脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

Summary

Ex vivo脳スライスは、求心性入力に対する誘発反応に対する揮発性麻酔薬の効果を研究するために使用できます。光遺伝学は、視床皮質および皮質皮質求心性神経を非原発性新皮質に独立して活性化するために使用され、シナプスおよびネットワーク応答はイソフルランで調節されます。

Abstract

麻酔薬は、視床皮質回路に対する作用を介して意識に部分的に影響を及ぼします。しかし、揮発性麻酔薬がこれらの回路の明確な細胞およびネットワークコンポーネントにどの程度影響を与えるかは不明のままです。生体外脳スライスは、研究者が複雑なネットワークの個別のコンポーネントを調査し、誘発された反応に対する揮発性麻酔薬の影響の根底にある潜在的なメカニズムを解きほぐす手段を提供します。脳スライス中の潜在的な細胞タイプおよび経路特異的薬物効果を分離するには、研究者は求心性線維経路を独立して活性化し、重複しない細胞集団を特定し、揮発性麻酔薬を水溶液中の組織に適用できなければなりません。このプロトコルでは、ex vivo脳スライスにおける新皮質への2つの独立した求心性経路に対する光遺伝学的に誘発された応答を測定する方法が記載されている。細胞外応答はアッセイネットワーク活性に対して記録され、標的全細胞パッチクランプ記録はソマトスタチンおよびパルブアルブミン陽性介在ニューロンで行われます。細胞およびネットワーク応答を調節するための人工脳脊髄液を介した生理学的に関連する濃度のイソフルランの送達が記載されている。

Introduction

揮発性麻酔薬は、1世紀以上にわたってさまざまな臨床および学術環境で遍在的に使用されてきました。異なるクラスの麻酔薬は、独特の、しばしば重複しない分子標的^1,2,3を持っていますが、それらのほとんどすべてが無意識を生み出します。それらの行動効果は非常に予測可能ですが、麻酔薬が意識喪失を誘発するメカニズムはほとんど知られていません。麻酔薬は、皮質視床回路上の作用を介して意識のレベルと内容の両方に最終的に影響を及ぼし、皮質階層全体の情報の統合を混乱させる可能性があります4,5,6,7,8,9。より広義には、コルチコ視床回路の調節は、実験的に10または薬理学的^に11の変化した意識状態において役割を果たす可能性があり、睡眠12および意識の病態生理学的障害^13,14にも関与し得る。

麻酔中の意識の喪失と回復の根底にあるメカニズムのとらえどころのないことは、細胞、ネットワーク、およびシステムレベルでの麻酔薬の非線形の相乗作用に部分的に起因する可能性があります¹⁵。イソフルランは、例えば、選択された脳領域16、¹⁷、18内の活動を抑制し、遠隔脳領域¹⁹、20^、21、22、23間の接続性を損ない、経路特異的な様式でシナプス応答を減少させる^24、25。.分子レベルからシステムレベルまで、麻酔薬のどの効果が意識喪失をもたらすために必要または十分であるかは不明である。非侵襲的技術を用いた意識の実質的な臨床調査^19,20,26に加えて、実験家が意識的経験に従属する明確な細胞およびネットワークの相互作用を解きほぐそうとすることが重要です。

無傷の脳に見られる複雑な相互作用を単純化することにより、ex vivo脳スライスは、脳の動的システムの孤立した構成要素の研究を可能にします⁹。縮小スライス調製は、局所神経回路の比較的無傷の解剖学的構造の利点とin vitro操作の多様性を兼ね備えています。しかし、最近まで、方法論的制約により、脳スライスにおける長距離入力のシナプスおよび回路特性の研究が妨げられていました^27,28。コルチコ視床線維路の曲がりくねった経路は、電気刺激によって独立した求心性経路の活性化をほとんど不可能にしました。

