CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

サマリー

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex pipiensのノックアウトラインを生成する方法を記述します。

要約

Culex蚊は、西ナイルウイルスやイヌの心臓虫やゾウガシスなどのフィラリア線虫によって引き起こされる病気を含む人間と動物の健康に悪影響を及ぼすいくつかの疾患の主要なベクターです。最近では、CRISPR/Cas9ゲノム編集は、アノフェレス属に属する蚊を含むいくつかの昆虫種の新たに敷設された胚にガイドRNA(gRNA)と複合体化されたCas9タンパク質を注入することによって、部位指向の突然変異を誘導するために使用されている。Culex蚊の操作と注入は、これらの蚊が他の種の蚊のように個別に卵をいかだに置くのではなく、いかだで直立させるので、少し難しいです。ここでは、gRNAを設計し、Cas9タンパク質とそれらを複雑にする方法、卵を産むためにCulexピピエンの雌の蚊を誘導する方法、およびCas9 / gRNAを用いたマイクロインジェクションのために新しく産卵した胚を調製して注入する方法について説明します。また、必要な突然変異のために注入された蚊を飼育およびスクリーニングする方法についても説明する。代表的な結果は、この技術がCulex蚊のゲノムに部位指向突然変異を誘導するために使用され、わずかな改変を伴って、他の蚊種でもヌル突然変異体を生成するために使用できることを示している。

概要

Culex蚊は、世界の温帯および熱帯地域全体に分布し、西ナイルウイルス^1、セントルイス脳炎²だけでなく、イヌ心虫³および^象の毛虫症を引き起こすフィラリア線虫を含むいくつかの致命的なウイルスを伝播する。Cx.クインケファシアトゥス、Cx.ピピエンスピピエンス、Cx.ピピエンス痴漢を含むCulex pipiens複合体のメンバーは、彼らの生物学の多くの側面で顕著なバリエーションを示しています。例えば、Cx.quinquefasciatusおよびCx.ピピエンス痴漢は越冬休眠^5、6、Cx.ピピエンスピピエンは堅牢な季節応答を表示し、短い日^7、8に応答してジアポーズに入ることができない。さらに、Cx.ピピエンス痴漢はより人類愛的である傾向があり、Cx.ピピエンとCx.キンケファシアトゥスはより動物性^の6です。しかし、米国および世界の他の多くの場所で、これらの種は、Cx.ピピエンスピピエンとCx.ピピエンス痴漢のハイブリッドとして病気の伝染に強い影響を与える交雑種は日和見フィーダーであり、鳥と人間^の両方を噛み、それによって西ナイルウイルスの橋梁ベクトルとして機能します。Culex蚊の生物学のこれらの側面やその他の魅力的な側面を研究することは、Culex蚊が静止と乾燥耐性卵¹⁰を生成するAedes蚊よりも実験室で飼育するのがわずかに難しく、機能的な分子ツールがCulex種のために十分に開発されていないため、部分的に妨げられております。

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、南部の家の蚊、カレックスキンケファシアトゥス^14、15、16を含むいくつかの重要な蚊種11、12、13の生物学を評価するために使用されている強力な技術です。ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエによって開発されたこの技術は、細菌由来のCRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Casタンパク質、ファン・デル・ウーストらによる^{レビューを参照})によってウイルスに対する自然な細菌防御を利用しています。動物の胚に注入されると、Cas9タンパク質と適切なガイドRNAを組み合わせて、ゲノム内で二本鎖破断を生じさせることができる。これは、エンドヌクレアーゼ活性をゲノムの特定の領域に導くガイドRNAと複合体化されたCas9タンパク質を使用することによって最も頻繁に行われます。Cas9タンパク質が部位特異的な二本鎖破断を作成した後、細胞機械は2つのメカニズムのいずれかを使用して破断を修復しようとします。1つ目は、非相同の端結合(NHEJ)を通じて2つの端を結び付ける必要があり、これはエラーが起こりやすいため、ゲノムにアウトフレーム挿入および欠失を生じさせ、非機能的なタンパク質を引き起こし、ノックアウト突然変異を生じさせる。あるいは、細胞機械は、正しく破断を修復するために類似した配列を見つけることによって相同性指向の修復(HDR)を使用するかもしれません。同様の配列は、生物内の第2染色体によって提供され得る(レビュー¹⁸を参照)。しかし、修復された配列が元の配列と正確に一致する場合、Cas9タンパク質は再びDNAを切断することができます。あるいは、標的配列の切断部位の両側に相同配列を含むドナープラスミドを、代替修復配列(蛍光マーカータンパク質、元遺伝子の改変版、またはその他の改変)を含み、ゲノムにコピーして挿入したり、「ノックイン」したりすることもできます。

胚を注入する際にはタイミングが重要であり、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して昆虫の突然変異を作り出す場合は特にそうです。これは、Cas9タンパク質とgRNAは、胚が間合状態にある場合、細胞膜が形成される前、および胚内で複数の核がアクセス可能である場合にのみ突然変異を生成する最大の能力を有するためである。蚊の場合、原子核は、温度¹⁹に応じて、卵子から〜2〜4時間後に周囲に到達するため、この時間までにマイクロインジェクションが成功する必要があります。さらに、Cas9タンパク質は、注射に起因する個体が細胞のモザイクを含み、所望の突然変異を有する個体が含まれるなど、アクセス可能な核DNAを切断する。これらの突然変異を正常に継承するためには、Cas9タンパク質は、将来の卵子と精子を生み出す生殖細胞系列に存在するDNAを切断する必要があります。生殖細胞系列に突然変異が発生することを確実にするためには、昆虫生殖細胞系の前駆体である胚内の極細胞の位置に近い全ての物質を注入するのが最善である。極細胞は 、Culex 胚²⁰の後端付近に位置する。胚を注入することに加えて、所望の突然変異を検出するためには、子孫の交育とスクリーニングのための慎重な計画を策定することが不可欠である。

