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方法論記事

膣内HIV曝露とHIV感染治療に対するヒト化NOGマウス

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DOI:

10.3791/60723

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2020年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Infectious Diseases, Aarhus University Hospital, 3Department of Biomedicine, Aarhus University, 4Department of Gynecology and Obstetrics, Aarhus University Hospital, 5Department of Biology, University of Nebraska at Omaha

この記事について

サマリー

幹細胞移植、膣内ヒト免疫不全ウイルス暴露、液滴デジタルPCR RNAを用いたヒト化免疫不全ウイルス感染NOGマウスモデルの生成と評価のためのプロトコルを開発しました。定量化。

要約

ヒト化マウスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ウイルス学を研究し、抗ウイルス薬をテストするための洗練されたプラットフォームを提供します。このプロトコルは、成人NOGマウスにおけるヒト免疫系の確立について述べている。ここでは、ヒトCD34+細胞に由来する臍帯血の単離とその後の静脈内移植から、HIV感染によるモデルの操作、組み合わせ抗レトロウイルス療法まで、すべての実用的なステップを説明する。cART)、および血液サンプリング。約75,000hCD34+細胞がマウスに静脈内注射され、ヒトキメラリズムのレベル(ヒト化とも呼ばれる)は、末梢血中にフローサイトメトリーによって数ヶ月間縦方向に推定される。合計75,000 hCD34+細胞は、末梢血中の20%~50%のヒトCD45+細胞を生み出します。マウスはHIVによる膣内感染の影響を受けやすく、血液は分析のために毎週1回、長期間にわたって毎月2回サンプリングすることができる。このプロトコルは、液滴デジタルPCR(ddPCR)を用いた血漿ウイルス負荷の定量法について説明する。我々は、マウスが食事中の標準的なcARTレジメンで効果的に治療する方法を示す。通常のマウスチャウの形でのcARTの送達は、実験モデルの重要な改良である。このモデルは、全身性および局所的な曝露前予防化合物の前臨床分析、ならびに新規治療およびHIV治療戦略の試験に使用することができる。

概要

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、世界中で3700万人以上の感染者を有する慢性感染である1.併用抗ウイルス療法(cART)は救命療法であるが、治癒はまだ保証されている。したがって、HIVの継続的な研究を促進するために、ヒト免疫系とその応答を反映した動物モデルが必要である。ヒト細胞を重度免疫不全マウス2に移植することにより、ヒト化マウスの複数のタイプが開発されている。このようなヒト化マウスはHIV感染の影響を受けやすく、非ヒト霊長類シミアン免疫不全ウイルスモデルに代わる重要な代替手段を提供し、非ヒト霊長類よりも安価で使いやすい。ヒト化マウスはHIVウイルス感染、病因、予防、および治療3、4、5、6、7、8、9、10、11の研究を促進している。

コード血液由来ヒト幹細胞をNODマウスに移植して開発したHIV研究用の柔軟なヒト化モデルシステムを紹介する。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) 背景。非胎児起源であることに加えて、これらのマウスの実用的なバイオエンジニアリングは、血液肝胸腺(BLT)構築物の移植に関与する微小外科的処置に比べて技術的に厳しくない。

我々は、膣内感染を通してHIV感染を確立する方法と、敏感な液滴デジタルPCR(ddPCR)ベースのセットアップで血漿ウイルス負荷を監視する方法を示す。その後、毎日のマウス食生活の一部として与えられる標準cARTの確立について述べます。これらの組み合わせ方法の目的は、動物へのストレスを軽減し、各動物の取り扱いに費やす時間が制限される大規模な実験を促進することである12。

ヒトでは、CCR5Δ32/wtまたはCCR5Δ32/Δ32遺伝子型が原因で、トランスミッタ/ファウンダーウイルスによるHIV感染に対する感受性が低下し、HIV研究の目的でヒト化マウスを幹細胞でバイオエンジニアリングする際には、いくつかの予防措置を講じる必要があります。CCR5遺伝子に天然の変異体、特にΔ32欠失が世界14、15の他の部分と比較してスカンジナビアおよびバルト諸国のネイティブ集団でより一般的であるため、これは私たちの地域で特に当てはまります。したがって、我々のプロトコルは、移植前にCCR5変異体のドナー造血幹細胞をスクリーニングするための容易で高スループットのアッセイを含む。