脳スライス製剤に対する麻酔薬の効果を調査することは、さらなる課題を提示する。無傷の呼吸器系および循環器系がない場合、麻酔薬を入浴させ、濃度を推定効果部位の濃度に注意深く一致させる必要があります。.多くの静脈内麻酔薬にとって、組織内の平衡化速度が遅いため、従来の薬理学的調査は面倒です^29,30。ex vivo製剤中の揮発性ガス麻酔薬の効果を調査することは、より扱いやすいですが、課題もあります。これらには、吸入分圧用量を水性濃度に変換すること、および人工脳脊髄液³¹を介した組織への薬物の修正送達システムの必要性が含まれる。

ここでは、研究者が揮発性麻酔薬イソフルランの十分に文書化された物理化学的特性を利用して、ex vivo脳スライスへの薬物送達を行い、高い時空間分解能で皮質領域への経路および層特異的入力を活性化し、同時に実施する方法について説明します 層流記録と標的パッチクランプ記録 ニューロンの選択された集団から。これらの手順を組み合わせることで、研究者は、シナプスレベルからローカルネットワークレベルまで、いくつかの観察可能な電気生理学的応答特性における揮発性麻酔薬誘発性の変化を測定できます。

Protocol

このプロトコルに記載されている動物を含むすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン医学部および公衆衛生動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 介在ニューロン亜集団で蛍光レポータータンパク質を発現させるマウスの繁殖

1. ホモ接合性のCre依存性tdTomato雄マウスを、ホモ接合型SOM-Cre雌マウスまたはホモ接合型PV-Cre雌マウスのいずれかとペアにします。
   注:他の特定のニューロン集団は、適切なCreラインを使用して標的にすることができます。
2. 先に進む前に、ヘテロ接合性の子孫を少なくとも3週齢まで成熟させます。ここで説明する実験では、ホモ接合性の親が細胞型特異的なCreリコンビナーゼとCre依存性レポーター対立遺伝子の両方に対してすべてヘテロ接合性の子孫を産生するため、ジェノタイピングは必要ありません。