このプロトコルは、gRNAを生成し、注射ミックスを準備するためにCas9タンパク質でそれらを複雑にする方法だけでなく、卵を産むためにCulexピピエンのメスの蚊を誘導する方法とCRISPR / Cas9媒介ゲノム編集のためにそれらの卵を準備し、注入する方法を説明します。さらに、注射された胚の後部、横断、スクリーニングの方法とその子孫を説明し、所望の突然変異が得られたことを確認する。このプロトコルを使用して、私たちは、カレックスピピエンのバックアイ株で、関心のある遺伝子、サイクル、ヌル突然変異を生成しました。この株はもともとオハイオ州コロンバスのフィールド収集蚊から2013年に設立され、Meutiラボによって維持されています。このプロトコルは、Culex蚊および他の蚊種におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集を必要とする追加の研究に使用することができ、より一般的には、任意の昆虫種にCRISPR / Cas9ゲノム編集を採用することに関連しています。

プロトコル

ほとんどの研究機関では、遺伝子組み換え生物が脱出したり実験室施設から取り除かれたりしないように、トランスジェニック昆虫が生成または維持される前に、承認されたバイオセーフティプロトコルを実施する必要があります。追加の政府規制も適用される可能性があります。この種のプロジェクトを開始する前に、すべての機関の方針と手順を確認して、必要な書類と承認を決定してください。

1. gRNAの設計と注入ミックスの準備

1. 一部のgRNAは他のgRNAよりもうまく機能するので、各標的遺伝子に対して2〜5gRNAを設計する。対象遺伝子を標的とするgRNAは、手動で設計するか、Chop-Chopなどのフリープログラムを使用することができます。
2. 各gRNAの周囲に100-200bp断片を増幅するプライマーを設計し、注文する。理想的には、カット部位はPCR産物のおよそ3分の1から半分に位置する必要があります。カットの各サイトで何bpが生成されるかに注意してください。
3. gRNA を取得します。
   1. 統合DNA技術、フィッシャーサイエンティフィック、ジェネスクリプトなどの商業企業からgRNAを購入します。これは最も簡単なオプションです。
   2. あるいは、PCR 増幅を使用してラボで gRNA を作成し、その後の等温合成用のテンプレートを生成します。Port et al. とキスラーら²²で説明されているプロトコルを参照してください。
   3. 胚に注入されるプラスミドを介してgRNAを提供する。この場合、gRNAはU6プロモートによって駆動されるべきである(詳細については^23,24を参照)。
4. Cas9タンパク質を入手します。
   1. フィッシャーサイエンティフィックを含むいくつかの企業から商業的にCas9を注文します。これは最も簡単なオプションです。
   2. Basuら²⁵ とキスラーら^22.によると Cas9 タンパク質を作り、実験室で精製.
   3. Cas9 mRNAを胚に注入し、後で活性Cas9タンパク質に翻訳します。Cas9 mRNAは、インビトロ転写²²を用いてラボで合成するか、またはシグマなどのベンダーから購入することができる。
      注:翻訳されたCas9タンパク質は、C末語上に核局在性シグナル(NLS)を含んでいる必要があり、したがって、NLSは注入された Cas9 mRNAにも存在する必要があります。
   4. プラスミドベースの発現を介して生体内でCas9タンパク質を発現する。この場合、標的種によく特徴づけられてきた胚性プロモーターによって駆動されるプラスミド上のCas9の発現を有することが最善である。
      注:現在までに、胚性プロモーターは Culex 蚊で十分に特徴付けられていないので、精製タンパク質またはCas9 mRNAを注入することが推奨されています。
5. カス9タンパク質とgRNAを複合体化し、キスラーらから^{適応した。}
   1. Cas9タンパク質をgRNAと一緒に注入する場合(推奨)、Cas9タンパク質の最終濃度が300 ng/μLであり、単一のgRNAの最終濃度が80μg/μLであることを確認してください。
   2. 氷の上で20分間インキュベートします。
6. インビトロアッセイ(例えば、ガイドイットsgRNAスクリーニングキット)を用いてgRNAを試験する。
   1. PCRを使用して各gRNAの切断部位の周りの断片を増幅します。
   2. PCR 製品をゲルで実行して、正しいサイズであることを確認します。次に、PCR産物を精製し、それらを配列して、それらが正しい遺伝子領域を標的とすることを確認します。
   3. 残った精製PCR製品の200 ngをCas9反応バッファー1 μL、BSA 1 μL、複合Cas9:gRNAの1.5 μLと混合し、合計反応量を15 μLに持ち込み、37°Cで5分間インキュベートします。
   4. ゲルで製品を再実行してください。Cas9タンパク質がPCR産物を正常に切断した場合、プライマリバンドはよりかすかに見え、追加の小さなバンドが存在するはずです。オリジナルPCR産物のサイズの縮小に注意し、また、必要に応じて、バンド強度の減少を計算して切断効率を近似します。
7. 最終的な注入ミックスの準備
   1. 標的PCR産物を正常に切断した各gRNAについて、各Cas9とgRNAの体積を0.5mLチューブに混合し、最終的な体積はCas9タンパク質の300 ng/μL、各gRNAの80 ng/μLのままとなります。
   2. 複雑なCas9とgRNAは、注射に必要になるまで-80°Cで保管してください。

