ここでは、96ウェルプレート形式のモリブデンブルー反応に基づく膜結合ピロホスファターゼ(サーモトガマリティマ由来)阻害剤のスクリーニング方法を提示する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
サーモトガ・マリティマ・メンブレン結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
膜結合性ピロホスファターゼ(mPPPasaas)は、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫に生じる二量体酵素です。これらのタンパク質は、ピロリン酸を2つのオルトリン酸分子に切断し、これはプロトンおよび/または膜全体をポンプで送り出すナトリウムイオンと結合される。動物やヒトには相同タンパク質が生じないため、mPPPAxは潜在的な薬物標的の設計において良好な候補となる。ここでは、96ウェルプレート系におけるモリブデンブルー反応を利用したmPPPase阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。熱性細菌サーモトガマリティマ(TmPPPase)のmPPaseをモデル酵素として使用しています。このプロトコルはシンプルで安価で、一貫性のある堅牢な結果を生み出します。アッセイの開始から吸光度測定まで約1時間しかかからない。このアッセイで生成される青色は長期間安定しているため、前のバッチの直後に後続のアッセイを行うことができ、吸光度は後ですべてのバッチに対して一度に測定することができます。このプロトコルの欠点は、手動で行われるため、疲れ果て、ピペットと時間保持の優れたスキルを必要とする可能性が高いことです。さらに、このアッセイで使用されるアルセイン酸クエン酸溶液には、有毒であり、必要な予防措置で取り扱うべきであるアルセイン酸ナトリウムが含まれています。
概要
全細胞タンパク質の約25%が膜タンパク質であり、その約60%が薬物標的1、2である。潜在的な薬物標的の1つは、膜結合ピロホスファターゼ(mPPPases)であり、ピロリン酸の加水分解によって膜全体にプロトンおよび/またはナトリウムイオンをポンプする二量体酵素である。mPPPPアーゼは、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫などの様々な生物5で見つけることができ、ヒトおよび動物4を除く。プロトイスト寄生虫では、例えば熱帯熱マラリア原虫、トキソプラズマゴンディおよびトリパノソーマ・ブルシは、寄生虫におけるこの発現のノックアウトに必須であり、外部塩基性pH7への曝露時に細胞内pHを維持する失敗につながる。脊椎動物に存在する相同タンパク質の重要性と欠如のために、mPPPPアーゼは、前駆疾患の潜在的な薬物標的として考えることができる3.
本研究におけるmPPPase阻害剤のインビトロスクリーニングは、TmPPPeモデルシステムに基づいている。TmPPPaseは、T.マリティマ由来のナトリウムイオンポンピングおよびカリウムイオン依存性mPPPaseであり、71°C8で最適な活性を有する。この酵素の利点は、例えば、生産および精製の容易さ、良好な熱安定性および高い特異的活性である。TmPPPeは、位置の完全な保存に加えて、プロティストmPPPass3、9およびヴィニャラジエタ10mPPPPPの解決構造に対する全ての触媒残基の同一性に加えて、高い類似性を示す。異なる立体構造のTmPPeの利用可能な構造は、構造ベースの薬物設計実験(仮想スクリーニングおよびde novo設計として)にも有用である。
ここでは、96ウェルプレート形式でTmPPPe阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを報告する(図1)。このプロトコルは、フィスケとSubbarow11によって最初に開発されたモリブデンブルー反応の比色法に基づいている。この方法は、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から12-ホスホモリブデン酸の形成を伴い、その後、特徴的な青色のホスホモリブデン種種12を与えるために減少する。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. タンパク質調製
注:TmPPeの発現および精製は、他の場所で13について説明されている。
- 20 mM2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)pH 6.5、3.5%(v/v)グリセロール、2mMジチオスレイトール(DTT)、および0.05%ドデシルマルトシド(DDM)を含む再活性化緩衝液の10mLを調製する。
- 200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl 2、333 mM KCl、および 67 mM NaCl を含む反応混合物の 10 mL を調製します。
注:Mg2+は、mPPPeの基質としてピロリン酸をキレートするために必要であり、K+は、TmPPPeeがカリウム依存性mPPPAeであるとして酵素活性を増加させるために必要であり、TmPPPesによるナトリウムイオン転座中の酵素活性にはNa+が必要である。 - 酵素再活性化のために30 mg/mLリポソームを調製する。
- 大豆から20 mMトリスHCl pH 8.0の10 mLに1mMのトリス-HCl pH 8.0を1mM DTTで10mM TTで0.3gのL-α-ホスファチジルコリンに加えます。
