我々は、アグロバクテリウム・リゾゲネスによって毛深い根を誘導する方法を記述する - 酒盤の媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)これは、タータリーそばにおける遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するために使用され、任意の遺伝的形質転換に採用されるか、または改善後の他の薬用植物に使用することができる。
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方法論記事
アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)
この記事について
サマリー
要約
酒類そば(TB)[ファゴピルラムタタサリカム(L.)ゲールトン]は、フラボノイド、特にルチンなどの二次代謝産物が豊富に含まれているため、様々な生物学的および薬理学的活性を有する。アグロバクテリウム・リゾゲネスは、徐々に遺伝子機能を調査し、二次代謝産物の収量を増加させるために薬用植物の毛深い根を誘導するために、世界的に使用されてきました。本研究では、結核におけるA.根茎遺伝子媒介性毛状根を生成する詳細な方法を説明した。7~10日のコチルドンと低コチルド軸を外植体として選び、バイナリベクターを持つA.根茎に感染し、1週間後に出現した出現性の毛状根を誘発した。生成された毛深い根形質転換は、形態、抵抗性選択(カナマイシン)、レポーター遺伝子発現(緑色蛍光タンパク質)に基づいて同定した。その後、変換された毛深い根は、必要に応じて自己増殖した。一方、骨髄芽細胞症(MYB)転写因子FtMYB116は、フラボノイドの合成におけるFtMYB116の役割を検証するために、A.根茎遺伝子媒介毛根を用いて結核ゲノムに変換された。その結果、フラボノイド関連遺伝子の発現とフラボノイド化合物(ルチンおよびケルセチン)の収量がFtMYB116によって有意に促進された(p<0.01)ことを示し、A.根茎介在毛根が遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するための効果的な代替ツールとして使用できることを示した。毛深い根を生成するためのこの研究で説明されている詳細なステップバイステッププロトコルは、調整後に任意の遺伝的形質転換または他の薬用植物に採用することができる。
概要
酒類そば(TB)(ファゴピルム・タタリカム(L.)ゲールトン)は、ファゴピルム属及びファミリー・ポリゴンア科1に属するジコチルドンの一種である。中国医学の相同食品の一種として、結核は、その独特の化学組成と疾患に対する多様な生物活動のためにかなりの関心を受けています。TBは主に炭水化物、タンパク質、ビタミン、カロテノイド、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール類に富んでいます1.抗酸化、抗高血圧2、および抗炎症ならびに抗癌および抗糖尿病特性を含むフラボノイドの様々な生物学的および薬理活性が実証されている3。
アグロバクテリウム・リゾゲネスは、創傷部位44,55に感染することにより、いくつかの高等植物、特にジコチルドンにおける毛深い根疾患の発症に寄与する土壌細菌である。このプロセスは、根誘起(Ri)プラスミド55、66におけるT-DNAの転写によって開始され、一般的には、Riプラスミドからの外因....
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プロトコル
この研究で使用される結核は、山西農業科学アカデミーの小雑穀物研究センターが栽培した「JinQiao No.2」の品種に由来するBT18と名付けられました。このプロトコルの主要な手順を図 1に示します。
注:外植に関連する操作を迅速に操作し、可能であれば、ペトリ皿を閉じてしまい、しおれや汚染を避けてください。特に明記しない限り、全ての外植物インキュベーションは、25°Cで14時間光と10時間の暗光期の条件下で行った。特に明記されていない限り、すべての外植または細菌関連の操作は、層流フードで無菌条件下で行われた。A.根茎遺伝子およびインビトロ植物培養のためのすべての培地成分を表1に示す。pHを調整した後、全ての培地を120°Cで20分間オートクレーブし、固化培地を25mLの培地を直径9cmのシャーレに充填し、固化させた。
注意:すべての遺伝子組み換え細菌や植物を適切な廃棄物容器に堆積させます。煙の食器棚ですべての有害化学物質を操作し、有害廃棄物容器に堆積させます。
1. 結核の外植の準備
- 結核種子の調製
- 20°C未満の温度で2年以内に保存されているふっくらと損傷していないTB種子(図....
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結果
アグロバクテリウム根虫遺伝子-媒介性結核毛状根形変換
本研究では、A.根茎遺伝子を用いて遺伝的に形質転換された毛深い根を得るために確立されたステップバイステップのプロトコルについて説明する。TB種子の接種から、同定された毛深い根の収穫まで約5〜6週間かかり、いくつかの重要なステップが図1(A-H)に示A-Hされています。簡単に言えば、殺菌された殻の種子を接種した(図1B)より速い生殖不能を達成する。A. 根茎遺伝子(図 1D) と無菌の外植体は、それぞれ、活性化し、事前に準備する必要があります。その後、活性化されたA.根茎遺伝子(図1E)、コカルチャー(
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ディスカッション
結核は、遺伝的および代謝レベル,,1、2、5、27、282,5で二1次代謝産物に関連するいくつかの研究で使用されている。2728毛深い根培養は、代謝産物産生のユニークな供給源として、代謝工学29において極めて重要な役割を果たし、関連遺伝子を挿入することによって代謝経路を変化させるために使用することができる。Kim et al.2は当初、フェノール化合物の産生を達成するためにA.根生媒介性形質転換による結核性根培養の確立を導入した。彼らが結核毛深い根で得たルチンの含有量は、野生型の根の10倍以上であった。本研究では、FtMYB116の導入により、ルチン関連遺伝子の発現が高まり、結核性毛深.......
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開示事項
著者らは開示する利益相反を持っていません。
謝辞
本研究は中央公共福祉研究機関ZXKT17002の基礎研究基金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| 寒天粉末 | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary Vectors | ThermoFisherScientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII High-speed micro | 日立 | 所 No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C 多機能シェーカー | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | 水で希釈、100 mg/mL |
| MLS-3750 オートクレーブ滅菌器 | 山陽、日本 | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Lifeサイエンス、北京、中国 | S8210 | |
| その他の化学物質記載されていない | 北京化学工業所、中国 | エタノール、二塩化水銀など。 | |
| PHS-3C pHメーター | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | DMSO で希釈、50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science、北京、中国 | S8040 | 水で希釈、100 mg/mL |
| スクロー | Solarbioライフサイエンス、北京、中国 | S8270 | |
| Trans2K DNAマーカー | TransGen Biotech、北京、中国 | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science、北京、中国 | LP0042 | |
| Whatman直径9 cm 濾紙 | 杭州wohua濾紙有限公司 | / | |
| 酵母抽出粉末 | Solarbio Life Science、北京、中国 | LP0021 |
参考文献
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al.
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