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方法論記事

円錐髄質断面によるラットの排尿筋活動不足モデル

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DOI：

10.3791/61576

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2020年8月28日

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1Department of Urology, Beijing YouAn Hospital, Capital Medical University, 2Department of Urology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ラットにおける円錐髄膜剥離による排尿筋活動低下モデルを確立する方法を提示する。排尿筋活動低下は、これらの動物において首尾よく刺激された。このモデルは、尿路機能の研究に使用できます。

要約

提示されたプロトコルの目標は、円錐髄膜剥離を通じてラットの排尿筋活動低下(DU)モデルを確立することでした。体重200〜220 gの雌Wistarラット40匹(対照群:10匹、試験群:30匹)で椎弓切除術を行い、試験群では髄膜円錐をL4〜5レベルで切除しました。全てのラットを同じ環境条件下で6週間飼育し、給餌した。試験群では、排尿を1日2回6週間行い、平均残尿量を記録した。膀胱メトログラムは両方のグループで実施されました。最大膀胱測定容量(MCC)、排尿筋開口圧(DOP)、および膀胱のコンプライアンスが記録され、計算されました。試験群は、脊髄ショック中および手術後の両方で、手術後に有意な尿閉を示した。しかし、対照群に異常は認められなかった。対照群と比較した場合、試験群のMCCおよび膀胱のコンプライアンスは試験群よりも有意に高かった(3.24 ± 2.261 mL 対 1.04 ± 0.571 mL;0.43 ± 0.578 mL/cmH 2 O 対 0.032 ± 0.016 mL/cmH 2 O)、試験群のDOPは対照群よりも低かった(20.28 ± 14.022 cmH 2 O vs 35 ± 13.258 cmH2円錐髄膜解離によってDUの動物モデルを確立するこの方法は、DUの病態生理学をよりよく理解する絶好の機会を提供します。

概要

排尿筋活動低下症(DU)は、研究が続けられている典型的な下部尿路機能障害である。DUは国際排泄学会(ICS)1によって定義されていますが、この病気を指すために、「排尿筋不全」、「収縮性膀胱」、「排尿筋性反射症」2など、さまざまな用語が使用されています。2002年に国際禁制学会(ICS)によって定義されたDUは、強度と持続時間の低下の収縮であり、その結果、膀胱が排出される時間が長時間増加し、それによって通常の期間内に完全な膀胱排出を達成できなくなります。

DUは、男性の48%、女性の12%(>70歳)3 に、尿路症状が下がる可能性がある。それは多因子性のようであり、効果的な治療法は存在しません。DUは、多発性硬化症4、糖尿病5、パーキンソン病6、脳脳卒中7などの神経因性膀胱機能障害の患者に遍在していることが報告されています。DUは、腹腔鏡下子宮摘出術、前立腺全摘除術、または小骨盤8の他の外科的介入などの医原性神経損傷によっても引き起こされる可能性があります。DUの病態生理学の変化と利用可能な治療法は、研究に適した動物モデルがないため、依然として混乱しています。

排尿反射は、橋排尿中枢、仙骨副交感神経核、およびより上級の皮質中枢を組み合わせた脊髄球脊髄経路によって制御されています9。排尿反射の活性化と維持は、主に膀胱からより上級の皮質センターへの感覚信号の定期的な輸送に依存します。感覚機能障害がDUに寄与すると仮定することができます。

下部尿路機能障害に関連するほとんどの実験動物研究は、過活動膀胱(OAB)モデルに焦点を当てています10。これらのモデルは、OABの病態生理学および予後の合理的な理解を提供する。しかし、報告されているDUモデルはごくわずかであり、例えば、脊髄上損傷(局所病変、衰弱、および中大脳動脈閉塞)、脊髄切断または挫傷損傷、全身性(例:.、シクロホスファミド)または膀胱内投与刺激性または炎症性薬剤(例:.、酸、アクロレイン、およびリポ多糖)11,12,13,14。.これらの方法のうち、DU13の動物モデルを確立する際に使用できるのは、脊髄離断法または挫傷損傷法のみである。橋排尿センターと高次皮質センターの損傷を伴う試みは、重度の外傷のために放棄されました。そのため、排尿反射中枢の正確な位置を見つけて、最小限の副作用でDUを誘発することにますます注意が払われています。

前述のように、DUを誘導するメカニズムの1つは、脊髄を傷つけて排尿反射のシグナル伝達経路を損傷することです。アレンの体重減少法は、脊髄損傷を有する実験動物を確立するために開発された15。ただし、この方法に関するこれ以上の実験データはありません。さらに、動物の一部はDUなしで脳卒中後に脊髄機能を回復したので、DU動物モデル16を生成するための完全な方法とは考えられない。