膣内暴露のために我々は、送信機/創設者R5ウイルスRHPA4259を選び、感染の初期段階で女性から隔離され、感染した16.我々は、マウスの大部分で正常な伝達を得るのに十分であるが、100%透過率を下回るウイルス用量にマウスを曝露した。このような用量を選択すると、薬物候補の抗ウイルス効果がHIV予防実験で保護動物をもたらし、治療研究のためのウイルス負荷が低下するような伝達率において十分なダイナミックレンジが可能になる。

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プロトコル

すべての臍帯血サンプルは、両親による匿名の寄付のインフォームド・コンセントを含む、地元で承認されたプロトコルに厳密に従って入手された。すべての動物実験は、ライセンス2017-15-0201-01312の下でデンマークの国の規制に厳密に従って承認され、実行されました。

注意:HIV暴露マウスと血液を細心の注意を払って処理してください。確認されたHIV消毒剤(材料表)でHIVと接触しているすべての表面および液体を除染する。

1. ヒトCD34+幹細胞の分離

  1. 計画帝王切開または膣出産後、および地元の倫理的承認に従ってEDTAコーティングされた採血管で臍帯血サンプルを収集します。
  2. メーカーのプロトコルに従って密度勾配分離によってコード血からPMBCを分離する。
  3. 成熟細胞に対する共通のマーカーに対する抗体を事前に濃縮することにより、PBMC集団からCD34+細胞を分離し、赤血球との望ましくない系統の細胞の架橋を誘導する。この後、製造元のプロトコルに従って、磁気ビーズを使用したCD34+セルエンリッチメントが続きます。
    1. 90 μLのトリパンブルーで10μLの細胞懸濁液を再サスペンディングすることにより、標準トリパンブルー除外によって生細胞数を決定します。この溶液を10μLをヘリコンテメーターに加え、メーカーのプロトコルに従って非青色の細胞を数えます。
    2. マウス移植の日まで、胎児ウシ血清(FBS)の10%DMSOの1 mLのCD34+細胞を生存します。
    3. CD34+幹細胞純度(各サンプルの約30,000個の細胞)を評価するために、単離された(CD34+)およびフロースルー細胞(CD34-)の両方の小さな一部分を別々に凍結保存する。あるいは、濃縮したての細胞に純度をテストします(後述のステップ2を参照)。
    4. CCR5Δ32ステータスを決定するために、非ペレットフロースルー(CD34-)の一部を凍結する。細胞は、凍結溶液を条件付けせずに直接凍結することができるが、ペレット内の赤血球の存在は、フロースルーペレット化された場合、後続のPCRを阻害することができる。

2. フローサイトメトリーによるCD34+幹細胞純度の評価

  1. 分離した細胞(CD34+)とフロースルー細胞(CD34-)を解凍します。各バイアルから細胞を室温(RT)FACS緩衝液の9mLで再懸濁して細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ胎児血清(FBS)からなる。
  2. RTで300 x gで5分間の遠心分離をペレット細胞にする。
  3. 上清を注ぎ、残りの液体中の細胞を再懸濁し、FACSチューブに移します。FACSバッファーの3 mLで洗浄ステップを繰り返します。第2遠心分離後、上清を注ぎ、残りの液体中の細胞を再懸濁する。
  4. 5 μLのFc受容体遮断液(材料表)を加え、RTで10分間放置します。Fc受容体遮断溶液を洗い流さない。
  5. ヒトCD3(クローンSK7)BUV395、CD34(クローンAC136)、FITC、およびCD45(クローン2D1)APC(表1)に対して所定の量の抗体を含む混合物を加える。暗闇の中でRTで30分間細胞を残します。フルオロフォアは、補正マトリックスを必要とせずに、利用可能なフローサイトメーターで評価できるパラメータに基づいて選択する必要があります。
  6. FACSバッファーの3 mLで細胞を洗浄します。
  7. RTで300 x gで5分間遠心分離し、細胞をペレットにする。
  8. 上清を注ぎ、残りの液体の細胞を再懸濁します。
    1. この洗浄ステップ 2x を繰り返して、すべての非結合抗体が除去されていることを確認します。
  9. サンプルをフローサイトメーター(材料表)に記録し、適切なソフトウェアでデータ分析を行います。gating 戦略は、図 1A– Fに示されています。