2. ウイルス構築物の片側定位固定装置注射の実施

1. 機器のユーザーマニュアルに示されているように、インジェクションピペット用のマイクロピペットプーラーの設定を調整します(推奨設定については 表1 を参照してください)。ガラスマイクロピペットを引きます。
2. ピペットの鋭い端の先端を、先端の直径が約30μmになるように破り、数ミリメートルにわたって最小限のテーパーで切断します。
3. 以前に文書化された手順を使用して、注入するウイルスの適切な力価と量を決定します。ここで説明する実験では、1.0 μL(力価:3.1-5.7 TU / mL)を片側に注入すると良好な結果が得られました。
4. ピペットの全容量を鉱油で埋め戻します。ピペットをマイクロシリンジにロードし、チップに少量の鉱油を流して、チップが詰まらないようにします。
5. 少なくとも1.0 μLのウイルス構築物をフロントフィルします。これらの実験で使用された組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFPでした。
6. 手術部位に滅菌ドレープを配置します。定位固定装置のための道具を滅菌し、それをドレープの上に置きます。
7. イソフルラン(誘導用に3%、維持用に1.5〜2%)および酸素混合物を使用して、SOM-tdTomatoまたはPV-tdTomatoヘテロ接合動物を麻酔します。.手術中は、つま先をつまんで麻酔の手術レベルを定期的に確認してください。10〜15分ごとに呼吸を監視することにより、動物が麻酔の手術計画を超えないようにします。
8. 動物の頭のてっぺんを剃ります。70%イソプロピルアルコールとヨウ素ベースの溶液を手術領域にたっぷりと塗布し、眼窩に眼軟膏を塗布して、膜の乾燥を防ぎます。ブピバカイン/リドカイン(1:1の比率、1.0 mg / kg)を局所麻酔の手術部位に皮下投与します。.
9. 動物を定位固定装置フレームに合わせます。
10. メスを使用して、頭蓋骨の背側表面を覆う皮膚の矢状軸に沿って切開します。鉗子を使用して皮膚を引っ込めます。必要に応じて0.9%生理食塩水で頭蓋骨を水和させます。
11. 頭蓋骨の表面に、前方座標と側面座標の交点を鉛筆で十字で軽くマークします。横面の適切な座標に穴を開けます(ブレグマに対するmm単位、帯状皮質(Cg)注射の場合:前部0.2、外側0.3、視床後(Po)注射の場合:後部2.25、外側3.4)。
    注意: マーキングは、ピペットを正確に配置するためのガイダンスを提供するために、バリ穴の境界を超えて伸びる必要があります。
12. エアテーブルの電源を入れてバランスを取ります。
13. 定位固定装置フレームの電極マニピュレータを、Cgへの注入の場合は0°、Poへの注入の場合は冠状面の45°に再配置します。
14. シリンジポンプを電極マニピュレーターに取り付けます。マイクロシリンジポンプコントローラーをシリンジポンプに取り付けます。
15. ステップ2.11で作成したマーキングの交点で、脳の表面の近く(ただし触れない)のピペットチップをナビゲートします。ピペットを縦軸に沿って約1 mm/sで脳内に0.9 mm(Cg単位の注射)または3.1 mm(Po単位の注射)で進めます。続行する前に10分待ちます。
16. 1.0 μLのウイルスコンストラクトを10分間(100 nL/分)注入します。ピペット挿入部位からのウイルスのウェルが観察された場合は、注入速度を50 nL/minに遅くします。
17. 注入後、10分間待ってから、注射ピペットをゆっくりと引っ込めます。
18. 頭皮切開部を閉じるために縫合し、2〜5 mg / kgのメロキシカムを皮下投与します。.
19. イソフルランを中止し、麻酔から出てくる間に動物を監視します。.鎮痛薬のさらなる投与を含む、施設の動物管理および使用委員会によって説明された手順に従って回復することを許可します。.

3.急性脳スライスの調製

1. 組織を採取する前に、ウイルス構築物の発現に少なくとも3週間かかります。
2. スライス手順(人工脳脊髄液、sACSF)のスライスのために1Lの人工脳脊髄液を準備します。成分については 表2 を参照してください。
3. スライス手順全体を通して、溶解した95%_O2/5%_CO2 混合物をsACSFに供給し、ガス分散管を介して送達する。
4. 振動ブレードミクロトーム用の氷冷浴を準備します。氷のように冷たい試料ステージをミクロトームに取り付け、サファイアブレードを所定の位置に固定して組織切片を作成します。
5. 右反射が失われるまで、3%イソフルランと酸素でマウスを麻酔します。.
6. ギロチンを使用してマウスを断頭し、直ちに頭部を4°C sACSFに沈めます。組織の健康を維持するために、次の手順をできるだけ早く完了してください。
7. 頭蓋骨の付け根に小さな切開を行い、各頭蓋骨プレートをそっと取り外して、頭蓋骨の空洞を開きます。下にある硬膜をそっと取り除きます。
8. 脳がまだ頭蓋骨腔内にある間に、かみそりの刃を使用して小脳を取り除きます。左半球の矢状面に沿って、正中線のすぐ横方向に2番目の垂直カットを行います。
9. 切片作成用の組織ブロックを準備します。
   1. 頭蓋骨腔から脳をそっと持ち上げます。平らな矢状面を下にして、脳をろ紙の上に置きます。ろ紙をブロッキングテンプレートの上に導き、脳を下にあるテンプレートのアウトラインに合わせます(補足図1)。
   2. テンプレート上の線で示されているように、冠状平面に2つの平行なカットを作成します。必要に応じて、ろ紙を濡らしておくためにsACSFを少量加えます。
   3. ステップ3.8.4を実行している間、組織ブロックを4°C sACSFに短時間置きます。
   4. 氷のように冷たい試験片の段階に少量の瞬間接着剤を塗布します。
   5. 冷たいsACSFからティッシュブロックを持ち上げます。吸収性タオルの角を使用して、余分なsACSFを吸い取ります。組織ブロックの後冠状面を標本ステージに接着し、脳の背側表面をサファイアブレードに向けます。
10. 厚さ500μmの冠状脳スライスを収集します。目的のスライスを34°CのsACSF中のナイロンメッシュ(補足図2)に置き、容器を室温になるまで待ちます。
    注:ここで説明する実験では、電気生理学的記録をブレグマの後方約2.25 mmを中心とした冠状切片から収集し、非一次感覚領域である内側二次視覚野(V2MM)を研究しました。

