方法論記事

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

DOI：

10.3791/60939

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2020年4月12日

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1Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 2Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 3Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

この記事について

サマリー

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レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。

要約

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神経膠腫は、その侵襲性および不均一性を特徴とする原発性脳腫瘍である。例えば、偽官麻痺、微小血管増殖、間葉形転換および壊死などの特定の組織学的パターンは、高級神経膠腫の組織学的不均一性を特徴付ける。我々の研究室は、オンコストリームと名付けられた間葉細胞の高密度の存在が腫瘍悪性腫瘍と相関することを実証した。私たちは、グリオーマの成長と侵略の根本となるメカニズムを理解するためのユニークなアプローチを開発しました。ここでは、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)およびRNAシーケンシングを利用して、腫瘍内の異種多細胞構造(すなわち、間葉領域または腫瘍浸潤領域)の微分mRNA発現を解析する包括的なプロトコルについて説明する。この方法は、良好な組織組織組織学およびRNA完全性を維持する。灌流、凍結、埋め込み、切り離し、染色は、形態を保存し、高品質のレーザーマイクロ解剖サンプルを得るために最適化されました。結果は、30%スクロースを使用するグリオーマを担うマウスの灌流が良好な形態およびRNAの質を提供することを示している。さらに、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンで腫瘍切片を染色すると、RNAの完全性を維持しながら、良好な核染色および細胞染色が行われます。記載された方法は、感受性と高度に再現性が高く、様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態学を研究するために利用することができる。要約すると、固体腫瘍内の異種多細胞構造の分子的特徴を研究するために、シーケンシングのための形態およびRNAの質を維持するLMDを行う完全な方法を説明する。

概要

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神経膠腫は中枢神経系の最も積極的な原発腫瘍である。彼らは非常に侵襲的で異質な1です。腫瘍の細胞および分子成分の分析は、新たな治療標的を明らかにする。

現在利用可能なさまざまな方法の中で、凍結脳腫瘍組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LMD)は、腫瘍組織からの離散解剖学的領域または特異的細胞集団の単離を可能にする費用対効果の高い、信頼性の高い技術であり、その分子プロファイル22,33を研究する。LMDは、選択した単一細胞または多細胞構造のmRNA遺伝子発現プロファイルの解析を可能にする4,5。54LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的な知識を得るために利用することができる。腫瘍組織の処理の改善は、組織形態およびRNA品質6の最適な光学分解能を得るために必要である。パラホルムアルデヒド固定は形態学的解析に最適な選択肢ですが、これらの条件下でRNAの品質が影響を受けて分解されるため、RNA-seq解析のRNA品質が低下します。凍結組織切片の使用は、細胞膜を破壊し、細胞内に穴を生成する可能性のある氷の結晶形成を回避し、RNA-Seq分析

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プロトコル

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実験動物を使用するここで説明するすべての方法は、ミシガン大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注:GEMMまたは安定したラインから発生する神経球は、マウス10における頭蓋内腫瘍生着に使用し、LMDおよびRNAシーケンシングのために処理することができる。これらの細胞はホタルルシメラーゼとGFPタンパク質を構成的に発現し、腫瘍増殖解析および局在化にさらなる利用が見込まれる。

遺伝子組み換えグリオーマモデル由来の神経球から頭蓋内マウスグリオーマモデルの生成

  1. 遺伝子操作マウス(GEMM)モデルから神経球細胞の一次培養を生成するには、前述のプロトコル10,11,11を用いる。
  2. 記載されているように神経圏培地を調製する:ダルベックコの修飾イーグル培地F-12(DMEM/F12)の500mLは、50x B-27の10mLおよび100x N-2ニューロン培養サプリメントの5mL、100x抗生物質抗ミキサイトの5 mL、ノルモシンの1mLを補った。神経球をめっきする前に、20 ng/mLヒト組換えEGFおよびFGFを培地に添加する。
  3. 37°Cで組織培養インキュベーター中の神経球を....