- リポソームを氷の上に置き、1秒間のパルス間隔で1分間超音波処理し、1分間一時停止し、溶液が透明な黄色になるまで繰り返します。
- リポソームをアリコートし、液体窒素中で凍結し、使用するまで-80°Cで保存する。
- 酵素を再活性化します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
このプロトコルでは、8つの化合物(1−8)を、パイロホスファターゼの一般的な阻害剤であるIDPとともに陽性対照として試験した(図2A)。各化合物は、三重で3つの異なる濃度(1μM、5μMおよび20μM)で試験した。スクリーニングのワークフローを図1に示し、サンプルおよび試薬の調製から860nmでの吸光度測定までである。
このプロトコルの終わりに、溶液A+Bおよびアルセニトクエン酸塩を添加した後、溶液は、観察することができるモリブデン酸を有するリン酸イオンの複雑な形成に起因する709 nmおよび860nm14で最大吸収を有する安定な青色を開発し、酵素反応の発生を示す。この実験では、709nm15での吸光度に比べて検出限界や感度が高く、放出されるPi量の測定に860nmでの吸光度を用いた。青色は室温で30分のインキュベーションで完全に発達し、少なくとも...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここでは、Vidilaserisら14に基づく96ウェルプレート形式のT.マリティマからの膜結合ピロホスファターゼの阻害剤の簡易スクリーニングに関する詳細なプロトコルを報告する。このプロトコルは安価であり、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から形成され、明確な青色12を有するホスホモリスブデン種に還元される12-ホスホモリブデン酸に基づいている。この方法は、より感受性の高いマラカイトグリーンアッセイ16のような他のプロトコルよりも好ましいが、この方法は、TmPPase再活性化14に必要とされる高リン脂質濃度の存在下での干渉を示さないからである。
スクリーニングプロトコルのワークフローを図1に示し、このプロセスを1時間で完全に達成することができます。このプロトコルは71 °Cおよび5分の反応時間の最適の働く温度...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
この作品は、ジェーンとアートス・エルッコ財団とBBSRC(BB/M021610)からエイドリアン・ゴールドマンへの助成金によって支えられ、 フィンランドアカデミー(No. 308105)からケニ・ヴィディレーザーイス、(No. 310297)からアンリ・シャアール、(No. 265481)からヤリ・イリ・カハルオマ、ヘルシンキ大学からグスタフ・ボイエ・アフ・ジェンナスへの研究基金。著者たちは、プロジェクト中の彼女の技術的な助けのためにベルナデット・ゲールに感謝します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 粘着シールシート | Thermo Scientific | AB0558 | |
| ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物 | Merck | F1412481 636 | |
| アスコルビン酸 | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8ウェルPCRチューブストリップ0.2 ml、キャップなし (120) | 日本遺伝学 | FG-028 | |
| ドデシルマルトシド(DDM) | メルフォード | B2010-100G | |
| エタノール | メルク | 1009901001 | |
| 氷酢酸 | メルク | 1000631011 | |
| 塩酸 | シグマアルドリッチ | 258148-500ML | |
| イミド二リン酸ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-&α;-ホスファチジルコリン 大豆レシチン | Sigma | 429415-100GM | |
| 塩化マグネシウム | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| マルチプレート 96ウェルPCRプレート | バイオ・ラッド | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskanアセント(タイプ750) | Labsystems | ||
| ポリスチレンペトリ皿(サイズ150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| 塩化カリウム | Merck | 104936 | |
| Prism 6 ソフトウェア | GraphPad | ||
| QBT2 加熱ブロック | グラント機器 | ||
| ナトリウムメタヒ素 | フィッシャーケミカル | ||
| ナトリウム二塩基性(Pi) | |||
| ピロリン酸ナトリウム二塩基性 | フルーカ | 71501-100G | |
| クエン酸三ナトリウム二水和物 | フルーカ | 71404-1KG |
参考文献
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