3. 臍帯血中CCR5Δ32変異体の遺伝子スクリーニング

  1. 200 μM の dNTP ミックス、0.01 U/μL 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、および表 2 に詳述したフォワードおよびリバースプライマーを含む 11.25 μL の PCR ミックスを用いて、1.25μL の非ペレットフロースルーのインキュベートします。
    1. PCR反応ごとに、ヌクレアーゼを含まない水で約12.5 μLに調整します。
  2. 表3に詳述したPCRサイクリングプログラムでゲノム断片を増幅する。
  3. 2% アガロースゲル13で PCR 産物を分離します。
    1. 野生型アレルおよびΔ32アレル由来のPCR産物は、それぞれ196塩基対および164塩基対バンドのPCR断片を生成し、ゲル電気泳動13(図1G)により容易に区別できる。

4. 静脈内幹細胞移植

注:ある人が実験室で細胞を準備し、別の人がマウスとワークスペースを移植のために準備することは効率的なアプローチです。

  1. 動物施設では、幹細胞の移植計画の4〜6時間前に、6〜7週齢の雌NODを照射する。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) マウス (材料の表) と 0.75 Gy と Cs137ソース.最良のプレコンディショニング線量は、マウスの年齢、放射線源、およびその他の要因によって異なる場合があります。このプロセスは、ヒト幹細胞との生着に成功するために動物を条件とします。
  2. 動物施設で、マウスまたは細胞をワークスペースに取り込む前に、フローベンチのワークスペースとすべての試薬を準備します。
    1. フローベンチの作業面を覆う無菌ブルーパッドを配置します。滅菌ガーゼとシャープ容器を準備します。
    2. 70%エタノールで消毒された加熱ランプを、熱の下に空の無菌マウスケージで流れ台に置きます。
  3. 実験室では、分離されたCD34+細胞を解凍し、37°CのプレーンRPMIの9 mLでそれらを希釈します。
  4. RTで5分間350xgで細胞を遠心分離し、吸引により上清を捨て、37°Cで1mLのプレーンRPMIでペレットを再懸濁した。
  5. トリパンブルーの除外でセル数を特定し、マウス1個につき200μLに調整します。後続の処理手順による損失の可能性を考慮するために余分に作ってください。
    1. 各マウスに200μLあたり75,000個のCD34+細胞を移植する準備をします。
    2. 細胞は、移植前に動物施設への輸送中に4°Cに保つことができる。細胞を氷上に置かないようにして、凝集や凝集を減らします。
  6. 動物施設では、マウスをケージと一緒にフローベンチに入れ、加熱ランプの下のケージにマウスを移して血管を拡張させる。マウスが暖かくなったら熱から離れるように、ケージの一方の端を熱源から離しておきます。熱源から離れてケージの端に移動したマウスは、尾静脈注射を成功させるために十分に暖かいです。
  7. CD34+ 細胞を懸濁した状態で、1 mL潤滑シリンジを800μL以上のマークに取り付けます。潤滑1 mLシリンジを使用すると、静脈内注入を劇的に緩和し、この技術の精度を向上させます。
  8. 30G 13mmの針を取り付け、注射用の針と注射器を準備します。この操作順序により、このような小さなゲージ針を介して細胞の急速な吸引中に起こり得る損傷を与えられ、移植される細胞の完全性を保護しながら、注射器はより速くロードすることができます。プランジャーを押して針のハブに液体を充填し、針の200μLのマークまで液体を取り除きます。
  9. IV注射を行う際に使用する拘束器に、加熱したマウス(ステップ4.6)を入れてください。200 μLの細胞懸濁液をマウスの尾静脈に慎重に注入します。2 sを過ごし、突っ込みを行い、注射完了後約2sの針を挿入したままにします。これにより、注射部位から十分に遠く離れた針の除去前に細胞が移動していることを保証する。
  10. 必要に応じて、目に見える血液を除去するために、無菌ガーゼでマウスの尾を拭きます。マウスを加熱されていないホームケージに戻します。残りのマウスと注射手順を繰り返します。