4.揮発性麻酔薬イソフルランを溶解した実験用人工脳脊髄液(eACSF)バッグの調製

1. 3.0%イソフルランのストック混合物300 mLを準備します。
   1. 密封されたポリテトラフルオロエチレンガスバッグに、~100 mLの95%O₂/5%_CO2 ガス混合物を20〜30 mLの液体イソフルランと少量の0.9%生理食塩水に加えます。液相と気相の間でイソフルランを平衡化できるように、少なくとも30分間待ちます。.
   2. 次の式を使用して、ストックバッグに追加する飽和イソフルランガスの量V_satを決定します。
      
      ここで、P%_stock はストックガスの目標組成(この場合は3%)、Vストックは_ストック ガスバッグの最終容量、Pイソフルランは室温での_{イソフルラン} の分圧(~240mmHg)、_Ptotal は大気圧(~760mmHg)です。
   3. 計算された量の飽和ガスを空のガスバッグに加え、バッグに95%O₂/5%_CO2 ガス混合物の容量を充填して、ストックバッグの総容量を300mLにします。
2. 実験中にスライスの灌流のために2 Lの人工脳脊髄液を調製します(実験的ACSF、eACSF)。成分については表2を参照してください。95%O 2/5%CO₂ガス混合物を溶液に溶解する。
3. コントロール溶液とイソフルラン溶液の2つの別々のバッグを準備します。
   1. 空のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに、600 mL eACSFと600 mLの95%O 2/5%CO₂ガス混合物を追加します。このバッグにコントロールのラベルを付けます。
   2. 別の空のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに、300mLのeACSFを追加します。このバッグにイソフルランのラベルを付けます。.
   3. イソフルランの生理学的に関連する平衡化気相濃度を選択してください。実験は、1.3%イソフルランに相当するガス濃度を用いて行った。マウスは、イソフルランを0.9%吸入すると、右反射、およびおそらく意識を失う。
   4. 次の式を使用して、室温での等価気相濃度P%(T_室)³¹を計算します。
      
      ここで、P%(T_体)はステップ4.3.3で選択された生理学的に関連する気相濃度であり、T_ルーム は25°C、T_体は 37°Cです。
   5. 次の式を使用して、ストックガスバッグV_ストックからイソフルラン溶液に追加するガスの量を決定します。
      
      ここで、V_溶液 はイソフルランバッグ(300 mL)中のeACSFの容量、P%(T_室)は式(2)から入力され、λはイソフルランの生理食塩水/ガスオストワルド分配係数(λ= 1.2³²)、P%_stock はストックガスバッグの気相濃度(P%_ストック = 3.0%)です。
   6. イソフルラン溶液バッグに、ステップ4.3.5で計算されたストックガスバッグからのガス量V_ストックを追加します。
   7. イソフルラン溶液バッグに、95%O₂/5%_CO2 混合ガス混合物を添加して、イソフルラン溶液バッグ内のガスの総体積を300mLにする。
4. コントロールバッグとイソフルランバッグの両方をシェーカーで少なくとも1時間振って、イソフルラン相平衡化を可能にします。
5. すべてのデータが収集された後、麻酔ガスモニターを使用して、バッグ内の残りの溶液を超えるイソフルランの平衡ガス濃度を測定することにより、正しい濃度を確認できます。.
6. ミリモル濃度は温度変化に対してより堅牢であるため、水性ユニット内の揮発性ガスの実験濃度を報告します。次の式を使用して、室温の気相濃度P%(T_室)を同等の水濃度(C_水系、単位:mM)³¹に変換します。
   
