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方法論記事

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

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DOI:

10.3791/61119

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2020年6月26日

 ,  ,  , 
1College of Public Health, Shaanxi University of Chinese Medicine, 2Spinal Cord and Brain Injury Research Center, Department of Physiology, University of Kentucky

この記事について

サマリー

神経幹細胞を送達する方法は、注射液または懸濁液に適応可能で、虚血性脳卒中後に一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介して報告される。注入された細胞は脳のパレンチマ全体に広く分布し、送達後30dまで検出することができる。

要約

神経幹細胞(NSC)療法は、脳卒中、外傷性脳損傷および神経変性疾患のための新たな革新的な治療法である。頭蓋内分娩と比較して、NSCの動脈内投与は侵襲性が低く、脳の中でNSCのより拡散分布を生じる。また、動脈内送達は、脳循環における初回通過効果を可能にし、肝臓および脾臓などの末梢器官における細胞の捕捉の可能性を減少させ、末梢注射に伴う合併症である。ここでは、マウスとラットの両方において、虚血性脳卒中後の一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介してNSCをイプシラテラ半球に送達するための方法論を詳述する。GFP標識NSCを用いて、虚血性損傷部位内または近傍の高密度で、死後1週間、1週間、4週間でげっ歯類の半球全体で達成された広範な分布を示す。長期生存に加えて、4週でGFP標識細胞の分化の証拠を示す。NSCに関してここで説明する動脈内送達アプローチは、治療化合物の投与にも使用することができ、したがって、複数の種にわたる様々なCNS傷害および疾患モデルに対する広範な適用性を有する。

概要

幹細胞(SC),療法は、脳卒中、頭部外傷および認知症,,11、2、3、4、5、62を含む神経疾患の治療として大きな可能性5を6秘めている。34しかし、病気の脳に外因性のSCを送達する効率的な方法は、問題が残る262、6、7、8、9、10、11、12、13。11,12,139,10,,7,8,,静脈内(IV)または腹腔内(IP)注射を含む末梢送達経路を介して送達されるSCは、特に肺、肝臓、脾臓および筋肉88、9、13、149,13,における微小循環におけるファーストパスフィルタリングの対象となり、非標的領域における細胞の蓄積の可能性が高まる。14侵襲的な脳内注射法は、局所的な脳組織損傷および注射,,,部位2、6、8、14、15、166,8付近のSCの非常に制限された分布をもたらす。2141516我々は最近、外因性神経SC(NSC)を送達するためのカテーテルベースの動脈内注入法を確立した。我々は、マウスまたはラット17、18、19,において左中大脳動脈(MCA)を閉塞するためにシリコーンゴム被覆フィラメントを用いて1つの半球で一過性(1時間)虚血再灌流傷害を19誘発する。このモデルでは、レーザードップラーまたはレーザー斑点イメージング17、19,19を用いた半球の脳血流(CBF)の約75-85%のうつ病を再現的に観察し、一貫した神経障害17、18、1918,19を生み出した。17

時間節約のために、ビデオは通常の速度の2倍で再生するように設定されており、縫合糸による皮膚の準備や創傷閉鎖などの日常的な外科的処置と、電動シリンジポンプの使用とセットアップは提示されません。NSCの動脈内送達法は、げっ歯類における実験脳卒中の中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの文脈で実証される。したがって、後で第2の手術、動脈内注射を、同じ動物上の前の外科部位を用いて行われる方法を実証するために、一過性の虚血性脳卒中手順を含む。げっ歯類の脳卒中モデルにおける動脈内NSC送達の実現可能性は、外因性NSCの分布および生存を評価することによって実証される。脳病理と神経機能障害を弱めるNSC療法の有効性は別々に報告される。

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プロトコル

動物の被験者に関するすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、手術に伴うストレスや痛みを最小限に抑えるために適切な注意を払った。

