方法論記事

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

DOI：

10.3791/60728

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2020年5月17日

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1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。

要約

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哺乳類細胞におけるタンパク質相互作用(PPI)の同定に、設計されたアスコルビンペルオキシダーゼ(APEX)または大腸菌ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)技術が用いられています。しかし、APEXベースPLにおける有毒過酸化水素2(H2O2)、ビオチンによるインキュベーション時間(16~24時間)、およびBioIDベースPLの高インキュベーション温度(37°C)の要件は、植物への適用を厳しく制限しています。2最近説明した TurboID ベースの PL は、BioID と APEX の多くの制限に対応しています。TurboIDは室温(RT)条件の下でわずか10分の蛋白質の急速な近接標識を可能にする。TurboIDの有用性は動物モデルで実証されていますが、最近では、TurboIDベースのPLが、関心のあるタンパク質に近いタンパク質の標識に対するBioIDと比較して、植物において優れたパフォーマンスを発揮することを示しました。ここで提供される、ヌクレオチド結合性ロイシンリッチリピート(NLR)タンパク質ファミリーのN末端トール/インターロイキン-1受容体(TIR)ドメインをモデルとして用いたタンパク質相互作用パートナーの同定のためのステップバイステッププロトコルが提供される。この方法は、ベクター構築、タンパク質発現構築物のアグロインフィルトレーション、ビオチン処理、タンパク質抽出および脱塩、定量、およびアフィニティー精製によるビオチン化タンパク質の濃縮について説明する。ここで説明するプロトコルは、ニコチアナおよび他の植物種に関心のある他のタンパク質を研究するために容易に適応することができる。

概要

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PPI は、さまざまな細胞プロセスの基礎です。PPIを同定するための伝統的な方法は、質量分析(IP-MS)1と結合した酵母ツーハイブリッド(Y2H)スクリーニングおよび免疫沈降法を含む。しかし、両方ともいくつかの欠点に苦しんでいます。例えば、Y2Hスクリーニングは、対象の植物または動物種のY2Hライブラリーの利用可能性を必要とする。これらのライブラリの建設は、労働集約的で高価です。さらに、Y2Hアプローチは、酵母の異種単細胞真核生物において行われ、これはより高い真核細胞の細胞状態を表さない可能性がある。

これに対し、IP-MSは、一過性または弱いPPIの捕捉効率が低く、また、存在量が少ないか疎水性の高いタンパク質には適していません。受容体様キナーゼ(RLKs)やNLRファミリーの免疫受容体などの植物シグナル伝達経路に関与する多くの重要なタンパク質は、低レベルで発現し、しばしば他のタンパク質と一過性に相互作用する。したがって、これらのタンパク質の調節の根底にあるメカニズムの理解を大幅に制限します。

近年、工学的アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)と変異型エシェリヒア・コリビオチンリガーゼBirAR118G(BioIDとして知られる)に基づく近接標識(PL)法が開発され、PPI2,3,4

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プロトコル

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注 : この方法の概要を図 1に示します。

1. 植物材料の準備

  1. N.ベンタミアナ種子を高密度で湿った土壌で栽培し、16時間光(約75μmol/m2秒)と23〜25°Cの8時間の暗い光周期を有する気候室で維持します。
  2. 約1週間後、慎重に4'x 4'ポットに各若い苗を転送し、同じチャンバーに苗を保ちます。
  3. 彼らはその後のアグロインフィルトレーション15のために4-8の葉の段階に成長するまで、約4週間のチャンバー内の植物を維持します。

2. ターボID融合の構築

  1. 標準的な分子クローニング技術を使用して、標的タンパク質とTurboID(アドジーンプラスミド#107177からPCR TurboID)の融合を生成します。ここでは、対象となる標的タンパク質としてNLR免疫受容体のN末端TIRドメインを用い、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(p35S::TIR-TurboID)の制御下でTurboIDに融合したTIRを構築した。
    注:標的タンパク質のカルボキシル末流またはアミノ末語に対するTurboID酵素の融合は、目的のタンパク質に依存します。通常、細....