   ここで、αは25°Cでのイソフルランの生理食塩水/ガスブンゼン分配係数^です32。

5.マルチチャンネル録音用のハードウェアとソフトウェアの準備

1. 製造元の指示に従って16チャンネルデータ収集システムをセットアップします。
   メモ: 市販のアンプやデータ収集システムをいくつか使用して、マルチチャンネル録音を収集できます。ここで説明する実験では、アナログ信号は電極リファレンスパネルを介して2つのアンプに送られ、そこで増幅(2000倍)され、フィルタリングされます(0.1〜10kHz)。データ収集システムへのアナログ入力は40kHzでデジタル化されます。
2. 適切な16チャンネルヘッドステージアダプターを顕微鏡マイクロマニピュレーターに固定します。メスコネクタポートが下を向くようにアダプタを向けます。
3. このマイクロマニピュレーターの動作角度を、水平に対して約70°の角度で、記録チャンバーに向かって下向きになるように調整します。
4. マイクロマニピュレーターに固定されたヘッドステージアダプターを介して、ヘッドステージ入力をin vitro電気生理学用の16 x 1プローブに接続します。
5. ヘッドステージ出力コネクタをデータ収集システムに接続します。
6. データ集録に適したソフトウェアをインストールします。最初の15個のマルチチャンネルプローブ接点からの入力信号に対応するように15個の入力チャンネルを設定します。残りのチャネルを、細胞内電極からの入力を受信するように構成します。
   注意: データを収集および分析するときは、適切な信号が収集された電極接点に対応していることを確認するために、電極とアダプターのマップを考慮するように注意してください。

6.光刺激プロトコルの構成

1. 光配信システムをセットアップし、付属のソフトウェアをインストールします。
2. ソフトウェアを開きます。トリガーソース(デジタル/ TTL出力)がライトデリバリーシステムにトリガー入力信号を提供し、ライトデリバリーシステムがトリガー出力信号を470nmLEDに提供するハードウェア配線構成を選択します。
3. 高出力対物レンズを取り付けます。デジタルカメラを使用して、光配信システムで使用するために高出力対物レンズを校正します。
4. 光刺激プロファイルの新しいプロファイルシーケンスを作成します。
   1. 選択したパターンを作成します。ここで説明する実験では、軸索終末の層特異的活性化を可能にするために直径150μmの円が使用されます。
   2. プロファイルシーケンスを作成するには、任意の数の試行ごとにこのプロファイルをコピーして貼り付けます。
   3. 任意の光強度、パルス持続時間、またはパルス数の波形を含む波形リストを作成します。
   4. 各プロファイルに波形をランダムに割り当てます。割り当てられた波形を持つ各プロファイルは、デジタルTTL入力からの1つのトリガパルス、または1つの試行に対応します。
   5. プロファイル順序を保存します。
5. データ集録ソフトウェアで、新しいプロトコルを作成します。
   1. 試行回数を、作成したプロファイルシーケンス内のプロファイルの数と等しくなるように設定します。
   2. ステップ 5.6 で設定した信号入力と一致するように信号入力を選択します。単一のデジタルTTL出力を提供するプロトコルを構成し、デジタルトリガの前後の適切な時間、これらの16の入力チャンネルから記録します。