1. 注射カテーテルと手術用フックの調製

  1. 射出カテーテルを構築する(図1)。MRE010、MRE025、MRE050チューブ、20G、26Gおよび27G注射針(図2A)、600Figure 2Aグリットサンドペーパー、スーパーグルー、2成分5分エポキシを含む必要な材料を収集します。
    1. 針ハブから1cmで20Gと26Gの針を切り、サンドペーパーで端を磨きます(図2B)。針を10mLの二重蒸留水で洗い流し、針の穴をきれいにします。
      注: 2 つの異なるデザイン (図 1)が使用されています。設計1は単一のコネクタを備え、溶液または懸濁液の注入に使用されます。設計2は、細胞(20G針)の注入のための20 Gおよび26 G Luerロックコネクタを有し、NSC含有溶液の全容を確実に送達するために、死んだ容積(26G針)のフラッシュを有する。
  2. 設計1:3-4 cmの長さのMRE010カテーテルを15 cmの長さのMRE025カテーテルに挿入し、スーパーグルーでしっかりした。
    1. MRE025チューブの反対側をMRE050カテーテルのセグメントに接続し、スーパーグルーで固定します。鈍い20G針をMRE050カテーテルの残りの端に挿入し、スーパーグルーで固定する(図1)。
    2. さらにエポキシ接着剤との接続部位を強化します。このカテーテルの設計は試薬(化学薬品またはサイトカインのような他の生物学的製剤のような)の注入のために最適である。
  3. 設計2:3-4 cmの長さのMRE010カテーテルを15 cmの長さのMRE025カテーテルに挿入し、スーパーグルーでしっかりした。
    1. MRE025チューブの反対側をMRE050カテーテルのセグメントに接続し、スーパーグルーで固定します。鈍い20G針をMRE050カテーテルの残りの端に挿入し、スーパーグルーで固定します。
    2. 第1の針の先端付近のMRE050チューブに鈍い26G針を挿入し、注射の方向に従い、スーパーグルーで固定する(図1および図2C)。針とMRE050チューブのセグメントをクリアエポキシで補強する(図2C)。この設計により、針1(20G)を通してNSC注射後に針2(26G)を介して車両溶液を注入し、カテーテルの死量を脳循環に洗い流し、注入量をより正確に制御することができます。
    3. NSCへの損傷を最小限に抑えるために、NSC注射に20G針を使用し、生存率に悪影響を及ぼす可能性があります。
  4. 建設後、カテーテルを10mLの二重蒸留水で洗い流し、続いて70%エタノールを加え、一晩70%エタノールに浸します。
  5. 手術前に、70%エタノールからカテーテルを取り除き、10 mLの無菌PBSで洗い流し、貯蔵および輸送のためのオートクレーブ外科用ツールボックスに入れます。
  6. 外科用フックの準備
    1. 長さ1.5~2cmの長さの針シャフトを27Gの針から切り、両端を紙でくるまで磨きます。次に、小さな止血クランプを使用して、シャフトを一方の端のフックに、もう一方の端にリング形状を曲げてください。
    2. リングを通して10-15 cmの長さのMRE025カテーテルを挿入し、明確な外科テープでしっかり止めます(図2D)。同じ方法を使用して、さらに2つのフックを作成します。
    3. すべてのフックとカテーテルシステムを70%エタノールに浸して使用してください。

2. 動物の準備:配達、住宅、環境適応

  1. 雄および雌のC57BL/6マウス(10-12週、n=10/タイムポイント)およびウィスターラット(10-12週、n=10)をこの研究で使用した。
  2. 食品と水のアドリビタムと環境管理動物のビバリウムでそれらを収容します。
  3. 脳卒中手術の少なくとも1週間前に環境に適応することができます。
    注:脳卒中手術後1dで1人のマウスと1つのラットが死亡し、1つのマウスは重度の麻痺のために人道的な理由でNSC注射の前に3d脳卒中で安楽死させた。

