方法論記事

OP-IVM:卵母細胞検索後の体外成熟と婦人科手術の組み合わせ

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DOI：

10.3791/61647

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2021年5月9日

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1Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction, Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproduction, 5Research Units of Comprehensive Diagnosis and Treatment of Oocyte Maturation Arrest, Chinese Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

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サマリー

婦人科手術前のインビトロ成熟(IVM)は、卵母細胞の検索に続くIVMと日常的な婦人科手術を組み合わせ、不妊治療の保存のための従来のIVMアプリケーションの延長として機能します。

要約

婦人科手術(OP-IVM)前のインビトロ成熟(IVM)の使用は、定期的な婦人科手術と卵母細胞の検索に続くIVMを組み合わせた従来のIVMの延長である。OP-IVMは、不妊治療(FP)または体外受精や胚移植(IVF-ET)などの不妊治療の必要性を有する良性婦人科手術を受けている患者に適しています。手術室では、良性婦人科手術を受けている患者は、最初に麻酔を受け、超音波誘導未熟卵性卵胞吸引(IMFA)治療を受ける。その後の婦人科手術が行われると、cumulus-oocyte複合体(COC)を検査し、未熟なCOCをIVM培地に移し、IVF実験室で28〜32時間培養する。評価後、MII段階の成熟卵母細胞を選択し、FP用の液体窒素中で凍結保存するか、IVF-ETの細胞質内精子注入(ICSI)によって受精する。IVMと婦人科手術を組み合わせることで、廃棄されたであろう未熟な卵母細胞を保存し、生殖補助技術(ART)に使用することができます。OP-IVM の手順、重要性、および重要な側面については、この記事で説明します。

概要

IVMは、ヒト未熟卵母細胞がIVF-ETまたはFPの成熟に向けて体外で培養されるARTである。IVMでは、排卵誘導薬は使用されず、痛み、経済的負担、卵巣過剰刺激症候群(OHSS)1、2などの合併症を軽減する。また、IVMは、排卵誘導療法3を受けることができないか、または受け取る時間がない場合があるホルモン感受性患者の癌患者のFPおよび不妊治療に特に適している。したがって、取得した卵母細胞の数は、臨床妊娠率(CPR)、および出生率(LBR)がIVF4、5のそれよりも低いが、IVMは独自の利点を有する。

子宮内膜病変、水力不水圧、または卵巣嚢胞を有する不妊患者は、通常、ART治療の前に婦人科手術を受け、その卵母細胞は通常未熟である。OP-IVMは、ガイド付き経膣超音波を使用して未熟な卵母細胞を取り出し、IVF-ETまたはFP.OP-IVMの成熟まで体外で成長させ、卵母細胞の検索および婦人科手術後にIVMを組み合わせ、それによって制御された卵巣過剰刺激サイクルで一般的な合併症を軽減し、時間とお金を節約する。肥沃な患者にとって、OP-IVMは定期的な婦人科手術を受けながら「不妊保険」として機能する可能性があります。

さらに、電気焼灼6、7、卵巣腫瘍切除などの婦人科手術による損傷は、婦人科手術前に卵母細胞の検索によって減少する可能性がある。したがって、定期的な婦人科手術と比較して、OP-IVMは不妊治療中の手術の数を減らし、卵巣手術中の機能的卵母細胞の喪失を防ぐことができる。

以前の研究では、卵母細胞の検索の追加手順は、外科的合併症および不利な妊娠結果を増加させることも、入院を延長することもなく、8.一部の患者は、この方法の実現可能性を示すOP-IVM8を介して生きた出産を行った。本論文では、OP-IVMの恩恵を受ける可能性のある患者の特徴、およびOP-IVMの手順および重要な点について説明し、ヒト卵母細胞成熟度の評価について議論する。