2. 針を引っ張り、ベベルする

注意:胚の正常な注射と生存には鋭い針が必要です(図1)。

1. 1 mm の外径ホウケイ酸または石英ガラスマイクロキャピラリーのいずれかを使用してください。マイクロキャピラリーを化学発煙フードに入れてから引っ張ってください。
   1. 簡単に言えば、シグマコテの3 mLをガラスビーカーに入れ、少なくとも4時間ガラスマイクロキャピラリーを含む第2ビーカーに真空を引き込み、シリコン化溶液が気化してマイクロキャピラリのすべての表面に落ち着くことを可能にする。
   2. その後、徐々にストップコックバルブを開き、空気がチャンバーに戻るようにすることで、真空チャンバーが周囲の圧力に均等化できるようにします。針は引っ張られる準備ができています。
   3. 使用前に針の引き手の取扱説明書を必ず読んでください。
      注:以下の手順は、ガラスの針を引くためにP-2000レーザーニードルプラーを使用する方法を詳述します。同じブランドのすべてのニードルプーラーは、異なるユニット間でまったく同じ針を引くために較正されないことに注意することが重要です。良い針を得るための鍵は、パラメータの所定のセットから開始し、これらの値の上下にあるパラメータを使用して針を引っ張ることです。針が胚をどれだけうまく突き刺し、注射ミックスが針からどれだけうまく流れるかを評価することによって、これらの各パラメータで針をテストします。開けるか、またはベベルが容易で、胚を滑らかに突き刺し、注入ミックスを容易に提供する針が得られるまで、パラメータを洗練します。
2. P-2000レーザー針の引き手を使用して針を引っ張る
   1. レーザー針の引き手をオンにし、レーザーが最初の引っ張りの前に15分間ウォームアップできるようにします。
   2. ガラスマイクロキャピラリーチューブのタイプのためにマシンをプログラムします(針の引き手のパラメータは、すべてのプーラー間で同じ針を生成するためにキャリブレーションされていないので、任意のニードルプーラーパラメータが出発点であることを覚えておいてください):
      クォーツ: 熱 = 730;フィル = 4;Vel = 40;デル = 122;Pul = 156
   3. 針の引き手をプログラミングした後、マイクロキャピラリーをロードし、それを所定の位置にクランプし、マイクロキャピラリーチューブの端部に触れるだけで、レーザーで加熱される領域には触れないように注意してください。
   4. マイクロキャピラリーをクランプした後、指のバーに親指と人差し指を置き、スプリングリリースを一度に1つずつ押してプルバーを離します。
   5. 親指と人差し指を絞ってバーを完全に引っ張ります。
   6. マイクロキャピラリーチューブの反対側をクランプに配置し、チューブのごく一部が両側から伸びる。クランプを締めて、両方のクランプが指密で、"プルバー"をしっかりと所定の位置に保持します。
   7. 引き手の保護シュラウドを閉じます。
   8. プルボタンを押すと、レーザーがガラスを加熱し始めます。プルバーが完全に分離されると、プルは完了し、金属の音が伴います。
   9. シュラウドを持ち上げる前に、「レーザーオン」ライトが点灯していないことを確認してください。
   10. 親指と人差し指でクランプを越えて伸びるマイクロキャピラリーチューブの小さな端を保持し、クランプを緩めます。次に、マイクロキャピラリーチューブをクランプから持ち上げます。
   11. 鉗子を使用して、マイクロキャピラリーチューブを両面テープが並ぶ正方形のペトリ皿に慎重に置きます。針の裏側が最初に触れ、針がそっと所定の位置に下げて、鋭い先端が損傷しないように、針を保持ボックスに入れる際に確認します。
3. PC-10/PC-100ニードルプーラーを使用して針を引っ張る
   1. 4つの重みを使用してPC-10のプラーを設定し、シングルステッププルのための50.4°Cの温度を設定します。
   2. ホウケイ酸ガラスのマイクロキャピラリーを上部クランプに入れます。次に、加重底クランプを位置に上げ、マイクロキャピラリーの下部をクランプし、毛細管が2つの良い針を引っ張る位置にしていることを確認します。これはかなり長いプルサイクルですが、それはベベルのための良い針を生成します。
4. 針をベベル。
   注:このウェットベベル法は、針の相対的な開口部のサイズにリアルタイムのフィードバックを与えます。
   1. 針ベベラーの研磨板と保持リングを組み立てます。研磨プレートのグレーの側が、上部と下部の保持リングの間に上向きになっていることを確認します。保持リングのネジを締め、ネジからネジまで交互に締め、各ネジが均等に締め付けられるようにします。研磨板および保持リングは、後述する粉砕アセンブリと呼ばれる。
   2. 13滴(〜520μL)のペデスターオイルを光学平らな表面に置き、次に粉砕アセンブリをプレートの上に置きます。解剖顕微鏡の下にアセンブリを置き、ベベラーをオンにします。これは、この湿式ベベル法と組み合わせて使用する場合、より長い期間回転する研磨板を維持するので、サッターの推薦に比べて少し余分な油が使用されます。
   3. 1%のPhoto-Flo溶液を研削面に加え、ウィックを位置に移動させ、Photo-Flo溶液に浸します。
   4. メインソースで空気をオンにします。次に、引っ張られたホウケイ酸針をホルダーに入れ、保持リングを締めます。レギュレータで空気をオンにし、圧力が26 PSIに達するまで増加します。
   5. 側面から見て、それがほとんどPhoto-Floの液体表面に触れるまで粗い調整ノブを使用して針を下げます。
   6. 顕微鏡を調整して、視野に針を配置します。最も低い倍率から開始し、倍率を上げます。粗い調整ノブを使用して、フォトフロ液の表面に触れるまで、針の位置を慎重に調整します。
   7. 粗い調整ノブを使用し、顕微鏡の下を見続け、針を研磨面に近づくまで下げますが、触れないようにします。
   8. 微調整ノブを使用して、慎重かつゆっくりと針を下げ、針とそれがベベラーの研磨面に残す影に細心の注意を払います。針とその影が研磨面に触れようとしているように見えるとき、針をさらにゆっくりと慎重に下げ続けます。
   9. 針を研磨面に下げて「ベベル」させ、それを上げるのとは別です。針を上げる前に、微調整ノブのマイクロメーターの設定を素早くメモし、針を同じ位置に下げたり、必要に応じてわずかに低い位置に下げることができるように注意してください。針をフォトフロ液層の下に置いてください。針が研磨面の上に上げられたら、すぐに停止し、泡をチェックするためにベベラーの回転を再起動します。針が十分にベベにされた場合、気泡は針からフォトフロに流れ出る必要があります。プレートが止まっていない場合、針の開口部が大きくなり過ぎるまで泡が見えなくなる可能性があります。
   10. 針が研磨面の上に上がってベベラーが停止したときに泡が現れなければ、ベベル手順を繰り返し、微調整ノブにあるマイクロメーターのわずかに低い位置に針を下げ、針を上げ、ベベラープレートを止め、気泡を確認します。小さいながらも安定した泡の流れが現れるまで繰り返します。
   11. 気泡が存在したら、砥粒板を停止し、気圧を下げて相対開口サイズを確認し、気泡形成が停止するPSIを注意して、これは、ベベリング針の開口部の大きさの相対的な指標である。空気が針先から逃げるのを止める圧力が低いほど、針の開口部は大きくなります。18-20 PSIで泡が針から逃げるのを止めるポイントにベベリングされた針は、針が比較的小さな開口部を有し、マイクロインジェクションに使用される場合に胚に最小限の損傷を引き起こす必要があることを示している。
   12. 針の開口部を確認した後、液体が針に入るのを防ぐために、空気圧を26 PSIに上げます。次に、粗い調整ノブを使用して、Photo-Flo層の上および外に針を上げます。空気が針から流れ出る限り、Photo-Floは針に入らないので、針の内側は汚染から保護されることに注意することが重要です。
   13. 針がフォトフロから出たら、空気をオフにして針ホルダーから針を取り外します。
   14. 鉗子を使用して、新しくベベリングした針を両面テープまたはモデリング粘土を持つペトリ皿に入れ、所定の位置に保ちます。10~20本のベベ針が作られるまで、このプロセスを繰り返します。

