このプロトコルは、非ヒト霊長類膵島における酸素消費量の正確かつ再現性の測定を示す。マイクロプレートの小口ローディング技術およびコーティングは、他のタイプの培養スフェロイドにおける呼吸の効率的な測定のためのフレームワークを提供する。
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この記事について
サマリー
要約
ex vivo膵島のような細胞の回転楕円体クラスターにおける酸素消費量の測定は、歴史的に困難でした。回転楕円体中の酸素消費量の測定用に設計された96ウェルマイクロプレートを用いて、小本当座酸素消費量の測定を実証する。このアッセイでは、回転楕円体マイクロプレートは、アッセイの前日に細胞および組織接着剤でコーティングされる。少量の接着剤溶液を利用して、井戸の底だけに対するイツラシの付着を促します。アッセイの日に、15個の小島が各井戸のベースに直接積み込まれ、小島の最適な位置決めと酸素消費量の正確な測定を保証する技術を使用します。ミトコンドリア呼吸の様々な側面は、ATP依存性呼吸、最大呼吸、およびプロトン漏出を含む非ヒト霊長類の島で薬理学的にプローブされる。この方法では、井戸あたりの小島の数が少ないだけで、一貫性のある再現可能な結果が得られます。理論的には、同様のサイズの任意の培養回転楕円体に適用することができる。
概要
正常な血糖値を維持するために、膵臓β細胞はグルコースの上昇を感知し、それに応じてインスリンを分泌しなければならない。グルコースレベルとインスリン分泌の結合は、グルコース代謝とミトコンドリア酸化リン酸化リン酸化を介してATPの産生に直接リンクされています。従って、ミトコンドリアは刺激分泌結合1において重要な役割を果たす。β細胞ミトコンドリア機能を評価すると、インスリン分泌障害につながる欠陥を明らかにすることができます。膵臓α細胞によるグルカゴンの分泌もミトコンドリア機能2と密接に結びついている。不死化した島の細胞株は、いくつかのタイプのアッセイに有用であることが証明されているが、これらの細胞の生理学は、グルカゴン3、4およびインスリン/ソマトスタチン5、6無傷のイレットによるインスリン分泌の増強によって示すように、全島機能を正確に再現しない。これは、完全な、無傷の小島を使用して酸素消費量を測定する必要性を示しています。
アイソレ細胞の呼吸法の測定技術は、酸素感受性蛍光色素7の使用から酸素消費量
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プロトコル
1. アッセイを実行する前日のマイクロプレートおよびセンサーカートリッジの準備
島は、前に説明した13として3歳のニホンザルから分離されました。この方法は、人間の膵島を死体ドナーから分離するために使用されるものと非常によく似ていますが、動物が沈下している間に、動物が臓器除去の前にコラゲターゼ溶液で膵臓を膨らませることが多いマウスとは異なります。島の取得は、オレゴン国立霊長類研究センター(ONPRC)およびオレゴン健康科学大学の制度動物ケア使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って行われ、ONPRC IACUCによって承認されました。ONPRCは、米国農務省(USDA)が施行する動物福祉法および公衆衛生サービス方針および国立衛生研究所が公表する実験動物のケアと使用に関するガイドに従って、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシーを遵守します。
- 回転楕円体マイクロプレートの調製
- 重炭酸ナトリウムの0.1M溶液の3 mLを調製する。フィルターは、溶液を殺菌します。0.45μmフィルタ(材料表)を利用しました。
- 細胞培養フードに、200μLの細胞および組織接着剤(材料の表)を0.1M重炭酸ナトリウムの2.8mLに加えます。次に、この溶液の20°Lを96ウェルスフェロイドマイクロプレート(
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結果
小島をマイクロプレートにロードするには、図1Aに示すように、15個の小島を15μLの媒体で吸引する必要があります。島は数秒以内にピペットチップの底部に向かって自然に沈殿します。その後、ピペットチップは井戸の底部に下がります。先端は非常にわずかに持ち上げられ、小さな容積(約5°L)は小さな小腸と一緒にピペットされる。この技術はマイクロプレート井戸の底部の島の一貫した配置をもたらす(図1B)、正確な酸素消費の測定を可能にする。
図2は、アッセイ全体の酸素消費量に関する個々のウェルによる代表的な結果を示す。この特定の実験は、井戸の底ではなく井戸の側面に多くの小島が立ち往生して、井戸が不十分にロードされたときに何が起.......