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プロトコル

注:OP-IVM法に関する研究は、北京大学第三病院の機関審査委員会(IRB)と北京大学倫理委員会(2014S2004)によって承認されています。OP-IVM の概要を図 1に示します。次のセクションでは、手順を説明します。

1. 適切な患者へのOP-IVMの導入

  1. ステップ 1.1.1-1.1.3 で説明されているようなOP-IVMの恩恵を受ける可能性のある潜在的な患者を特定します。
    1. 腹腔鏡下卵巣穿孔手術を必要とするクロミフェン耐性を有する多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)患者。
    2. ART治療前に、子宮鏡下筋切除術、多形切除術、中隔および腹腔鏡下管切除術の経子宮頸部切除、および卵巣嚢胞切除術などの良性婦人科手術を必要とする不妊患者。
    3. 化学放射線療法または放射線療法を受けている癌または血管疾患を有する患者。

2. インフォームド・コンセント

  1. OP-IVMが有益である理由、その手順、IVM卵母細胞(IVF-ETまたは凍結保存)の使用、推定CDRおよびLBR、および合併症の可能性を含む、患者に完全な情報を提供する。同意書に署名して、患者にインフォームド・コンセントを提出してもらいます。

3. ラベルとIVM卵子培地を準備する

  1. 培養皿および管のための患者の名前および日付の印字の識別(ID)ラベル。
  2. 4ウェルプレートの各ウェルに0.075 IU/mLの卵胞刺激ホルモン(FSH)と0.075 IU/mLの黄体形成ホルモン(LH)を添加するIVM培地の0.5 mLを加えます。媒体を油で覆います。
    注:これらすべての手順を、ラミナーフロークリーンベンチで実行します。
  3. 使用前に5%CO2および5%O2を含む加湿空気中の37°CのIVM卵母細胞培地と4ウェルプレートを予熱する。

4. 手術室で麻酔を行う

  1. 麻酔をする前に患者の名前を確認してください。
  2. 麻酔科医によって患者を静脈内麻酔する。

5. 卵母細胞の検索を行う

  1. ラベルに、カルチャ料理やチューブの名前、日付、ID をタグ付けします。
  2. 膀胱リトトミーの位置に患者を置く;常に消毒し、ドレープし、暖かい生理液で膣をスクラブします。
  3. 膣内の超音波プローブを配置します。両方の卵巣の卵胞の数をスキャンし、記録します。穿刺部位として卵巣に最も近い場所を見つけ、腸、膀胱、および大きな血管を避ける。
  4. 濾胞液を吸引する。
    1. 穿刺する前に、pH安定なハンドリング媒体で針を洗浄します( 材料表を参照)。
    2. 超音波の指導の下で卵巣に19G、単一内腔吸引針を注入する。
    3. プローブに最も近い明確な境界を持つ大きな卵胞を穿刺する。低い位置で、すぐに25 U/mLのヘパリンを補ったリンス溶液を注入する。80-90 mmHgの圧力下で針を持つ濾胞液を吸引し、針をわずかに回転させ、できるだけ多くの濾胞液を吸引する。この平面上の近くから遠い側に他の卵胞を穿刺します。
      注:吸引の間、卵母細胞を含む濾胞液は陰圧下で無菌10 mL試験管に流れ込みます。ヘパリンは、吸引プロセスを容易にするために濾胞液粘度を低下させることができる。
    4. 卵巣から針を取り出します(針を膣壁に入れる)。超音波プローブの方向を調整し、他の平面上の残りの卵胞を穿刺します。直径5~9mmの卵胞をすべて吸引してみてください。
      注:プローブの位置を調整して、常に卵巣に最も近い位置に保ちます。膣のフォルニックスを適切な力で押して、傷害と出血を軽減します。
    5. 一方の卵巣で仕上げ終えた針を引き出し、ハンドリング媒体で針を洗い、もう一方の側を同じ方法で穿刺する。
      注:25〜30分以内に完全な卵胞の吸引。
  5. 患者の名前とIDを確認した後、数分以内に手術室からIVF検査室に濾胞液を移す。
    注:凝固を防ぐために、できるだけ早くIVF実験室のベンチに吸引濾胞液を移す。
  6. すべての卵胞を穿刺した後、Bモード超音波で骨盤腔内の活動性出血を検出する。鏡を挿入し、後部fornixに先端を向けて穿刺部位での活発な出血を検出する。
    注:卵巣の位置が正常であり、卵母細胞の検索が慎重に行われる場合、膣穿刺部位では活性出血は認めてはならない。圧縮後も続く軽い出血の場合は、2〜4時間膣内で無菌ガーゼの圧縮を保ちます。2-4時間の血管鉗子を有するクランプを使用して、小動脈からの過度の出血を制御する。めったに起こらない骨盤腔または卵巣の出血は、腹腔鏡手術による電気凝固によって制御されるべきである。