3. 親の蚊の世代に血液を与える

1. Cx.ピピエンスの後部幼虫は、蚊が越冬休眠や日更期に入らないように、明確な長い日の条件(光/日の>13時間)の下で蚊を25〜27°Cで飼育します。
2. 大人の出現のピークから7〜10日後、加熱ユニットを電源に差し込むことによってヘモテック膜供給システムを準備する。ユニット上部の調整ネジを使用して、各ユニットの温度を37 °C(人体内部体温)または41°C(鶏内部体温)に調整します。電気温度計を使用して正しい温度に達していることを確認します。
3. 給餌のために血液ミール貯水池を準備します。
   1. 各血液供給シリンダーのためのパラフィルムの1つの正方形をカットし、裸足に対してパラフィルムをこすります。これは蚊に魅力的な香りを提供します。
   2. パラフィルムをできるだけ薄く伸ばし、食事貯留層の周りに端をしっかりと巻き付けます。必要に応じて、ゴム製のOリングで所定の位置に固定します。
   3. 0.1 M ATP溶液の約200 μLを、クエン酸ナトリウム処理された鶏の血液を15 mLの新鮮または解凍した鶏肉に加えます。ATPは、血液の供給を刺激するのに役立ち、クエン酸ナトリウムは血液の凝固を防ぎます。
   4. パラフィルム側が下向きになるように貯水池を持ち、慎重に貯蔵所を満たすために使い捨てのピペットを使用します。各貯留層は、血液の〜3 mLを保持しています。充填ポートをプラスチックプラグで密封します。
   5. 食事の貯水池を暖房ユニットにねじ込み、パラフィルム側が下を向き、蚊がメッシュを通して供給できるように蚊のケージの上に置きます。
4. 黒いゴミ袋でケージを覆い、夕暮れをシミュレートし、CO₂ 濃度の増加が血液供給を刺激するので、各ケージに激しく吹き込みます。
5. フィードを最大にするには、ケージの上にフィーダーを2~8時間置いておきます。定期的にチェックし、血液の食事を取った女性の割合を注意してください (彼らの赤と膨らんだ腹部によって明らかに).