1987年、ブレグマンはDU動物モデルを生成するために脊髄を切断するプロセスを解明し、実験データ17を取得しました。それにもかかわらず、この方法はDU動物モデルを確立するために適用されなかった。当時、研究者たちはまだDUの病因について混乱していました。OABまたはDUの誘導に関連する脊髄内の位置は互いに隣接しているため、DU17を誘導するための脊髄の損傷部位を正確に見つけることができませんでした。OABとDUは、この方法で一緒にまたは別々に導入されました。そのため、この方法はDUを導入しましたが、不正確であり、DUの発生と処理の理解には使用できませんでした。

上記のように、DUの適切な動物モデルの欠如は、DUの研究の主な障害の1つです。 研究者は、DUの病理をシミュレートできる正確で管理しやすいモデルを継続的に探しています。DUの治療選択肢でさえ、過去20年間に大幅に改善されていません。まとめると、DUの動物モデルを確立するための標準プロトコルを記述することが大いに必要とされている。

そこで本稿では、円錐髄郭清によりDUのラットモデルを首尾よく確立する方法について述べる。円錐髄質を分離するためにL4〜5レベルで切断を行った。最大膀胱測定容量(MCC)、排尿筋開放圧(DOP)、および膀胱のコンプライアンスを記録および分析して、プロトコルを検証しました。以下に述べるプロトコルは、実現可能性と信頼性の両方を標準化された方法で組み合わせて、DU動物モデルを確立し、DUの発生と処理をシミュレートします。このプロトコルは、DUのさらなる研究のための技術として使用することができる。

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プロトコル

すべてのラットは、首都医科大学北京友好病院の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されました。

1.外科的準備、麻酔、および外科的技術

注:本研究では、体重200〜220 gの合計40匹の雌のWistarラットが商業的に入手されました。40匹のラットのうち、10匹を対照群として無作為に選択し、残りを試験群として治療した。すべての動物は、首都医科大学北京友好病院の動物施設の無菌環境に収容されました。

  1. ペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与して全身麻酔を行います(40 mg / kg)。.あるいは、3%〜4%のイソフルランを使用して麻酔を誘発し、1%〜3%(吸入)に維持する。乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。次に、ラットを手術プラットフォームに置き、熱サポートを提供します。
    注:手順の開始時に、ブプレノルフィン、0.05 mg / kg、SC、0.1〜0.2mLなどの鎮痛薬を投与します。
  2. つま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。かみそりで背中全体から毛皮を剃ります。
  3. クロルヘキシジンやポビドンヨードなどの2段階のスクラブとそれに続くイソプロピルアルコールで少なくとも3サイクルの手術部位を滅菌します。手足をサージカルテープで固定し、手術用ハサミで背中の中央値約3cmを切開します。
  4. 外科用ハサミを使用して皮下組織を通して切開を深くし、脊椎に付着した筋肉を切り落とします。
  5. 13番目の 肋骨を視覚的に識別して露出させます(その肋骨に接続されている椎間腔は間隔T13\u2012L1です)。縫合糸を使用して13番目の 肋骨に印を付けます。
  6. 識別後、脊椎に付着した筋肉を注意深く切除し、脊柱を露出させます。脊柱を正確に識別するために、棘上靭帯と棘間靭帯を切除します。外科用ハサミと鉗子でL4〜L5のレベルを公開します。
    注:棘上靭帯は、薄い皮下組織が存在するため、簡単に識別できます。棘上靭帯の切除後、棘突起間の靭帯は棘間靭帯である。
  7. ケリー鉗子を使用して、L4〜5椎骨棘突起と横突起の一部を慎重に解剖し、脊髄を露出させます(図1)。
  8. 円錐髄をL4〜L5レベルで完全に露出させ、円錐髄錐を虹彩切除ハサミで完全に横断します。脊髄の回復をブロックするために、組織パッキングを挿入します。
  9. 4-0非吸収性縫合糸を使用して、外側の皮膚層の上に横たわる筋肉と皮膚を閉じます。
  10. コントロールグループについては、手順1.1〜7を実行し、円錐髄をそのまま残します。ステップ1.9に従って切開部を閉じます。

2.動物の回復

  1. 術後最初の1時間はラットを温度管理されたインキュベーター(37°C)に入れ、胸骨または活発に動くまで監視します。
    注:完全に回復するには約30分かかります。
  2. 動物を十分な食物と水の入った清潔なケージに移します。ラットを別々のケージに入れてください。
    注:切断の成功は、テストグループのラットが前足の助けを借りてのみ動くのに対し、コントロールグループのラットは正常に歩くことができた場合に示されます。