6. 婦人科手術

  1. 患者の必要性および状態に基づいて、卵母細胞の検索後に適切な婦人科手術を行う。
    1. クロミフェン耐性を有する多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)患者に対して腹腔鏡下卵巣穿孔手術を行う。
    2. 子宮鏡下筋切除術、多形切除術、中隔および腹腔鏡下管切除術、および卵巣嚢胞切除術などのART治療の前に不妊患者に対して良性婦人科手術を行う。
    3. 化学放射線療法を受ける必要がある癌または血管疾患の患者の生殖能力凍結保存のための卵巣切分術を行う。
      注:これらの婦人科手術は、基本的かつ標準化された臨床手術です。各国や病院の運営ガイドラインは比較的似ているはずです。

7. IVM を実行する

注:37°CのホモサーマルフラットでIVMの全工程を実行します。

  1. 70 μm のナイロンセルストレーナーで、吸引した卵胞液をフィルター処理します。培養管とストレーナーを、あらかじめ温めたpH安定ハンドリング培地で繰り返しすすいます。すべての未熟なCOCが完全に培養皿に移されることを確認します。100 x 15 mm のペトリ皿にろ過した液体、すすがり、培養を収集します。
  2. 40倍の倍率でステレオスコープの下にあるCOC(図2)を調べます。未熟者を温めるIVM卵母細胞培地に素早く移します。
    注: オペレータの習慣に応じて、適切な倍率を選択します。
  3. 培養された未熟なCOCの数を記録します。
  4. 培養したCOCの数を患者に知らせる。患者とそのパートナーと精液のコレクションについて話し合います。通常の手順に従って精子抽出を行います.
  5. 5%CO2及び5%O2 を含む加湿空気中の37°Cで28〜32時間の不成熟なCOCSを培養する。
  6. 卵母細胞の成熟度を評価します。
    1. 40倍の倍率で立体鏡下のガラスパスツールピペットを使用して繰り返しピペット処理を行い、積Mulus細胞を脱裸にした。極体(PB)の押し出しを調べて、卵母細胞の発達段階を特定する。明確な形態学的特徴を持つCOCs、転移II(MII)、転移I(MI)、および生殖小胞(GV)における卵母細胞の代表的な画像については 、図2 を参照してください。
      注:ガラスパスツールピペットの直径を卵母細胞の大きさに調整するには、垂直炎(例えば、ブンゼンバーナーの)を使用してください。
    2. MII卵母細胞をカウントし、数を記録します。
    3. IVFまたはガラス化のために成熟卵母細胞を選択してください。
      注:卵母細胞がIVFのために成熟した日に精子を収集しますが、卵子のガラス化のためではありません。
    4. GVおよびMI段階で未熟卵母細胞を、さらに10〜14時間のcumulus細胞を用いた元のIVM培地で培養する。ステップ 7.6.2 ~ 7.6.3 を繰り返します。