4. 成虫の蚊に産卵を誘発する

1. 血液供給の4~5日後、蚊の卵位に対して50mLの円錐管を用意する。
   1. 円錐形チューブの底部近くに〜20 mmの穴を作成します。
   2. 2つの正方形(35 mm²⁾の歯科ダムゴムで穴を覆い、1つは水平スリット、もう1つは垂直スリットで覆います。テープを使用して、歯科ダムの正方形を円錐形のチューブに取り付けます。
   3. 4.25 cmのフィルターペーパーを35mm x 10 mmのペトリ皿に置き、750 μLの蒸留水でフィルター紙を湿らします。
   4. 円錐形のチューブを濾紙に反転させ、数回ねじって安全であることを確認します。
2. 口の吸引器を使用して 、Cx.ピピエン の約10匹のメスをケージから慎重に取り除き、準備した円錐形のチューブに移します。
3. 円錐形のチューブの上に不透明なシリンダーを置き、産卵を刺激するので蚊に暗闇を提供し、20〜25分待ちます。

5. 生きた てのキュレックス エッグをマイクロ操作する

1. マイクロインジェクション用の蚊の胚を取り付けるためのスライドを準備します。
   1. カバーガラスの幅に両面テープを貼ります。
   2. カバーガラスの短い端に平行に動き、カバーガラスの端から約5mmに位置するように、透明な医療用ドレッシング(例えば、テガダーム、幅2〜3mm)の薄いストリップを両面テープに取り付けます。
   3. 鋭利なカミソリの刃で余分な両面テープを取り出し、カバーガラスの両端から2〜3mmの医療ドレッシングと両面テープを取り除きます。これにより、卵がカバーガラスに取り付けられた後も、油の層をスライド上に残すことができます。
   4. ワックスペンシルを使用して、両面テープと医療ドレッシングのストリップの周りに「D」の形を描きます。これは、注入後に卵の周りの水を保持するための障壁として機能します。
2. スライドが準備され、20〜25分が経過した後、不透明なチューブを取り除き、蚊が卵を産んだかどうかを判断します。
   1. そうでなければ、さらに5〜10分間カバーしてください。
   2. 蚊が卵を産んだ場合は、慎重に、しかしすぐに円錐形のチューブを持ち上げ、キャップで覆います。蚊を別のケージに入れ、卵が収集された時間をスプレッドシートに記録します。その後、卵のいかだを含むフィルター紙に50〜100μLのDI水を加えます。
3. 解剖顕微鏡の下で卵を並べます。
   1. カバーガラスが濾紙の左側の50~60%を覆うような24mm x 40 mmのカバーガラスの下に、フィルターペーパー(流速の粗いろいろ紙から切り取られた10mm x 30mmの長方形)を置きます。
   2. フィルター紙を50μLのDI水で湿水します。水はカバーガラスの下にゆっくりと広がり、マイクロマニピュレーション中に濾紙と卵を濡らし続けるための貯水池を作り出します。正しい量の水が適用されると、カバーガラスとろ紙の間に半月板が形成されます。
   3. 細かいペンキのブラシを使って卵のいかだから卵を分け、胚の狭い後端がカバーガラス(左)と広く、前端が右になるように位置します。
   4. 卵を20分間整列させ、乳白色から非常に薄い灰色への色の変化を注意深く観察します。カバーガラスの下の水膜を定期的に検査し、十分な量の水があることを確認します。卵が乾燥しているように見える場合は、少量のDI水(20~30 μL)をフィルターペーパーに加えます。
   5. 20分後、残りの卵をすべて捨てます。
4. 卵をマイクロインジェクションスライドに移します。
   1. 粗いろ紙の小さな(10 mm x 30 mm)片を使用して、飽和したろ過紙の側面から水を吸い取り、鉗子でウィッキングフィルターペーパーを取り除きます。卵を含むろ紙ができるだけ乾燥していることを確認するために2〜3回繰り返します。
   2. フィルターペーパーの新鮮な、乾燥した長方形を置き、鉗子のペアで所定の位置にそれを保持します。慎重に整列した卵から離れて、左にカバーガラスを引き離します。
   3. 整列した卵を含む小さな濾紙を邪魔することなく、ステージ上の余分な水を乾燥させます。卵を数回湿ったろ過用紙で乾燥させ、親指や鉗子で濾紙の小さな長方形を押して、卵を注入スライドに移す前にできるだけ乾燥させます。
   4. 鉗子を使用して、取り付けスライドから医療用ドレッシングのストリップから紙の裏地を取り除きます。
   5. 取り付けスライドを親指と中指と露出した医療ドレッシングで下に向け、45°の角度で整列した卵のラインに下げます。卵のより広い前端(左)が医療用ドレッシングの端からわずかにぶら下がるようにスライドを配置し、 これによりCulex 幼虫が取り付けられた卵から正常に孵化する能力が高まるようにします。
   6. カバーガラスの下側に人差し指を押し、親指と中指の間にカバーガラスを保持し続けながら、整列した卵がすべて医療用ドレッシングにしっかりと取り付けられていることを確認します。
   7. すぐに卵が上向きになるようにカバーガラスを反転し、卵に油ハロカーボン油の薄い層(2〜3滴;〜20 μL)を適用します。これにより、マイクロインジェクション中に卵が乾燥するのを防ぎます。医療用ドレッシングに付いていない卵や油で覆われない卵を取り除きます。
   8. マイクロインジェクション用の輸送用のウェットフィルターペーパーの大きな正方形を持つ正方形のペトリ皿の内側を向けて取り付けられた卵でガラスカバーを置きます。

