコンドリアを染色するために蛍光色素を用いた。ヒトiPSC由来のニューロンは皿から容易に切り離されるので、皿の中に何らかの溶液を残し、神経基底培地を穏やかに加えることを重要である。洗浄は、染料を除去するために3〜4回行うことができる。さらに、ミトコンドリアは、他のレポーターと標識して、蛍光タンパク質融合ミトコンドリアターゲティングタンパク質6のような軸索に沿った輸送を測定することができる。長期追跡では、いくつかのプローブ(すなわち、NPA−TPP、2,1,3-ベンゾチアジアゾール[BTD]蛍光誘導体、および特定のラマンプローブ)は、長期ミトコンドリア追跡およびミトコンドリアダイナミクス分析23、24、25

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開示事項

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著者らは、競合する財政的利益を宣言していない。

謝辞

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この作品は、痙性対麻痺財団、ブレイザー財団、NIH(R21NS109837)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Accutase 細胞剥離ソリューション革新的な細胞技術AT104
バイオセーフティフードThermo Scientific1300 SERIES A2
ウシ血清アルブミン (BSA)SigmaA-7906
脳由来神経栄養因子 (BDNF)Peprotech450-02
遠心分離機Thermo ScientificSorvall Legend X1R/
カバースリップChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
F12 栄養混合物 (DMEM/F12)を含む Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
線維芽細胞成長因子 2 (FGF2, bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex Serum-Free SupplementGemini400-160
Glass Bottom DishesMatTekP35G-0.170-14-C
9インチガラスピペットVWR14673-043
グリア由来神経栄養因子 (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
ヘパリンSigmaH3149
インスリン成長因子 1 (IGF1)InvitrogenM7512
ノックアウト血清代替品GibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
Non Essential Amino AcidsGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum-Free補足Gemini400-163
オリンパスの顕微鏡 IX83オリンパスIX83-ZDC2
PBSコーニング21-031-CV
位相コントラスト顕微鏡オリンパスCKX41/ IX2-SLP
6ウェルプレートコーニング353046
24ウェルプレートコーニング353047
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩(ポリオルニチン))Sigma-AldrichP3655
SB431542Stemgent04-0010
滅菌 50ml 使い捨て真空ろ過システム 0.22 μm ミリポアエクスプレス®プラスメンブレンミリポアSCGP00525
ステリカップ500/1000mlデュラポア0.22μM PVDFMilliporeSCGVU10RE
Tbr1 抗体 (1:2000)ChemiconAB9616
Trypsin inhibitorGibco17075029
50 ml tubesPhenixSS-PH50R
15 ml tubesPhenixSS-PH15R
T25 flasks (untreated)VWR10861-572
ソフトウェア用プラグイン
Bio-formats パッケージhttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/
フィジーソフトウェアhttps://fiji.sc/
Kymograph Pluginhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
75004261

参考文献

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