3. 運用後管理

  1. 抗生物質であるペニシリンG(動物あたり50,000 U / mL)を腹腔内に注射します。.術後48時間、ブプレノルフィン、0.05 mg / kg、SC、0.1〜0.2 mLなどの鎮痛薬を6〜12時間ごとに投与します。.
  2. 排尿を助けるために下腹部で膀胱を圧迫します。これを1日2回、同時に(午前8時と午後8時)6週間実行します。
    注:排尿筋の正常な狭窄の喪失は、DUの象徴です。
  3. すべてのラットを代謝ケージに入れ、それぞれに尿収集漏斗を事前に計量した吸収紙の上に置き、排尿と失禁を監視します。
  4. 排尿量(VV)を示す吸収紙の重量変化と残留尿量を別々に収集してメモします。

4.尿流動態検査

  1. 術後6週間で、以下のように尿流動態測定装置を用いて膀胱鏡検査を行う。
    1. 10%抱水クロラールを腹腔(3 mL / kg)に注射してラットを麻酔します。.
    2. 排尿のために膀胱を圧縮し、次にテープを使用してラットを手術プラットフォームに固定します。
    3. 硬膜外カテーテル(3F)を膀胱に挿入し、尿流動態測定装置、硬膜外カテーテル、輸液ポンプを三肢チューブで接続します。
    4. 尿流動態測定のために生理食塩水を0.2 mL / minの速度でポンプで送ります( 材料の表を参照)。MCCとDOP、および膀胱のコンプライアンス(膀胱容積δ排尿筋の圧力で割って計算δ記録します)。

5.統計分析

  1. 市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
  2. コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、データの正規性を検定します。
  3. 正規分布変数を標準偏差の平均値で表します。両側対応のスチューデント のt検定を使用して、両方のグループの膀胱メトログラムのパラメーターを比較します。
    注: p < 0.05は、差に統計的有意性があることを示します。

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結果

円錐髄膜切開の全手順は、経験豊富な外科医によって45分以内に完了することができます。当研究室では、100例以上の円錐髄膜切開手術を行ってきました。成功率は、ラットの生存率とDUの誘導の成功によって定義されるように、95%以上です。尿流動態検査によりDUの誘導が確認された。

我々の経験に基づいて、DUの誘導は、残留尿量によって事前に評価することができます。尿の貯留は手術直後に観察されました。試験群では術後2日目に体積のピーク点が現れ、体積の減少は約10日間徐々に持続した。術後10日で容量は安定したレベルに達しました(図2)。術後10日間は平均残尿量が2.09 ± 1.05 mLであったが,術後10日目には 0.67 ± 0.21 mLに減少した。しかし、対照群に異常は認められなかった。

DUの誘導を確認するには、尿流動態検査を実施する必要があります。試験群と対照群の代表的な圧力体積プロファイルを図3

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ディスカッション

DUは、男性と女性の両方の下部尿路症状の一般的な原因です。これは、影響を受けた人々の生活の質(Qol)を大幅に低下させる可能性のある治療オプションがほとんどない複雑な症状の星座です18。DUは多因子性であると考えられているが、その病因の理解は初歩的なままである。研究によると、DUの病因は筋原性および神経原性の要因に関連している可能性があります。

筋原性仮説では、DUの人は健康な老化の人よりも排尿筋収縮性の有意な低下を経験する可能性があることが観察されました。排尿筋収縮性は年齢とともに低下し、おそらく代謝性疾患や神経原性疾患などの他の要因の影響を受けていることがわかりました。尿流動態評価からのデータは、DUおよびボイド後の残留物が19歳の老化と関連していることを示した。ある研究によると、男性の22.1%と女性の10.8%(すべて60歳>)が膀胱排出の困難を報告しました3。さらに、この主な原因は、排尿筋の収縮性の低下でした。糖尿病性膀胱の研究で...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%生理食塩水武漢Prosai CompanyEY-C1178ポンプ尿力学測定用
10%クロラール水和物山東裕龍有限公司H370226733mL / kg、腹腔内投与
プレノルフィン塩酸塩注射天津製薬研究所製薬株式会社H120202750.05mg / kgを術後24時間および48時間皮下投与
硬膜外カテーテル山東興華有限公司VABR3L尿力学測定用
ペニシリンGアルタ技術有限公司1ST563750,000 単位/ml 動物あたり
ペントバルビタール北京ソラボ技術有限公司NK-WF000140 mg/kg、腹腔内
縫合ライン(4-0)エチコンVCP422H傷
害を縫合三肢チューブ山東興華有限公司VAB3T尿力学測定用
微量輸液ポンプ浙江スミス医療機器有限公司20162540335生理食塩水を0.2ml/分の速度で送液し、尿力学
測定用 尿力学測定装置Medical Measurement SystemsB.V.08-0467尿流動態測定器は、排尿障害の診断に役立つだけでなく、治療と治療効果のための客観的な材料を提供します。これは、下部尿路機能疾患の臨床診断と治療で最も一般的に使用される検査方法です
Wistar RatsHFK Biotechnology Co.Ltd,Beijing ,ChinaSCXK2012-0023200-220g
ブ

参考文献

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