7.ex vivo脳組織スライスへのマルチチャンネルプローブの配置

1. 灌流はeACSF(密封されたバッグに入っていない)を3〜6 mL /分で泡立てました。
2. 関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバーのメッシュグリッドに移します。プラチナハープでアンカーします( 補足図3を参照)。
3. マルチチャンネルプローブの遠位端の電極接触線がパイアル表面にほぼ垂直になるようにメッシュグリッドを回転させます。
4. 広視野照明下で、マイクロマニピュレーターの微調整下で、マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げます。
5. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターキューブをかみ合わせ、皮質求心路の軸索末端に発現する蛍光レポータータンパク質を可視化します。必要に応じて、スライスを回転させて、プローブをパイアル表面により正確に位置合わせします。
6. プローブをスライスの平面のすぐ上に配置し、x軸に沿った最終的なターゲット位置の~200 μm手前に配置し、記録される組織の領域の境界の外側に少なくとも1つのチャネルを残します
7. マニピュレータを縦軸に沿って動かして、プローブをスライスにゆっくりと挿入します。組織への損傷を最小限に抑えるには、鋭い先端が組織表面の下に見える程度までプローブを進めてください。これにより、電極接点が組織と接触していることを保証しながら、組織への損傷を最小限に抑えることができます。

8. 標的ニューロンのパッチクランプと全細胞構成の取得

1. eACSF ソースを袋詰め制御ソリューションに切り替えます。
2. ターゲットパッチクランプ記録用の蛍光標識細胞を特定します。
   1. 絞りアイリスダイアフラムを最小直径に制限します。低倍率の対物レンズをかみ合わせ、組織に焦点を合わせます。
   2. マルチチャンネルプローブに隣接する(重ならない)組織の領域に光を集中させます。
   3. マルチチャンネルプローブと対物レンズが接触しないように注意しながら、高出力(40倍または60倍)の水浸対物レンズをかみ合わせます。
   4. フィルターキューブタレットを回転させて適切なフィルターセットをかみ合わせ、Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングを可能にします。
   5. 蛍光標識した細胞をパッチクランプ記録のターゲットとして同定します。対物レンズを上げて、パッチピペットを下げるための十分なスペースを作ります。
3. パッチピペット(表1を参照)に内部溶液(表2)をロードし、ピペットを電極ホルダーに取り付けます。1 mLシリンジを使用して、~0.1mLの空気に対応する陽圧を適用します。
4. パッチピペットを溶液に入れます。視覚的なガイダンスの下でピペットチップに焦点を合わせます。
5. 以前に実証された^{ステップ33}を使用して、標的細胞から全細胞記録を取得する。
6. セルの固有の特性(例えば、入力抵抗、現在のステップに応じた活動電位発火率)に対する変化を評価することを計画している場合は、これらの記録を実施してください。それ以外の場合は、以下の軸索刺激プロトコルに移動します。

9. 軸索終末の層特異的光遺伝学的活性化

1. x-y平面の視野を操作して、光刺激プロファイルをスライス上の目的の位置に合わせます。
2. 光刺激プロトコルをロードし、デジタルTTLパルスを受信するように光配信システムを準備します。
3. 軸索終末を光遺伝学的に活性化すると同時に、細胞外野電位と細胞内膜変動を記録する。
4. eACSFソースをイソフルラン溶液に切り替え、薬物を15分間洗浄します。必要に応じて、ウォッシュイン中に自発的な録音を収集します。
5. 手順9.2〜9.3を繰り返します。
6. eACSFソースをコントロール溶液に切り替え、20分間薬剤を洗い流します。必要に応じて、ウォッシュアウト中に自発的な録音を収集します。
7. 手順9.2〜9.3を繰り返します。

Results

プロトコルで説明されている手順のタイムラインを 図 1 に示します。高次皮質領域または非一次視床核から到着する皮質入力は、非一次視覚野²⁴の層1で部分的に重複する終末野を有する。独立した視床皮質または皮質皮質求心性経路を単離するために、ChR2およびeYFP蛍光レポーターを含むウイルスベクターをPoまたはCgのいずれかに注入した。注射半径内の細胞はウイルスベクターを取り込み、2〜4週間後、体細胞軸索と突出軸索の両方で非特異的陽イオンチャネルChR2とレポーターを発現します(図2A)。冠状スライスを採取した。適切なフィルターキューブを係合させて、ウイルス構築物を発現する軸索を画像化した(図2B)。ChR2を使用して軸索終末を活性化すると、付着した体細胞に前提条件がなくても求心性神経を活性化することができます。

ここで説明した実験で使用された動物は、SOM-td...