5. 分析のための血液採取と処理

注:末梢血中のヒト細胞生着は、ヒト幹細胞移植後3~5カ月のフローサイトメトリーで評価できます。

  1. 局所的なIACUC承認の技術を使用してマウスから血液サンプルを引き出す。
  2. 血液の凝固を避けるために、10 μL 0.5 M EDTA (pH = 8.0) を含む無菌 PCR マイクロ遠心管に、最大 70 ~ 100 μL の血液を集めて下さいます。

6. フローサイトメトリーによるヒト生着の評価

  1. FACSチューブに血液40~50μLを送管します。
  2. 抗体の非特異的結合を防止するために5μLのFc受容体遮断溶液を加え、RTで10分間放置する。
  3. マウスをCD4(クローンSK3)BUV 496を含有する抗ヒト抗体ミックスを追加し、 CD8(クローンRPA-T8)BV421、CD3(クローンOKT3)FITC、CD19(クローンsj25c1)PE-Cy7、CD45(クローン2D1)APC(表4)および30分間RTで暗闇の中に染色するために残す。
  4. 適切な赤血球の2 mLを各チューブに加え、赤血球をリス化する。赤血球のリシスの前に抗体染色のために特別に処方されたリシス緩衝液を使用する(適切な例は、材料の表に与えられる)。渦は、溶解溶液中の細胞の均等な分布を確保するために簡単に、RTで10分間放置します。
  5. 2 mLのFACSバッファーを加えて、リシス反応を停止させた。
  6. RTで300 x gで5分間遠心分離し、細胞をペレットにする。
  7. 細胞が再懸濁されるまで、上清と渦を穏やかに注ぎます。
  8. RTで300 x gで5分間FACSバッファと遠心分離機を3 mL加えます。
  9. 上清を注ぎ、細胞を再び中断します。
  10. 適切なフローサイトメーターにサンプルを記録し、適切なソフトウェア(材料表)を使用して分析します。代表的な分析と結果を図 2および図 3に示します。

7. 膣内HIV曝露

注:マウスの膣内暴露に使用されるウイルスは、以前に公表されたプロトコル17を使用して産生することができる。ウイルスは-80°Cに保たれ、ローカル承認されたプロトコルに従ってドライアイスに保存されている間、場所間で輸送される。ウイルスは、マウスの暴露の直前までドライアイスに保存されます。ウイルスは、暴露直前に適切な濃度を達成するために、プレーンRPMI(抗生物質または血清添加物を有するRPMIを避ける)に希釈することができる(このIVAG暴露に21,400 IUsが使用された)。一度生成したら、希釈されたウイルスが解凍された後にドライアイスに戻された場合に起こる凍結融解サイクルを避けるために、手順を通して湿った氷の上に希釈されたストックを保管してください。

  1. マウスまたはウイルスをフローベンチに取り込む前に、図4に示すようにすべての機器とフローベンチワークスペースを準備します(ステップ4.2と同様)。
    1. HIV曝露の際にマウスが配置されるワークスペースの中央に、ヒーティングランプの焦点を置きます。加熱ランプは、マウスの体温の低下を保証しません。温度を制御する他の機器も使用することができます(例えば、加熱されたゲルパッドまたは循環温水ブランケット、ローカルIACUC規則18に従って)。
    2. 滅菌20 μLピペットチップと適切なピペットをベンチに持ち込む。液体消毒剤(材料表)を入れた容器をベンチに置き、ウイルスと接触した材料や液体を即時に不活性化させます。
  2. 3%のイソフルランガスとペーパータオルを持つチャンバーにマウスを入れます。この割合のガスは、2~4分以内に動物を麻酔します。免疫不全マウスで使用される他のすべての材料と同様に、麻酔装置は使用前に適切に消毒されなければならない。
  3. 麻酔が終わったら、加熱ランプの下の無菌青色パッドにマウスを移します。麻酔を維持するために、連続3%のイソフルランガスを供給するマスクにマウスのスナを挿入します。マウスを尾の底につかみ、胃を上に向け、手でマウスを支えて戻します(図 4を参照)。
  4. 無菌ピペットチップを使用して、陰部に向かって上向きに軽くなでることで生殖器領域を刺激し、直腸の空化を誘発し、膣への圧力を緩和する。
  5. 外陰部が自然に開き、おそらく無菌ピペットチップを使用してわずかなナッジで開くように、指にマウスの尾を包むことによって慎重に膣の開口部をむき出しにします。
  6. 気泡を作らずに、マウスの膣に無外傷性のウイルスのピペット先端とピペット20 μLを変更します。先端を膣の奥深くに挿入しないでください。むしろ、外陰部を開いて、ピペットの先端を膣の開口部のレベルに置き、接種プロセス中に擦過の可能性を排除するために深く行くことを避け、ウイルスを放出し、重力が膣にウイルスを引き込むことを可能にする。あるいは、ヴェセリノビッチら6で説明されているように、22 G 1.25 mmの鈍い針を使用します。
  7. この位置にマウスを保持し、ウイルス懸濁液の重力による漏出を避けるために、暴露後5分間膣を上向きにします。
    1. マウスをホームケージに慎重に入れ、マウスを背中に置くように注意してください。