3. マウスとラットの神経幹細胞(NSC)の培養

注: NSC は、確立されたプロトコル20に従って分離され、培養されました。

  1. マウス
    1. GFP陽性雄マウス(B6 ACTb-EGFP)と交配した時陽性の雌C57BL/6マウスからE18胚皮質から野生型(WT)およびGFP標識NSCを単離する。GFP(+)胚を同定するには、FITCチャネルを使用して蛍光顕微鏡で採取した胚を観察します。GFP(+)胚は緑色蛍光シグナルを生み出し、WT胚は弱い自己蛍光のみを示す(図3A)。
  2. ラット
    1. 若年成人WTラットの脳室下帯(SVZ)からNSCを分離する。メーカーの指示に従って注入する直前にDiIでそれらをラベル21。
  3. マウスまたはラットのNSCを神経球に発達するまで培養し、球体の直径が100μm前後に達するとそれらを通過させる(図3B)。3 と 5 の間の注入には NSC を使用します。
  4. 胚性幹細胞マーカーパネルを使用して幹細胞の特性を確認する(図3C)。
  5. 注射の日に、NSC球体を収集し、細胞剥離液との解離、カルシウムおよびマグネシウムフリーPBSで107細胞/mLの濃度に懸濁し、注入するまで湿った氷の上に置きます。

4. 外科手術

  1. 手術前に、挿入長さの手術中の参照のための先端から9 mm(マウスの場合)または15mm(ラット)の銀マーカーペンで商業MCAO縫合のドットをマークします。手術用具(はさみ、鉗子)と器具を各手術の前にオートクレーブし、操作の間にガラスビーズの殺菌器で加熱殺菌する。
  2. 吸入を介して5%イオブルランを有する動物に麻酔を誘発し、1-2%イオブルランで麻酔を維持する。全身の状態(呼吸パターン、ウィスカーの動き、自発的な身体矯正姿勢)、角膜反射、足指ピンチへの応答を観察して、麻酔の深さを評価します。
  3. 動物の仰向けを加熱パッドに置き、ベタジン溶液でクリッピングしてスクラブし、その後70%エタノールを続けて動物の外科部位を準備する。手術中に眼科軟膏(人工涙軟膏など)を塗布することで、動物の目を乾燥から保護します。
  4. 外科医に細菌のスクラブで手をこすり、マスク、無菌手袋、清潔なラボコートを着用してもらいます。

5. 中大脳動脈閉塞(MCAO)脳卒中手術

注:マウスまたはラットの1つの半球で虚血性脳卒中を誘発する手術は、縫合糸が血流を閉塞するために内部頸動脈(ICA)に導入されるという点で類似している(図4)17、18、19、22。17,18,19,22しかしながら、縫合線挿入のために選択された動脈は、その後の幹細胞注入に必要な使用可能な操作スペースに基づいて異なる。ラットは、2つの別々の連続手術(脳卒中およびNSC注射)を可能にするために外部頸動脈(ECA)セグメントに十分なスペースを有するが、マウスは、代替アプローチを必要とする。脳卒中誘発脳血流変化、脳梗塞の大きさおよび神経学的欠損は、著者の以前の報告17、18、1918,19のように報告されている。17