Discussion

この原稿では、ex vivo脳スライスにおいて選択的に活性化された求心性経路に対する細胞内および細胞外の応答を評価するためのプロトコルが記載されている。

光遺伝学的ツールと並列記録スキームの使用により、研究者は、遠隔脳領域からの求心性入力に対する局所集団の応答を調査し、同時に介在ニューロンの標的集団から記録することができます。光遺伝学的技術の使用は、求心性突起の軸索終末が、それらの細胞体がもはや付着していないにもかかわらず、保存され活性化されることを可能にする。これにより、以前は ex vivo スライスに課されていた幾何学的制限が緩和され、長距離電気接続の保存が最優先事項ではなくなります。それでも、関心のある残りの接続を保持する幾何学的平面でスライスを準備するように注意する必要があります。例えば、錐体細胞は皮質柱に沿って垂直に配向しており、これらの実験でマルチチャネルプローブによって測定された誘発ネットワーク活性は、そのような局所的な接続を可能な限り維持することを必要とする。したがって、コロナスライスは、局所的な接続性を損なわないように準備された。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5倍広視野対物レンズ	オリンパス	MPLFLN2.5倍
水浸対物レンズ	オリンパス	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 混合物	エアガス	Z02OX95R2003045
A16 プローブ	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16 チャネル プローブ
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	カール・ダイセロス研究所、ノースカロライナ州ベクターコア
麻酔ガスモニター(POET II)	Criticare	602-3A
ATP、マグネシウム塩	シグマアルドリッチ	A9187	細胞内溶液
B6。CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	ジャクソン研究所	007914	Cre依存性tdTomatoマウス
B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr / J	ジャクソン研究所	008069	PV-Creマウス
ベリーダンサーシェーカー	トーマスサイエンティフィック	1210H86-TS	密封ガスバッグの平衡化のための
タジン溶液	ジェネリックブランド
漂白剤	塩素化パッチクランプ電極
塩化カルシウム(CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
キャピラリーガラス(パッチクランプ録音)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	ホウケイ酸、ID:1.1mm、外径:1.7mm、長さ:90.0mm
キャピラリーガラス(ウイルス注射)	ドラモンドサイエンティフィック	カンパニー3-000-203-G / X	3.5"
ジュニアマイクロマニピュレーターLuigs	とNeumann	SM8	マイクロマニピュレーターの制御
ニピュレーターとシフトテーブルの制御	LuigsとNeumann	SM7	とシフトテーブル
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	デジタイザーとソフトウェア
E-3603 チューブ	フィッシャーサイエンティフィ	14171208	95% O2/5% CO2 ガス混合物をインキュベーションチャンバーに送達 + パッチクランプ中の圧力の適用
EGTA	ドットサイエンティフィ	DSE57060	細胞内溶液
ERP-27 EEG リファレンス/パッチパネル	Neuralynx	引退した
充填針	ワールド精密機器	パッチクランプピペットを充填するための	50821912
イメージング用フィルターキューブ EYFP	オリンパス	U-MRFPHQ
濾紙	フィッシャーサイエンティフィック	09801E	組織ブロックの準備中にスライステンプレートを横切る
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッター機器	P-1000	2.5x2.5 ボックスフィラメント
ガス分散管	Sigma Aldrich	CLS3953312C
ガラスシリンジ (100 mL)	Sigma Aldrich	ガスシール袋充填	用Z314390
