3次元共培養システムNICO-1を用いた卵巣癌幹細胞様細胞の血管遺伝学的特性の評価

サマリー

卵巣がん幹細胞(OCSC)は、がんの開始、再発、治療抵抗性、および転移の原因です。OCSC血管ニッチは、OCSCの自己複製を促進し、化学療法抵抗性につながると考えられています。このプロトコルは、in vitroで再現可能なOCSC血管ニッチモデルを確立するための基礎を提供します。

要約

癌幹細胞(CSC)は支持ニッチに存在し、隣接する間質細胞、血管、および細胞外マトリックスで構成される微小環境を構成します。CSCが内皮の発生に関与する能力は、腫瘍形成および腫瘍転移のメカニズムの一般的な理解に直接寄与する重要な特性を構成する。この研究の目的は、卵巣癌幹細胞(OCSC)の腫瘍開始能力を調べるための再現性のある方法論を確立することです。ここでは、in vitro共培養モデルNICO-1を用いて、内皮細胞とOCSCsの新生血管形成機構と内皮細胞の形態変化を調べました。このプロトコルにより、OCSCを取り巻く新生血管形成ステップを経時的に視覚化できます。この技術は、腫瘍転移におけるOCSCの血管新生特性に関する洞察を提供することができます。

概要

卵巣がんは、世界で8番目に多い女性悪性腫瘍であり、年間約30万人の新規診断と推定18万人の死亡があります¹。最初の診断では、卵巣がんはしばしば重篤な症状を呈し、患者の約75%がすでにステージIII〜IVにあります。したがって、5年生存率は<30%であり、死亡率は婦人科がんの中で最も高く²、卵巣がんの治療効率は、減量手術の成功、化学療法に対する抵抗性、初期治療後の再発などの臨床的要因に大きく依存しています。

卵巣がん組織は階層的に組織化されており、すべての腫瘍成分が等しく子孫を生成できるわけではありません。自己複製して不均一な腫瘍細胞集団を産生できる唯一の細胞は、癌幹細胞(CSC)^{を表すと考えられています3}。CSCの自己複製および腫瘍開始は、支持ニッチを維持する目的でそれらの腫瘍微小環境を再構築するための血管新生の促進を伴う。しかし、従来のモデルは、複数回継代後のスフェロイドの破壊により、臨床サンプル由来のCSCの培養の再現性が限られていたため、in vitro分析に利用できませんでした。最近では、患者からCSCを培養する実験方法がいくつかの用途のために開発されている⁴、^5、6

プロトコル

すべての手順は、人間の福祉のための倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で実行されました。すべての患者は、サンプルの研究使用について書面によるインフォームドコンセントを提供し、この研究のための組織の収集と使用は、帝京大学のヒトゲノム遺伝子解析研究倫理委員会によって承認されました。

1.レベル2のバイオセーフティキャビネットでの卵巣がんおよび腹水患者からの卵巣がん幹細胞(OCSC)の分離と培養

1. 穿刺によって得られたヒト卵巣癌腹水から癌幹細胞を分離する。十分な数の癌幹細胞を採取するために、患者から少なくとも100〜250mLの腹水を採取します。さらに、フローサイトメトリーにより、がん幹細胞マーカー(EpCAM、カルレチニン、CD133、CD44、CD45、ALDH1、Oct4)および卵巣がんマーカー(pAX-8、WT-1)の発現プロファイルを評価します。
   1. ヒト卵巣癌腹水を300 x g で遠心分離し、腹水吸引後24時間以内に室温で10分間遠心分離します。
   2. 上清を除去し、2 mLのOCSC培地と8 mLの30%ヒストデンツ/リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)溶液を加えます。
   3. OCSC培地の準備:ステムプロhESCサプリメント、L-グルタミンを含むDMEM⁄F-12(グルタマックス培地)、25%BSA、100 μM 2-メルカプトエタノール、8 ng/mL FGF塩基性、10....

結果

スフェロイドの長期安定培養を行う目的で、手術や穿刺の際に進行卵巣癌患者から得られた腹水を採取した。今回われわれは,CSC1およびCSC2と呼ばれる卵巣CSCの長期スフェロイド培養の症例を提示する.両方の細胞株は、同じ診断および組織学的プロファイルを有する。OCSCを取り巻く内皮細胞の新生血管形成を誘導するために必要な内皮細胞との相互作用の根底にあるOCSCの機構的役割は不明のままです。そこで、転移部位におけるCSC血管ニッチの発生過程を明らかにすることを目指した。内皮細胞(HUEhT-1)とOCSCの相互作用をin vitro共存モデルNICO-1を用いて検討した。 図1 は、CSC1とCSC2によって誘導される管形成活性の比較を示す。形成された血管管の数は、CSC2との共培養において時間とともに劇的に増加した(図2A)。ポジティブコントロールについて、CSC2の共培養なしでVEGF(10 ng / mL)を処理した後のHuEhT-1の血管新生特性を示す.......

ディスカッション

提示されたプロトコルは、インビトロ設定でOCSCの腫瘍微小環境を模倣する方法を説明しています。本方法の主要構成要素は、間接的なTranswell共培養システムであるNICO-1システムを用いて得られた再現性の高い共存モデルを構成する。現在利用可能な共培養モデルの多くは、共培養細胞集団に対する細胞間直接接触の影響を調べています12、13、¹⁴、^15、16、^17、18。共培養の効果を調べるために使用できる最も単純なモデルは、2つの細胞型の直接混合によって再現することができ、ヘテロタイプおよびホモタイプの相互作用の程度は、各細胞タイプの播種密度および亜集団の相対播種比を変更することに.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.025%トリプシン	サーモ	R001100
10 mLピペット	サーモ	170356N
1250 µL ピペットチップ	QSP	T112XLRS-Q
15 mL チューブ	Nunc	339650
200 µL ピペットチップ		QSP T110RS-NEW
2-メルカプトエタノール	サーモ (Gibco)	21985023
5 mL ピペット	サーモ	170366N
50 mL チューブ	コーニング	430290
AccuMAX	Innovative Cell Technologies	AM105
BioCoatTM コラーゲン I 60mm ディッシュ	コーニング	356401
遠心分離機	クボタ	2800
Costar 6 ウェル クリア フラットボトム 超低付着 マルチウェルプレート	コーニング	3471
内皮細胞増殖培地 2	プロモセル	C-22011
エタノール	和光	057-00456
FGF-Basic	Thermo (Gibco)	PHG0021
Histodenz	SIGMA	D2158
HUEhT-1 cell	JCRB Cell Bank	JCRB1458
ICCP Filter 0.6 µm	銀嶺研究室	2525-06
インスリン、ヒト	SIGMA(ロシュ社)	11376497001
ルミノメーター	パーキンエルマー	ARVO MX-flad
マトリゲルマトリックス	コーニング	356234
顕微鏡	横河	CQ-1
NICO-1	銀嶺研究室	2501-02
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005290
P1000 ピペット	ギルソン	F123602
P200 ピペット	ギルソン	F123601
PBS	サーモ (ギブコ)	14190-144
StemPro hESC SFM	サーモ (ギブコ)	A1000701
トランスファーピペット	ファルコン	357575
Y-27632	和光	253-00513

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