  1. 虚血性脳卒中を誘発するために、頸部領域の中線切開、および左一般的な頸動脈(CCA)、ECAおよびICAの隔離を伴うマウスおよびラットの両方の手術を開始する(図4)。CCAや迷走神経を伸ばしたり、変位したり、圧迫したりしないように注意してください。動脈および手術ステップの選択はその後異なるため、マウスとラットのMCAO手術は別々に説明する。
  2. マウスのMCAO手術(図4A)
    1. CCAの下に3本編み6-0ナイロン縫合糸を置き(図4A、ステップ1)、近位弦を使用して分岐から可能な限り血管を閉塞させるために1つの密な外科結び目を作ります(図4A、ステップ2)。縫合端の端をトリムダウンします。
    2. CCAの遠位側でスリップノットを作成し(注意:ステップ6でリリースされるので過度に締め付けないでください)、2つの締め付けられたノット(図4A、ステップ2)の間に1つの緩いスリップノットを作成します。
    3. 小切開(~1/4~1/3周)をマイクロシザーでCCAの近似結び目に近いマイクロシザー(図4A、ステップ3)で切り取り、7-0固体ナイロン縫合糸をコーティングした市販のシリコーンゴムを慎重に挿入する(図4A、ステップ4)。この縫合糸を中央の紐で固定し、十分に締め付け(図4A、ステップ5)、ICAからの逆流によるシリコーンゴム被覆ナイロンフィラメントの動きを防ぎながら、ピンセットで穏やかな押し込みを行いながら、ECAに向かって縫合糸を進歩させます。
    4. 上部(遠位)スリップノット(図4A、ステップ6)を解除し、先端が9mm(縫合線の銀マーカーを基準として)分岐を通過するまでICAにナイロン縫合糸を進めます。縫合糸を確保し、血流を防ぐために、上の2つのスリップノットを締めます。
    5. フィラメント1時間後(図4A、ステップ7)を引き出し、出血を防ぐために真ん中の結び目を使用してCCAをリゲートします(図4A、ステップ5-7を逆順に、ステップ8に見られるように最終結果)。上の結び目を離します。4-0外科縫合で創傷を閉じる。
  3. ラットのMCAO手術(図4B)
    1. ECAの下に2本の編み込み6-0ナイロン縫合糸(図4B、ステップ1)を配置し、遠端に1つのタイトノットを可能な限り下にします(図4B、ステップ2)。
    2. 血管クリップをICAとCCAに置いて動脈血流を遮蔽する(図4B、ステップ3)。スリップノットは、容器クリップの代替として使用できます。
    3. マイクロシザー(図4B、ステップ3-4)でECAに小さな切開を行い、6-0ナイロンフィラメント(図4B、ステップ5)をコーティングした市販のシリコーンゴムを挿入し、ECAのスリップノットで適切に固定します。
    4. ICA上の容器クリップを外し、銀マーカー(15mm)が分岐に達するまでフィラメントをICAに進め(図4B、ステップ6)、ECA上の2番目の結び目で縫合を固定する(図4B、ステップ6)。
    5. 虚血の1時間後、このフィラメントを引き出し、切開をリゲートして出血を防ぎ(図4B、ステップ7)、CCAから血管クリップを取り除き(ステップ8の最終結果)、4-0外科縫合で創傷を閉じる。

6. 回復

  1. 脳卒中手術後、動物が意識を完全に取り戻すまで加熱パッドに置きます。
  2. 皮下注射で鎮痛を提供する。水と食べ物のアドリビタムにアクセスして、動物を自宅のケージに戻します。