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結果

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当研究室では、睡眠美容トランスポザーゼシステムを用いて遺伝子操作マウスモデル(GEMM)を生成しました(図1A)。このシステムは、新生児マウスの神経前駆細胞のゲノムに特異的な遺伝的変化を組み込む。これらの変化した前駆細胞は内因性グリオーマ腫瘍を形成する。腫瘍を発生させるために使用されたプラスミド配列は次の例: (1) 睡眠美容トランスポゾン用 pT2C-LucPGK-SB100X ルシメラーゼ発現、(2)NRAS発現に対するpT2-NRASSV12、(3)p53ノックダウンおよびGFPタンパク質発現のためのpT2-shp53-GFP4、および(4)ATRXノックダウンのためのpT2-shATRx-GFP4。プラスミドを、前に説明した11日齢の新生児の前室に注入した。プラスミド取り込みおよび腫瘍形成をインビボ生物発光イメージングシステムを介してモニタリングした。腫瘍を持つマウスが腫瘍の負担の徴候を示すと、彼らは犠牲にされた。腫瘍は、神.......

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ディスカッション

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神経膠腫の不均一性と侵略の根底にある分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的13を発見するために非常に重要である。本稿では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)に続いて、微小化解析を行い、それに続いて神経膠腫の不均質性と浸潤の分子景観を解析するための詳細かつ最適化された方法を説明する。

レーザー捕捉マイクロディション(LMD)は、腫瘍内の異なる領域または単一細胞を同定するために使用することができ、腫瘍14の空間的文脈を維持する分子パターンをさらに分析する特定のサンプルを提供する。この技術は、固形腫瘍15における空間転写体を分析するために用いられる他の方法と比較して、信頼性が高く、低価格である。遺伝子組み換えマウス腫瘍モデルまたは頭蓋内埋め込み型モデルの神経膠腫の不均一性と浸潤をLMDを用いて分析した。これらのモデルは、ヒトグリオーマの顕著な特徴を再現し、神経膠腫の不均一性および浸潤10,12

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開示事項

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この論文の著者は、すべての潜在的な利益相反を宣言しません。

謝辞

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研究は国立衛生研究所(NIH/NINDS)助成金によってサポートされました:R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894からM.G.C.;(NIH/ニンズ)P.R.L.に R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311 を付与します。(NIH/NIBI): R01-EB022563;(NIH/NCI)U01CA224160;ミシガン大学ローゲルがんセンター、チャドタフ財団、リアのハッピーハーツ財団、M.G.C.とP.R.L.生物医学グラントF046166、M.G.C.国立衛生研究所、UL1 TR002240ミシガン臨床健康研究所(MICHR)、博士後期翻訳学者プログラム(PTSP) ミシガン大学フォーベがん研究所へのプロジェクトF049768、失明防止研究研究から医師科学者賞(RPB)、NIH(AK)のNEIからR01 EY022633を付与し、RPBから眼科と視覚科学科への無制限の助成金。本研究では、ビジョン研究コア(P30 EY007003)とがんセンター研究コア(P30 CA046592)を活用しました。AKは、A.アルフレッド・タウブマン医学研究所のウィリアム・デビッドソン夫人・エマージング・スカラー賞の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Accutase Cell Detachment SolutionBiolegend423201
Animal-Free Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062
B-27 Supplement (50X), Serum freeGibco17504044
Buffer RLTQiagen79216
CorningPCR チューブSigma AldrichCLS6530
Cresyl Violet AcetateSigma AldrichC5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12Gibco11330057
Eosin YSigma AldrichE4009
HiSeq 4000IlluminaN/A
Laser Microdissection (LMD) SystemライカLMD7000
N-2 サプリメント (100X)Gibco17502048
Normocin - Antimicrobial ReagentInvivogenant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding MoldsElectron Microscopy Sciences70182
PEN Membrane Glass Slide (2 & micro;m)Lieca1150518
Pinpoint SolutionZymo ResearchD3001-1
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B-1MG
Research CryostatLeicaCM3050s
RNaseZap RNase Decontamination SolutionFisher ScientificAM9780
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input MammalianTakara Bio634411
Tissue-Plus O.C.T. Compoundフィッシャーサイエンティフィック23-730-571

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
  2. Espina, V., et al. Laser-capture microdisse....

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