6. キュレックス 胚の注入

1. 注射剤のミックスで注射針をバック充填
   1. 選択した注射針のバックエンドに簡単に収まり、針フィラーの端と注射針の間に少しのスペースがある針フィラーまたはゲルローディングチップを選択します。
   2. 注射針に注射ミックス(〜0.5-1 μL)を1滴、小さなドロップを慎重に入れ、針を後ろに充填するために針フィラーを使用します。注射針がテーパし始める場所の近くに注射ミックスのドロップを置きます.
2. 注射針をマイクロインジェクタに取り付けます。
3. 胚を含むスライドを顕微鏡のステージに置きます。
4. 針を開ける
   注:ベベド針を使用する場合、これは必要ありません。
   1. ~30 PSIの開始射出圧力を使用し、必要に応じて調整して適切な量の注入ミックスを提供します。
   2. 解剖顕微鏡の下で、針を胚の上に置き、マイクロマニピュレーターを慎重に使用して針を胚に下げる。針がかろうじて胚に触れると、すぐに針の長い軸に垂直に胚を移動します。
   3. 針が正常に開かれたかどうかを確認するには、注射トリガーを押して、泡/注入ミックスが針から脱出するかどうかを確認します。そうでなければ、針が開くまで胚を針に動かし、トリガーが押されたときに注射ミックスがエスケープするまで繰り返します。
5. 胚を注入する
   1. 最初の胚を顕微鏡の中央に並べ、焦点を合わせてください。
   2. 針を最初の卵の上に置き、顕微鏡内の視野の中心内にも置きます。
   3. 顕微鏡の倍率を徐々に大きくし、慎重に針を下げて最初の胚のすぐ上に置き、中央に集中します。顕微鏡が最高の倍率に達し、胚と針の両方が焦点を合わせるまで進みます。
   4. 慎重にステージ上の胚をわずかに左に動かし、針と胚が同じ視点になるように針を少し下げます。
   5. 顕微鏡ステージを使用して胚を移動させ、慎重にかつ穏やかに胚を針の先端に触れる。胚の狭い後端はわずかに偏向するはずです。高すぎるか低すぎる場合は、針の高さを調整します。
   6. 顕微鏡ステージを使用して、胚の後端を針に移動し、針が蚊の卵の絨毛を貫通するのを観察する。針は 、Culex 胚内の極細胞のおおよその位置にある膜を貫通する必要があります。これが発生したら、注射トリガーを1〜3回引き、胚に注入ミックスを撃つ。少量の注射ミックスを提供し、胚形成の小さなクリアリングを検出するのに十分です。
   7. ステージを使用して、胚を右に、すぐに、そして針の先端から離します。注射がうまくいけば、胚から液体がほとんど漏れてはならない。
   8. ラインの次の胚が針の前に配置されるようにステージを下に移動します。その後、再びステージを左に移動し、胚を注射針に配置し、注射トリガーを引きます。
   9. 注射ミックスが出てこないように見える場合や、針を取り除いた後に大量の液体が胚から脱出する場合は、注射針を交換して再度開始してください。
   10. 注射を受けていない卵や損傷した卵を破壊する。
6. 注射後の胚に傾向がある
   1. スライド上のすべての胚が注入された後、水の流れが注入された胚の上のガラスカバースリップの上に向けられ、水がカバースリップと胚の上に流れて油を洗い流せるように、ホヤボトルで逆浸透水を塗布してハロカーボンオイルを洗い流します。これは損傷または医療ドレッシングからそれらを取り外す可能性があるため、胚に直接水の流れを指示しないようにしてください。このプロセスは、ハロカーボンオイルのほとんど(すべてではない)を除去します。
   2. スライドに150 μLのDI水を覆います。
   3. 正方形のペトリ皿の中の湿ったフィルターペーパーの上に注入された胚とスライドを置きます。
   4. 注入された胚を含むペトリ皿を25-27°C、70-80%RHに設定し、長い日光周期(>13 h光/日)にセットします。

7. 注入胚(F₀₎を成人期に飼育し、十字架を設定する

1. 注射された胚のスライドを毎日調べ、注射の1日後に^1st インスター幼虫が出現することを期待する。
2. 1stインスター幼虫の数を数え、100-200匹の幼虫を450 mLのDI水と50mgの地上魚の食べ物を備えた靴箱サイズのタッパーウェア容器に入れます。この時点で、注入された蚊と交差するために使用される野生型または注入されていない幼虫を含む1〜5倍の容器を作成します。
3. 幼虫に毎日餌を与え、幼虫の寿命の6^日目 に300〜500mgに達するまで毎日受け取る食物の量をわずかに増やします。
4. 子犬が現れたら、トランスファーピペットを使用して、DI水でいっぱいの50〜75%を満たした2mLマイクロ遠心分離管に1つの子犬を入れます。すべての子犬について、胚として注射された子犬と、未注入の野生型の子犬の両方について繰り返します。慎重に彼らがわずかにアジャールになるように蓋を押して、蚊が逃げるのを防ぎますが、まだ少量のガス交換を可能にします。
5. 成虫の蚊がマイクロ遠心分離チューブの中に出現すると、野生型の雄の蚊を含むケージに注入された雌の蚊を放出し、注入されたすべての女性に対して少なくとも1匹の野生型雄の比率を達成する。同様に、野生型の雌を含むケージにオスの蚊を放出し、注入されたすべての雄に対して約5〜10匹の処女野生型メスの比率を達成する。各雄の蚊は複数回交尾することができるので、注入された男性に対する野生型のメスのより高い比率が推奨されます。したがって、注入された男性と交尾する野生型の雌の数が多いと、産生できるF1子孫の数が増加する。