8. ウイルス負荷分析前の血液試料の処理

  1. 上記のセクション5に記載されているように血液を収集します。
  2. 血球を500xgで5分間遠心分離し、血漿と細胞を分離する。
  3. ウイルス負荷測定用の40 μLのプラズマを新しい無菌PCR承認マイクロ遠心チューブに集め、さらに処理するまで最低1時間-80°Cで保存します。RNAを単離する前に凍結されていないサンプルのRNAレベルをRNA分離前に凍結したサンプルと比較することからバイアスのリスクを避けるために、RNA抽出前にすべてのサンプルを凍結することが重要です。
  4. 40 μLの懸濁液培地(2.5%ウシ血清アルブミン、50U/mLペニシリンGおよびストレプトマイシン、および10 U/mL DNaseを0.22 μmで滅菌濾過したPBS)を加えて、血液量を元の量に戻します。
  5. 調整した血液量の15μLを新しいPCR承認マイクロ遠心チューブに移します。
  6. 1mLの1mLのRBC溶解溶液(材料表)、渦液を加え、RTで10分間インキュベートします。
  7. RTで9,600 x gで1分間の遠心分離体細胞をペレット細胞にする。
  8. 赤血球汚染はPCRを阻害する可能性があるため、上清を吸引し、小さな白血球ペレットのみを残します。
  9. ペレットは、さらに処理されるまで少なくとも1時間は-80°Cに保存してください。
    注:オプションとして、ステップ8.4からの任意の残りの血液は、ステップ6で前述したように、フローサイトメトリー分析に使用することができます。

9. プロテイナーゼK抽出法を用いたDNA抽出

  1. 後述するプロテイナーゼK抽出法を用いて末梢細胞ペレット(ステップ8.8で生成)からDNAを抽出する。この方法は、この研究で利用された連続採血に必要な血液などの少量の血液から最も高いDNA収率を抽出することが実証されている19.
  2. 25 μL のプロテナーゼ K (20 μg/mL) を 0.1M トリス バッファーの 1 mL に加えます。
  3. プロテイナーゼK溶液を短時間ボルテックスする。
  4. 消化する各細胞ペレットに50μLのプロテイナーゼK溶液を加える。
  5. ピペットを上下に混合し、細胞ペレットの再懸濁を確認する。
  6. 必要に応じて、56 °Cで400 rpm(楽器によって異なります)でサーモシェーカー(材料のテーブル)を振って、テープチューブを1時間押し下げて所定の位置に保持します。
  7. 直ちに同じサーモシェイカーで、95°Cに温度シフトしたプロテイナーゼKを不活性化し、振盪がさらに20分間続きます。
  8. 各サンプルを渦出します。
  9. 各サンプルを-80 °Cに置き、最低30分間置きます。
  10. 解凍し、RTで1分間17,000 x gでサンプルを遠心分離し、不要な細胞断片をペレット化します。
  11. DNA含有上清を新しい微小遠心管に入れる。
  12. DNA テンプレートは、PCR の準備ができています。DNAテンプレートは-80°Cで保存できます。