グルコン酸、カリウム塩 (K-グルコン酸)、	ドットサイエンティフィ	DSG37020	細胞内溶液
グルコース	ドットサイエンティフィック	DSG32040	ACSF
GTP、ナトリウム塩	シグマ アルドリッチ	G8877	細胞内溶液
ヘッドステージプローブアダプター	NeuroNexus	A16-OM16	アダプター 16 チャンネルプローブをヘッドステージ入力に接続するための
止血鉗子	VWR インターナショナル	76192-096
HEPES	ドット サイエンティフィック	DSH75030	ACSF、細胞内ソリューション
HS-16 ヘッドステージ	ニューラリンクス	引退した
イソフルラン	パターソン獣医	07-893-1389
イソプロピルアルコール(70%)	VWRインターナショナル	101223-746
ジュニアマイクロマニピュ	レーターLuigsとNeumann	210-100 000 0090-R	パッチクランプ電極の操作用
LED光源制御モジュール	MightexBLS-PL02_US		光遺伝学的光源制御
リドカイン
Lynx-8 アンプ	ニューラリンクス	リタイア
Lynx-8 電源	ニューラリンクス	リタイア
硫酸マグネシウム (MgSO4)	ドット サイエンティフィック	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas レッド フィルター キューブ	Chroma	49008	イメージング用 tdTomato 蛍光レポーター
メロキシカム
マイクロピペットホルダー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9044962
マイクロシリンジポンプ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	UMP3-4
鉱物油	ジェネリックブランド
マルチクランプ 700A	モレキュラーデバイス/アクソンインスツルメンツ	700A	アンプ
窒素(エアテーブル用)	エアガス	NI200
ナイロンメッシュ	フィッシャーサイエンティフィ	501460083	平らにされたプラチナワイヤーの馬蹄形に伸び、録音中にこの上にスライスレスト
、パンストからカット	イン	キュベーションチャンバーでスライスプラットフォームを作成するための
眼科軟膏	ッシャーサイエンティフィ	NC1697520
ピペット	を作成するための単一繊維ドットサイエンティフィック	307	プラチナ
ワイヤーVWRインターナショナル	BT124000	2センチメートル、平らに、プラチナハープ
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	光遺伝学的光送達システムを作るために、ポリスキャン2ソフトウェアが付属しています
塩化カリウム(KCl)	ドットサイエンティフィック	DSP41000	ACSF
リン酸カリウム(KH2PO4)	ドットサイエンティフィ	DSP41200	ACSF
カミソリ刃	フィッシャーサイエンティフィック	12-640
サファイアブレード(ビブラトーム用)	VWRインターナショナル	100492-502
メスブレード	サンタクルスバイオテクノロジー株式会社	sc-361445
密封されたガスバッグ	フィッシャーサイエンティフィ	109236
LuigsおよびNeumann380FMU
重炭酸ナトリウム(HCO3-)	ドットサイエンティフィック	DSS22060	ACSF
塩化ナトリウム(NaCl)	ドットサイエンティフィック	DSS23020	ACSF、細胞内溶液
Ssttm2.1(cre)Zjh / J(SOM-IRES-CRE)	ジャクソン研究所		013044 SOM-Cre マウス
脳定位固定装置	Kopf	モデル 902	デュアル小動物
用瞬間接着剤	ステープル	886833	スライス準備中に組織ブロックを標本ステージに固定します
サージカルドリル	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
シリンジ (1 mL) LuerLock チップ付き	パッチクランプ時の圧力適用用	フィッシャーサイエンティフィック	309628
スリップチップ付きシリンジ (1 mL)	WW Grainger, Inc.	パッチクランプピペットを充填するための	19G384
シリンジフィルター	VWRインターナショナル	66064-414
直立顕微鏡	オリンパス	BX51
振動ミクロトーム	ライカバイオシステム	ズ VT1000S
ワイポールタオル	フィッシャーサイエンティフィック	19-042-427