7. 動脈内注射

  1. カテーテル全体を70%エタノールで洗い、使用するまで一晩浸します。注射の直前に、無菌シリンジで針のルアーロックを接続し、10 mLの滅菌PBSでカテーテルシステムの内腔側全体を洗浄します。
  2. NSCインジェクションの時間枠と準備
    注:他の研究チームの経験と報告に基づいて、NSC注射のタイミングは、被験者と外因性NSCの両方の生存のために重要です。我々の試験研究では、早期時点(再灌流後の最初の6時間以内)でのNSCの注入は、より高い死亡率につながった。したがって、後の注射時間ポイントを試験し、脳卒中後の2d(48時間)〜3d(72時間)の間のタイムウィンドウを決定し、NSCのイントラパレンキマル分布を達成するのに効率的である。
    1. マウスの場合は注射器ポンプの注入速度を20 μL/min、ラットの場合は50 μL/minに設定します。注射の速度や持続時間が過剰に増加すると、全身体積過負荷が起こり、マウスはラットよりも脆弱である。
    2. 簡単に言えば、脳卒中手術後の3dで、イオブルランで動物を麻酔し、加熱パッドに仰向けに置く。
    3. 子宮頸部創傷を再び開き、ECA、ICAおよびCCAを再び露出させる(図5、ステップ1)。脳卒中手術と同様に、種に基づいて注射経路を決定する。マウスでNSC注射用のCCAを、ラット23に対してECAを利用する。
  3. マウスのCCAを介した動脈内注射
    1. CCAの下に2つの6-0編み込みナイロン縫合糸を置きます。前の脳卒中手術の分岐と下の結び目の間に、それぞれとの間に緩いスリップノットを作成します(図5、ステップ2)。
    2. 上のスリップノットを締め、下の結び目の上に小さな切開を行います(図5、ステップ3)。切開部を通してMRE010カテーテルを挿入し(図5、ステップ4)、注入の流れを妨げずに中間結び目で固定します(図5、ステップ5)。上の結び目を解放し、カテーテルの位置を調整するとき、血液の背流はカテーテルで見えるべきである。
    3. ECAに容器クリップを置き、このカテーテルを通して1 x 106 GFP-NSCを注射器ポンプで5分間5分間、同じ速度で50-100 μLのフラッシュを注入します。
    4. 注射後、上部のスリップ結び目で上のCCAをリゲートし、MRE010カテーテルを引き出します(図5、ステップ6)。中央ノットと上のノットを締め、トリムします。ECAから容器クリップを取り外します。図 5の最終画像を参照してください。.
    5. 4-0外科縫合で創傷を閉じる。
    6. 加熱パッドと皮下鎮痛注射で十分な回復を提供した後、動物を自宅のケージに戻します。
  4. ラットのECAを介した動脈内注射
    1. ECA と CCA を容器クリップで一時的に遮蔽します(図 5、ステップ 2)。
    2. ECAの近位側(図5、ステップ3)で小切開を行い、MRE010カテーテルを挿入し、結び目で固定する(図5、ステップ4)。
    3. 両方の容器クリップを取り外し、50 μL/minで50μLのPBSに5 x 106 NSCを2分間注入し、その後に50-100 μLのPBS(図5、ステップ5)を同じ速度でフラッシュし、電動シリンジポンプを使用します。
    4. 注射後、CCAとECAを再び容器クリップで閉塞し、注射カテーテルの離脱後に2番目の切開の近位側でECAをリゲートする(図5、ステップ6)。
    5. 2つの容器クリップ(図5、ステップ7)を取り外し、4-0の外科縫合で傷口を閉じます。
    6. 加熱パッドと皮下鎮痛注射で十分な回復を提供した後、動物を自宅のケージに戻します。
  5. 組織学的アッセイ
    1. 虚血性脳卒中を受けたマウスおよびラットから脳を採取し、安楽死後にNSCまたは車両溶液を注射し、1d(マウスおよびラット)で4%パラホルムアルデヒド、7d(マウス)、注射後30d(マウス)で心臓内灌流を行う。これらの4つのグループのそれぞれは、5 NSCと5つの車両注入動物で構成されていました。
    2. 一晩脳を固定し、3dのための30%スクロースで凍結保存します。
    3. 脳をOCTに埋め込み、厚さ40μmでスライスし、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、アストロサイト)、Tuj1(成熟ニューロン)、ダブルコルチン(DCX、未熟ニューロン)を含む細胞特異的マーカーで免疫染色後のNSCの分布を調べる。
      注:GFPを発現するラット株がないため、比較的短期間の観察しかできない一過性蛍光標識であるDiIを利用しました。したがって、NSC分布はラットの脳卒中後1dでしか調べなかった。