10. ウイルスRNAのRNA抽出、cDNA合成、およびddPCR定量

  1. メーカーのプロトコルに従ってウイルスRNA分離キットを用いて、解凍されたマウス血漿からRNAを分離する(材料表)。
  2. カラムにサンプルを加えた後、カラム上のDNase処理ステップを追加して、血漿サンプル中のすべてのDNAを確実に除去します。
    1. 各サンプルについて、RNaseフリーDNase溶液(2μLのRNAを含まないDNaseと98 μLの反応バッファを混合)をカラムに加え、RTで15分間インキュベートします。
  3. RNAサンプルを-80°Cで少なくとも1時間保存してから、さらに処理してください。凍結されていないサンプルと凍結したサンプルを比較する場合は、RNA 抽出後にすべてのサンプルを凍結することが重要です。
  4. 前に説明した20の試薬を用いて逆転写酵素ステップを用いてcDNAを合成する。RNAの分解を避けるために、rNase阻害剤の0.5 μLをcDNA反応に加えるようにしてください。
    1. 表5に詳述されているプログラムでcDNA合成を行う。
  5. cDNAサンプルを-80°Cで少なくとも1時間保存します。cDNA合成後にすべてのサンプルを凍結することは、凍結されていないサンプルと凍結されたサンプルを比較する際にバイアスのリスクを回避することが重要です。
  6. ddPCR のサンプルは、次の20のように準備します。
    1. ddPCRプローブ混合物(dUTPなし)20の11μLのcDNAサンプルの3μLを混合し、250 nMの副溝結合プローブ、および900nMの順方向および逆プライマーのそれぞれを表6に詳述する。
    2. ヌクレアーゼを含まない水で、総PCR量を22μLに調整します。
  7. PCR ミックスを液滴発生器の液滴発生油と混合して乳化する(20)。
  8. 表 7に詳述されているとおり PCR プログラムを実行します。
    注: ここに表示されるプライマー/プローブ配列および PCR プログラムは、HIV 株 RHPA4259 の敏感な検出のために特別に設計され、最適化されています。プライマーおよびプローブ配列は、選択した他のHIV株を検出するために容易に調整することができる。
  9. サンプルから液滴の蛍光を検出し、メーカーのプロトコルに従って適切なソフトウェアで結果を分析します。

11. cART含有チャウによる治療

  1. 4,800 mg/kgのラルテグラビル(RAL)、720mg/kgのテノホビルフマル酸(TDF)、および520mg/kg emtricitabine(FTC)21(表8)を含むペレットを有するマウスを供給する。これらの用量は、マウスが25gの重さおよび1日あたりのチャウの4gを食べると仮定して決定した。これは、768 mg/kg RAL、2.88 mg/kg TDF、および 83 mg/kg FTC21の 1 日の用量に対応します。
  2. 外部ベンダーによって準備された cART ダイエットを使用して (資料の表を参照 ) 処方薬の.他の企業もこのレジメンを生み出す可能性があります。通常のマウスチャウと区別しやすいのに赤い色のcARTダイエットを使用してください。
    1. 簡単に区別するために標準的な茶色の色でcARTなしで制御チャウダイエットを作り出す。
  3. cARTの開始のために、cART含有チャウダイエットを加えた無菌マウスケージを準備し、次いでマウスを古いケージから新しいケージに移す。
    1. マウスの重みとcART含有チャウの消費量を目視検査で監視し、マウスが変化に適応していることを確認します。

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結果

幹細胞の純度分析のためのgating戦略を図1に示します。図 1A–Cは、精製された CD34+ の母集団を示し、図 1D– F CD34- フロースルーを使用して、最小量の CD34+ 個体数が分離プロセスで失われたことを示しています。単離されたCD34+幹細胞の純度は、1%未満のT細胞汚染で85%〜95%であった。図1Gは、CCR5Δ32/wt遺伝子型を有する1人の成人ヒト対照ドナーからのCCR5バンドを、続いて2つのCCR5wt/wtおよび1つのCCR5 Δ32/wt幹細胞ドナーからのバンドを示す。19人のドナーの集団におけ...