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ディスカッション
島の酸素消費量の研究は、以前、島の球形の形状、培養面への付着の欠如、および井戸あたりの必要な島の数によって妨げられてきた。このプロトコルでは、少数の小島の島の酸素消費量を測定するための96ウェルスフェロイドマイクロプレートの有効性を強調し、技術的に実現可能で一貫した島を処理し、ロードする技術を実証します。結果。
小島がマイクロプレートの底部に付着し、アッセイ全体の混合工程中に不安定にするために、96ウェルマイクロプレートは、アッセイの前日に細胞接着液でコーティングされる。これは一般的に有益ですが、小島が適切にロードされていない場合、それらは底部ではなく井戸の側面に付着する可能性があり、したがって正確な測定に影響を与えたり、妨げたりします。これに対処するために、我々は接着剤溶液のみの20°Lの非常に少量のコーティング井戸をお勧めします。さらに、我々が示すピペット技術は、小島が井戸の底にロードされ、追加のメディアの流れによって側面を押し上げないことを保証します.
96ウェルスフェロイドマイクロプレートは、必要な島の数が多く、同時に.......
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
著者らは、彼らの施設の使用のためのヴァンダービルトハイスループットスクリーニングコア、アジレントバイオテクノロジー、非ヒト霊長類のイサット分離のためのポール・キエフ博士(オレゴン健康科学大学)、および図1の支援のためのエリック・ドナヒュー(ヴァンダービルト大学)を認めたい。J.M.E.は、国立衛生研究所のNIGMSによって、受賞番号T32GM007347の下でサポートされました。M.G.は、NIH/NIDDK(R24DK090964-06)と退役軍人省(BX003744)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養皿、60 mm X 15 mm スタイル | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak 細胞および組織接着剤 | Corning | 354240 | |
| コニカルチューブ、50 mL | Falcon | 352070 | |
| デキストロース 無水 | Fisher Scientific | BP350-1 | グルコース溶液用、200 mg/ml、滅菌フィレター付き |
| 使い捨てリザーバー (滅菌)、25 ML | Vistalab | 3054-1033 | マルチチャンネルピペット |
| EZFlow 滅菌 0.45 μm PES シリンジ フィルター、13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-グルタミン | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| マルチチャンネル ピペット チップ | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| マルチチャンネル ピペット、15-1250 μL | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 4672100BT | 推奨 |
| P20、P200、P1000 ピペット | エッペンドルフ | 2231000602 | |
| pH プローブ | ハンナ・インスツルメンツ | HI2210-01 | |
| ピペットチップ、20 μL、200 μL、1000 μL | Olympus | 24-404、24-412、24-430 | |
| タツノオトシゴ XF ベース メディア | Agilent | 103334-100 | |
| タツノオトシゴ XF セル水戸ストレス テスト キット | Agilent | 103015-100 | オリゴマイシン、FCCP、ロテノン/アンチマイシンを含む |
| タツノオトシゴ XFe96 アナライザー | Agilent | S7800B | 37 °C 非 CO2 インキュベーター |
| タツノオトシゴ XFe96 スフェロイド フラックスパック ミニ | Agilent | 102905-100 | センサーカートリッジ、スフェロイドマイクロプレート、キャリブラントを含む |
| 重炭酸ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | BP328-500 | |
| ピルビン酸ナトリウム | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| 実体顕微鏡 | オリンパス | SZX9 | |
| シリンジ (滅菌)、5 mL | BD | 309603 | 無菌ろ過用 |
| 水(無菌) | Σ | W3500-500mL |
参考文献
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology
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再版と許可