8._F1 蚊の入手と飼育と変異のスクリーニング

1. 成人出現後7~10日後、上述した各ケージ内の女性に血液ミールを提供する(ステップ3)。
2. 採血の4日後、各ケージに卵子水を入れる。各卵のいかだは、単一のメスの蚊の子孫を表し、したがって、排卵直後に独自のプラスチック、靴箱サイズの飼育容器に入れるべきです。各容器に一意の識別子を付け、また、幼虫が対象遺伝子の_F1 世代に属していることを示し、男性または女性の親が注射されたかどうか、パンが確立された日付、飼育条件、および実験者のイニシャルを示します。
3. 毎日幼虫の鍋を監視します。フライパンで幼虫が孵化するとすぐに、50mgの挽いた魚の食べ物を提供します。上記のように毎日6日間食品を増やします(ステップ7.3)。
4. 個々の子犬を1〜1.5mLのDI水を含む2mLマイクロ遠心分離管に移し、各チューブにラベルを付け、蓋を割ります。
5. 成虫の蚊が出現したら、2mLマイクロ遠心分離チューブを慎重に開け、人差し指で覆い、もう一方の手を使用して、マイクロ遠心分離管の上部に3ドラムガラスバイアルを置きます。蚊の自然な本能は、ガラスバイアルに飛び上がって飛ぶことであるべきです。これが起こると、ガラスバイアルの開口部の上に指をスライドさせ、すぐにそれを反転させ、10%のスクロース溶液でわずかに濡れた綿の小さなボールをバイアルの上部に置きます。これは、蚊が逃げるのを防ぎ、必要な食料と水源を提供します。
6. プパルエクスビアを含むチューブと、それが由来する幼虫のパン、蚊の性別、およびその個人の一意の識別子を示すために、成虫の蚊を含むガラスバイアルの両方にラベルを付けます。例:II.C M32は、男性の親が注射されたことを表し、「C」は個人が産卵した鍋/卵のいかだを表し、「M32」は、その幼虫飼育容器から出現する32^番目 の男性を指定します。
7. 個々のガラスバイアル内に成虫の蚊を環境室に戻し、少量(約20μL)のスクロース溶液を綿に毎日加えます。蚊がスクロース溶液に詰まって死ぬので、綿を食べ過ぎたり飽和させないようにしてください。
8. 目的の突然変異のための蚊のスクリーニング
   1. メーカーの指示に従ってPhireダイレクトPCRキットを使用して、幼虫の各卵いかだ/パンから5-10プパルエクスビアからゲノムDNAを抽出するだけでなく、コントロールとして機能する1-2野生型の個体。
      注:各いかだの子孫は完全な兄弟である可能性が高いので、各鍋から5〜10の幼虫をスクリーニングすると、突然変異が子孫に渡されたかどうかが決定されます。1つの鍋からスクリーニングされた幼虫のいずれも所望の突然変異を持っていない場合は、追加の成人をスクリーニングしないでください。幼虫の一部が突然変異を持っている場合は、その鍋からのすべての個人をスクリーニングする必要があります。
   2. 以前に設計されたPCRプライマー(ステップ1.2)を使用して、野生型とF1の両方の子孫のPhire PCRキットを使用して突然変異の予測位置の周りの断片を増幅し、3〜4%のアガロースゲルでPCR断片を実行して、目に見える挿入または欠失(インデル)があるかどうかを判断します。
      注:所望の突然変異を有する個人はヘテロ接合であり、2つのバンド、1つの野生のタイプと1つが所望の位置でわずかに短いか長く表示する必要があります。これらを区別するために、野生型個体のバンドの位置と厚さをF1子孫のバンド内のバンドと比較する。理想的には2つの離散バンドが見えますが、インデルが非常に小さい場合、バンドはより広く、またはぼやけているように見えるかもしれません。
   3. 疑わしいインデルを含むバンドを切除するか(推奨)、またはゲルにロードされなかった残りのPCR産物を精製することによって、PCR産物を精製します。シーケンシング用に精製 PCR を提出し、所望の変異が存在するかどうかを判断します。

9._F2 および_F3 蚊の入手と飼育と変異のスクリーニング

1. 所望の突然変異が発見されたすべてのF₁ 成体蚊を、個々のガラスバイアルからプパルエクスビアをスクリーニングし、異性の野生型の注射されていない蚊を含むケージに放出する。この第二世代のバッククロッシングは、注射と近親交配のすべての有害な影響を除去する必要があります。
2. 血液は、先に述べたように変異型_F1 蚊とその野生型の対応物のケージを供給する。4〜5日後、得られた_F2 卵いかだを集める。
3. 上述したように_F2 幼虫にラベルを付けて後ろに、各卵のいかだを別々のラベル付き容器に入れます。子犬の時に、再び個々の子犬を個々の2 mLマイクロ遠心分離チューブに分離し、出現時に各大人をスクロース浸し綿で覆われた別々のガラスバイアルに移します。次に、先に述べたように各_F2 個体のプパルエクスフィアを所望の変異をスクリーニングする(ステップ8.5〜8.8)。
   注:ここでは、所望の突然変異を有するすべての個体がヘテロ接合であり、したがってPCR産物は理想的には3-4%アガロースゲルで実行する場合に2つの異なるバンドを生成する必要があります。
4. 突然変異_F2 の幼虫が同定されたら、突然変異を有するすべての雄と雌を同じケージに入れて交尾する。血中飼料は成人出現後7-10日後、そして4〜5日後に_、F3 卵いかだを集める。
5. 各F₃ 卵いかだを別々の幼虫飼育容器に入れ、上述のラベルと飼料を入れます。
6. F₃ の子犬を個々の2 mLマイクロ遠心分離チューブに分離します。大人が現れたら、10%のショ糖漬け綿でキャップされた個々のガラスバイアルに移します。前述のようにパパルエクスビアをスクリーニングします。今回は、各鍋の子孫の約25%がヌル突然変異のホモ接合であるべきである。これらの個体を単一のケージに入れ、それらを使用して、新たに生成された蚊の突然変異線を作成し、維持します。
   注:ホモ接合蚊の数が少ない場合、ヘテロ接合性F₃ オスとメスは互いに交差して_、F4 世代にホモ接空ヌル蚊を追加生成することができます。