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ディスカッション

重度の免疫不全マウス株NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(NOG)は、ヒトの細胞および組織の移植に非常に適しています。これらのマウスの自然免疫経路と適応免疫経路の両方が損なわれる。NOGおよびNSGマウスは、TおよびB細胞機能に欠陥をもたらすPrkdcScid突然変異を有する。さらに、これらのマウスは、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、およびIL-21などの多くの主要サイトカインの結合複合体に不可欠である機能的インターロイキン-2受容体γ鎖(共通ガンマ鎖、IL2rg)を欠いている。ヒト免疫系で移植された免疫不全マウスは、HIV感染および免疫学の研究のための強力なツールです。ヒト化マウスを用いて行われたこれらの分野での寄与は、2, 23,24,

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開示事項

著者らは利益相反を宣言していない。

謝辞

著者らは、オーフス大学の生物医学動物施設のスタッフ、特にジャニ・ケア氏のコロニー維持活動とマウスの体重追跡に感謝したいと考えています。著者らは、標準的なcARTを開発し、指導してくれたフロリアン・クライン教授に感謝したいと思います。NIHエイズ試薬プログラム、エイズ部門、NIAID、NIHを通じて、ジョン・カペス博士とクリスティーナ・オクセンバウアー博士からpRHPA.c/2635(cat#11744)を用いて、以下の試薬を入手しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブルーパッドVWR56616-031使用前に滅菌する必要があります
ウシ血清アルブミン (BSA)シグマA8022
CD19 (クローン sj25c1) PE-Cy7BD バイオサイエンス557835
CD3 (クローン OKT3) FITCバイオレジェンド317306
CD3 (クローン SK7) BUV395BD バイオサイエンス564001
CD34 (クローンAC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (クローン SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (クローン 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (クローン RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263懸濁液バッファー
用 dNTP mixLife TechnologiesR0192
ダルベッコスリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)BiowestL0615-500
EasySep ヒト臍帯血 CD34 ポジティブ選択キット II幹細胞17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS溶解液10XBD349202直前にdH20で1:10希釈
FACSチューブ(Falcon 5 mL round-botton)Falcon352052
Fc受容体ブロッキング溶液(Human Trustain FcX)Biolegend422302
Fetal wevine serumSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
ガーゼMesoft157300使用前に滅菌する必要があります
加熱ランプカスタムメイド
血球計算計 (Bürker-Türk)VWRDOWC1597418
イソフルランガスOrion Pharma9658
LSR Fortessa X20 フローサイトメーターBD
マイクロ遠心チューブ、PCR-PT 承認Sarstedt72692405
Mouse cART foodssniff Spezialdiäten GmbHカスタムメイド製品
マウス拘束具カスタムメイド製品
ニードル、マイクロランス 3、30G ½「BD304000
NOGマウスNOD.CG-PRKDCSCID Il2rgtm1Sug/JicTacタコニックNOG-F
ヌクレアーゼフリー水VWRケミカルズ 436912C
ヌクレオスピン96ウイルス DNAおよびRNA分離キットMacherey-Nagel740691
PCR承認済み微量遠心チューブSarstedt72.692.405
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA ポリメラーゼLife TechnologiesF549S
ピペットチップ、滅菌済み、ART 20P バリアThermoScientific2149P
プロテイナーゼ KNEB100005398
QuantaSoft ソフトウェアBio-Rad
QX100 液滴発生器Bio-Rad1886-3008
QX100 液滴リーダーBio-Rad186-3003
RBC 溶解液Biolegend420301
RNase-free DNAse サイズ F + 反応バッファーMacherey-Nagel740963
RNAseOUT 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤ThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500H20
Softject 1 mL シリンジヘンケ・サス・ウルフ5010-200V0
上付き文字 III 逆転写酵素サーモフィッシャー・サイエンティフィック・サイエン
サーモシェイカーVWR89370-910
トリパンブルーシグマT8154
超高純度 0.5 EDTA、pH 8.0サーモフィッシャー・サイエンティフィ15575-020
ヴィルコン S (ウイルス消毒剤)デュポン7511
使用済み に溶解ティフィック・18080044 ック

参考文献

  1. WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: http://apps.who.int/gho/data/node.main.626 (2018).
  2. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
  3. Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829(2010).
  4. Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44(2012).
  5. Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
  6. Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
  7. Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209(2011).
  8. Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).
  9. Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
  10. Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169(2011).
  11. Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
  12. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  13. Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
  14. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
  15. Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
  16. Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
  17. Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
  18. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
  19. Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
  20. Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
  21. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  22. Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
  23. Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
  24. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
  25. Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
  26. Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
  27. Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
  28. Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
  29. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
  30. Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  31. Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
  32. Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118(2018).
  33. Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
  34. Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
  35. Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
  36. Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).
  37. Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
  38. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).

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