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結果

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代表データは、記載されたプロトコルに基づいて期待される結果を示し、Zhangら11から適応される。図 1は、N. ベンタミアナで TurboID ベースの PL を実行する手順をまとめます。図2は、浸潤したN.ベンタミアナ葉におけるタンパク質発現およびビオチン化を示す。図3は、浸潤した葉のビオチン化タンパク質が、その後の質量分析のために効率的に濃縮されたことを示す。ストレプトアビドン-C1-コンジュゲート型磁気ビーズを用いたビオチン化タンパク質の濃縮後、様々なサイズの異なるタンパク質が捕捉され、濃縮タンパク質のウェスタンブロット分析は塗抹バンドを示した(図3)。同様の観察は、最近発表されたいくつかの研究676、7、.......

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ディスカッション

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TurboIDビオチンリガーゼは、ビオイド10の酵母ディスプレイベースの指向進化によって生成される。それは他のPL酵素よりも多くの利点を有する。TurboIDは、最適な成長温度が約25°C10であるハエやワームを含む他のモデルシステムにPLを適用することができます。PLアプローチは動物システムで広く使用されてきましたが、植物への応用は限られています。ここで説明するプロトコルは、植物と病原体の相互作用研究で広く使用されているモデル植物であるN.ベンタミアナにTurboIDベースのPLを確立するためのステップバイステップの手順を提供します。このプロトコルは、葉のサンプル調製、遊離ビオチンの除去、抽出されたタンパク質の定量、およびビオチン化タンパク質の濃縮を概説する。

動物細胞培養系における遊離ビオチンは、PBS緩衝液4で細胞を洗浄することによって大部分を除去することができるが、葉組織中の遊離ビオチンは、簡単な洗浄ではクリアでき.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、国立トランスジェニック科学技術プログラム(2019ZX08010-003からY.Z.)、中国国立自然科学財団(31872637からY.Z.)、中央大学基礎研究基金(2019TC028からY.Z.)、NSF-IOS-1354444444444444444444444 NSF-IOS-1339185、およびNIH-GM132582-01からS.P.D.K.

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
OD600測定のためのQ/SXFZ6721分光光度計メタッシュ
炭酸アンモニウムΣA6141-500G
ビオチンΣB4639-1G50 mM 標準的な
遠心分離機エッペンドルフの遠心分離機 5702
遠心分離エッペンドルフの遠心分離機5417R
cOmplete プロテアーゼ阻害剤ロシュ11697489001
デオキシコール酸SigmaD2510-100G
DL-ジチオスレイトール (DTT)VWR ライフサイエンス0281-25G
Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1Invitrogen65001アフィニティー精製用
EDTASigmaE6758-500G
ELISAプレートCorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
塩酸(HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF membraneMilliporeIPVH00010ウェスタンブロット分析用
塩化リチウム溶液(LiCl)、8MSigmaL7026-500ML
低速冷蔵遠心分離機Zonkia、中国製KDC-2046
マグネシウム、六水和物(MgCl2·6H2O)SigmaM9272-500G
磁気ラックInvitrogen123.21Dビーズ吸着用
Multiskan FC マイクロプレート光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックN07710OD595測定用
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
ラット 抗 HAロシュ11867423001
回転ミキサーKylin-Bell ラボ機器WH-986
ショックインキュベーターLabotery用、中国製ZQPZ-228
塩化ナトリウム(NaCl)フィッシャーサイエンティフィックS271-3
デオキシコール酸ナトリウムシグマD2510-100G
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)シグマL4390-1KG
ストレプトアビジン-HRPアブカムab7403
トリトン X-100フィッシャーサイエンティフィックBP151-100
トリズマベースシグマT1503-1KG
ボルテックス・サイエンティフィック・インダストリーズ G-560E
ウォータージャケット インキュベーターブルーパード、中国製GHP-9080アグロバクテリウムMインキュベーション用
Zebaスピン脱塩カラムThermo Fisher Scientific89893ビオチンの除去用
中国 ODsub.600/sub.の測定のために重機カクテル 塩化 IP

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Bio....

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TurboID NLR Nicotiana benthamiana

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