8. ICSI または卵卵子ガラス化を行う

  1. 生殖センター8の標準的な手順に従ってください。

9. 培養胚と胚凍結保存を行う

  1. 生殖センター8の標準的な手順に従ってください。

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結果

2019年12月まで、OP-IVMは274人の患者の不妊治療保存に使用されました。2014年から2016年の間に158人の患者の胚学的および生殖結果が前の論文8に掲載された。次の例では、2016 年に OP-IVM を受信した PCOS 患者の手順について説明します。患者は原発性不妊症、左腺嚢胞、およびPCOSと診断された28歳である。彼女は9月28日に腹腔鏡下膀胱切除術とOP-IVMを受けました。27の未熟なカッコが得られた。28時間培養後、MIIステージで7個の卵母細胞を選択し、ICSIにより受精した。1日目の良質2プロ核(2PNs)と3日目の胚の数は、それぞれ6、6、2であった。5日目(2016年10月4日)に得られた胚盤胞を凍結した。2017年2月14日、1つの胚盤胞が解凍されました。この解凍した爆風は生きていて、2017年2月14日に子宮に移されました。血液ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)検査の結果は陽性であり、超音波検査では...

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ディスカッション

この記事で説明するOP-IVM法は、従来のIVMアプリケーションにまで及び、卵母細胞の検索後のIVMと日常的な婦人科手術を組み合わせたものです。婦人科手術で失われたであろう卵母細胞は、追加の外科的リスクなしにIVF-ETまたはFPに使用できるようになりました。OP-IVMは、PCOS患者の卵巣掘削前に卵母細胞を取り出すために最初に使用されました。その適用はすぐに良性婦人科手術と癌または化学放射線療法を必要とする血管疾患患者を必要とする不妊患者に拡大した。転移の潜在的なリスクのために、OP-IVMは悪性腫瘍の患者に適さないか、または推奨されない。OP-IVMに基づいて、不妊患者と癌患者のFPのための卵銀行の新しい中国様式がこの機関で確立されました。

OP-IVMの場合、婦人科手術の緊急性と、より多くの卵母細胞を得る可能性の両方を考慮する必要があります。一般に、IVMの結果は、卵母細胞の検索中に得られた未熟な卵母細胞の数9と正の相関がある。優勢な卵胞は、周囲の小さな卵胞の成長を阻害し、アレジア10

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、中国国家キーR&Dプログラムからの助成金によって支えられました(いいえ。 2017YFC1002000,2018YFC1004001,2019YFA0801400,中国国立科学財団(81571386,81730038),CAMS医学イノベーション基金(2019-I2M-5-001)、中国資本健康開発特別研究プロジェクト(2018-209-409-409)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
19 G シングルルーメン吸引針Cook, AustraliaK-OPS-7035-REH-ET
4-well plateCorning
70 μm ナイロンセルストレーナーFalcon, USA352350
CO2 IncubatorThermo
Culture oilVitrolife, Sweden10029,OVOIL ステップ 3.2.
FSHとLHFerring Reproductive Health、ドイツMENOPUR®
ガラスパスツールピペットHilgenberg GmbH, Germany3154102-26
G-MOPS mediumpH-stable handling medium for washing the needle before puncturing
IVM mediumOrigio, DenmarkART-1600-B
Laminar Flow Clean BenchesESCO
Petri dishThermo Fisher Scientific, Denmark263991
インキュベーター外の卵子や胚の取り扱いと操作をサポートするように設計されたpH安定ハンドリング培地Vitrolife, Sweden10130, G-MOPS PLUSStep 7.1.
リンス液クック オーストラリアK-SIFB-100
ステレオスコープニコン

参考文献

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Formal Correction: Erratum: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery
Posted by JoVE Editors on 6/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2 of the Protocol was updated from:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.075 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.075 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

to:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.75 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.75 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

The legend for Figure 2 was updated from:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) MII, (C) MI, (D) GV stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

to:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) GV, (C) MI, (D) MII stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

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