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結果

GFP標識NSCは虚血性脳、主に半球、特に半影、および傷害縁に沿って容易に検出された(図6)。検査者は、イメージングおよび分析中に単盲であった。

例えば、注射後1dで、マウス海馬内でNSCが検出された。NSCのサブセットは、この初期時点においてもデンテート回における未熟なニューロンマーカーDCXの共発現を示した(図6A)。

脳卒中後10d(NSC注射後7d)において、外因性GFP-NSCは線条体および皮質における損傷の縁(流域領域)で最も高い密度で観察された(図6B)。注射後7dまでに多くのGFP-NSCもDCX(青い円で示される)を発現し、その神経の運命を示す。車両溶液注射を受けた動物と比較して、NSC注射はまた、半球の間でDCX染色(赤)を増加させた。

注射後30dで、NSCは依然として負傷...

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ディスカッション

神経疾患の幹細胞療法はまだ初期の探索段階にあります。1つの大きな問題は、脳内にSCまたはNSCを十分に送達するための確立された方法が存在しないです。

外因性SC/NSCは、静脈内(IV)、腹腔内(IP)または脳内注射に続く脳内で検出することができるが、各送達アプローチには欠点がある。脳内の検出可能な集団は、末梢注射(IVまたはIP)で非常に低いと推定され、注入または注入された細胞のほんの一部を表す。脳内注射は非常に焦点的な分布を生じ、脳損傷を直接誘発する可能性があります2,6,7,8,9,10,11,...

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謝辞

この研究は、LCのAHA賞14SDG20480186、中国医学大学2019-QN07のBZの主題イノベーションチーム、KESとLCのためのケンタッキー脊髄および頭部外傷研究信託助成金14-12Aによって支えられた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20Gニードルベクトン&ディキンソンBDプレシジョングライド305175注射カテーテル
26Gニードルの準備ベクトン&ディキンソンBDプレシジョングライド305111注射カテーテル
の準備27Gニードルベクトン&ディキンソンBD PrecisionGlide 305136注射カテーテルの調製
4-0 NFS-2 針付き縫合ヘンリー・シャイン アニマルヘルス56905手術
6-0 ナイロン縫合テレフレックス/ブレインツリー サイエンティフィック104-s手術
アキュターゼSTEMCELL Technologies7922細胞剥離ソリューション
ブレードバード・パーカー10手術
Buprenorphine-SR LabZooPharmBuprenorphine-SR Lab®鎮痛剤(0.6-1 mg / kgを3日以上)
カルシウム/マグニサムフリー PBSVWR02-0119-0500NSC 解離
DCX 抗体ミリポアAB2253免疫染色
GFAP 抗体Invitrogen180063免疫染色
イソフルランヘンリー・シャイン アニマルヘルス50562-1手術
マウス用MCAOフィラメントドッコール702223PK5Re手術
ラット用MCAOフィラメントDoccol503334PK5Re手術
MRE010カテーテルBraintree ScientificMRE010注射カテーテルの調製
MRE025カテーテルBraintree ScientificMRE025カテーテルの調製
MRE050Braintree ScientificMRE050
Nu-Tearsの調製軟膏ニューライフファーマシューティカルズ ニューティアーズ 軟膏手術中のアイケア
S&T鉗子 - SuperGripチップJF-5TCアングルファインサイエンスツール00649-11手術
S&T鉗子 - SuperGripのヒント JF-5TC ストレートファインサイエンスツール00632-11手術
瞬間接着剤ペーサー技術15187注射カテーテル
シリンジポンプケントサイエンティフィックGenieTouch手術
Tuj1 抗体ミリポアMAb1637免疫染色
2 成分 5 分間エポキシDevcon20445注射カテーテルの準備
バンナス スプリングハサミファインサイエンスツール15000-08手術
血管クランプファインサイエンスツール00400-03手術
ツァイス顕微鏡ツァイスアクシオイメージャー 2顕微鏡
糸 注射カテーテル 注射カテーテルの準備

参考文献

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