結果

記載されたプロトコルを用いて、Cx.pipiensの胚を正常に注入することができ、注入された胚の間で高い生存率を観察した(〜55%、図1)。以前の試験では、卵胞の前部が医療ドレッシングストリップに取り付けられ、蚊の幼虫が絨毛膜から脱出するのを防ぎ、水に泳ぐことに成功したため、生存率が低かった。前端が医療用ドレッシングのストリップを超えて延びることを保証することは幼虫生存率を大幅に増加させ、そして成人期に発達し再生することができる高品質の子孫をもたらす(図2B)。

その後の実験とスクリーニングは、概日時計遺伝子周期(cyc;KM355981)は、注入された胚の生殖系列にした(図3)。私たちのプライマーがカットサイトの近くでcyc遺伝子の大きな領域を増幅したことを考えると、ヘテロ接合の2つの別々のバンド、F₁蚊を観察...

ディスカッション

このプロトコルは 、Culex 蚊のゲノムに特定の突然変異を導入する方法を提示し、他の蚊のゲノムを編集するためにも使用することができます。このプロトコルは、注射材料を準備する方法だけでなく、蚊に卵を産む方法の詳細なビデオ概要、ならびにそれらの卵を準備して注入する方法の詳細なビデオ概要を提供するという点で重要です。また、メスの Cx.ピピエン の生物学を利用して個々のいかだに卵を産み、それによって各女性から所望の突然変異に対する子孫の割合を小さくスクリーニングする方法についても要約する。ここで示す方法は Cx.pipiens 用に最適化されていますが、小さな調整で他の蚊や昆虫のゲノムを編集するように適応することができます。さらに、ここで説明するマイクロマニピュレーションおよびマイクロインジェクションプロトコルは、トランスポゾン、dsRNAまたはTALENまたはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの他のエンドヌクレアーゼを含む昆虫胚にいくつかの異なる材料を注入するのに適しています。さらに、ベベルプロトコルは可変的な開口サイズのマイクロ注入の針を生成し、広範囲の注入材料を注入するために使用する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工膜フィーダー	Hemotek	SP5W1-3	会社所在地:英国ブラックバーン
ATP	Invitrogen	18330019	会社所在地:米国カリフォルニア州カールスバッド
ホウケイ酸ガラス ミロカピラリーチューブ、外径1 mm	World Precision Instruments	1B100-6	会社所在地:米国フロリダ州サラソタ
BV10 ニードルベベラー	サッター機器	BV-10-B	会社所在地:米国カリフォルニア州ノバト
Whatman 円形濾紙(12.5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	会社所在地:米国ミズーリ州セントルイス
コニカルチューブ(50 mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339652	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
流量のフィッシャーブランドコース濾紙	モフィッシャーサイエンティフィック	09-800	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
カバーガラス(24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
タルダム	Henry Schein Inc	1010171	会社所在地:米国ニューヨーク州メルビル
スコッチ両面テープ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NC0879005	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
FemtoJet 4iマイクロインジェクター	ッペンドルフ	5252000021	会社所在地: ドイツ、ハンブルク
ガラスバイアル (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	会社所在地: 米国マサチューセッツ州ウォルサム
ハロカーボンオイル	Sigma Aldrich	H8898-50ML	会社所在地: 米国ミズーリ州セントルイス
P-2000 レーザーニードルプーラー	サッター機器	P-2000/G	会社所在地: 米国カリフォルニア州ノバト
パラフィルム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50-998-944	会社の所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
PC-100加重ニードルプーラー	ナリシゲ	PC-100	これは、製造中止になった以前のPC-10モデルと互換性があります。会社所在地:米国ニューヨーク州アミティビル
Phire Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F140WH	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
石英ガラスミロカピラリーチューブ、外径1 mm	ピラリーチューブサプライズ	Limited QGCT 1.0	会社所在地:英国
コーンウォールガイド-it™sgRNAスクリーニングキット	Takara, Bio USA	632639	このキットでは、gRNAがin vitroでDNA配列を切断するかどうかを判断できます。会社の所在地:米国カリフォルニア州マウンテンビュー
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	会社の所在地:米国ミズーリ州セントルイス
小型ペトリ皿(35X10 mm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50-190-0273	会社の所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
エン酸ナトリウム鶏の血	Lampire 生物製剤	7201406	会社の所在地:米国ペンシルベニア州エベレット
フィッシャーブランドスクエアペトリ皿(10 cm x10 cm)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	FB0875711A	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
テガダーム	リーシャイン社	7771180	会社所在地:米国ニューヨーク州メルビル
熱帯魚食品	テトラミン	N/A
Whatman濾紙	サーモフィッシャーサイエンティフィック	09-927-826	会社所在地:米国マサチューセッツ州ウォルサム
Whatman濾紙、4.25cm	シグマ・アルドリッチ	1001-042	会社所在地:米国ミズーリ州セントルイス