実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

サマリー

このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。

要約

実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)は、自己抗原に反応する免疫細胞によって引き起こされます。この非感染性の眼内炎症性疾患モデルの多くの特徴は、ヒトに影響を与える後部ブドウ膜炎の臨床表現型を再現しています。EAUは、新規炎症治療薬の有効性とその作用機序を研究し、眼内疾患の疾患進行を支えるメカニズムをさらに調査するために確実に使用されています。ここでは、C57BL/6Jマウス(この病気にかかりやすい最も広く使用されているモデル生物)におけるEAU誘導に関する詳細なプロトコルを提供します。疾患の重症度と進行の臨床評価は、眼底鏡検査、組織学的検査、フルオレセイン血管造影を使用して実証されます。誘導手順には、眼タンパク質光受容体レチノイド結合タンパク質(レチノール結合タンパク質3としても知られている)、完全フロイントアジュバント(CFA)からのペプチド(IRBP_1-20)を含むエマルジョンの皮下注射が含まれ、死滅した結核菌が補充されます 。 首の後ろにこの粘性エマルジョンを注射した後、 百日咳菌 毒素を腹腔内注射します。症状の発症時(12〜14日目)および全身麻酔下で、臨床検査を通じて疾患の進行を評価するために眼底鏡画像を撮影します。これらのデータは、後の時点およびピーク疾患(20〜22日目)のデータと直接比較でき、違いを分析します。同時に、このプロトコルにより、研究者はフルオレセイン血管造影を使用して血管透過性と損傷の潜在的な違いを評価することができます。EAUは、野生型または遺伝子組み換えの両方の他のマウス系統で誘導することができ、薬効および/または疾患メカニズムを研究するための柔軟性を提供する新しい治療法と組み合わせることができます。

概要

このプロトコルは、C57BL / 6Jマウスで実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)を誘発する方法を実証します 乳化アジュバント中の網膜抗原の単回皮下注射による。疾患の進行を監視および評価する方法は、眼底鏡画像と組織学的検査を通じて詳細に説明され、測定パラメーターが概説されています。さらに、フルオレセイン血管造影、網膜血管構造および透過性を調べるための技術についても議論する。

このEAUモデルは、臨床病理学的特徴と疾患を引き起こす基本的な細胞および分子メカニズムに関して、ヒトにおける非感染性後部ブドウ膜炎の中心的な特徴を要約します。EAUは、養子導入実験およびIFNγ枯渇マウスで示されているように、自己反応性CD4⁺Tリンパ球のTh1および/またはTh17サブセットによって媒介されます¹。ブドウ膜炎におけるこれらの細胞の潜在的な役割に関する私たちの理解の多くは、網膜組織内でTh1細胞とTh17細胞の両方が検出されるEAU²の研究から来ています³。多くの場合、EAUは、弱毒化疾患における新規治療法の有用性を評価するための前臨床モデルとして使用されます。EAU疾患の調節に成功した治療アプローチは、臨床である程度の有効性を示し、FDA承認のステータスに達しました。これらの例は、T細胞標的療法などの免疫調節薬のグループである:シクロスポリン、FK-506、およびラパマイシン^4,5,6。最近、疾患の転帰に対するメカニズムと影響の両方を調査するために、このモデルで新しい経路を標的とする介入も検討されています。これらには、クロマチンリーダーブロモドメイン末端外(BET)タンパク質およびP-TEFb阻害剤を介した転写調節の標的化が含まれます³。さらに、VLA-4阻害剤などのより従来のアプローチは、最近、エフェクターCD4⁺ T細胞の調節を介したEAUにおける抑制を実証しました⁷。また、Th17細胞をRORγtインバースアゴニストであるTMP778で標的にすると、^EAU8を有意に抑制することも見出されている。さらに、このモデルは、網膜の慢性自己免疫性炎症と、リンパ球プライミングなどの付随する根本的なメカニズムを研究する機会を提供します。

EAU前臨床試験の主な読み出しは、網膜眼底鏡検査イメージングを実行することによる臨床評価であり、光干渉断層撮影(OCT)による網膜の完全性を評価することによる頻度は低くなります。次に、フローサイトメトリーによる網膜細胞の網膜組織病理学的評価と免疫表現型検査が終了時に行われます。眼底鏡検査は、網膜全体の迅速かつ再現性のある臨床評価を可能にする使いやすいライブイメージングシステムです。免疫組織化学的評価のために、技術は網膜切片の準備に基づいており、炎症と構造的損傷の程度について組織構造を研究することができます⁹。使用されるすべての技術の評価基準と従来のスコアリングシステムは、このプロトコル内で概説されます。眼底鏡イメージングを使用して記録された損傷の程度は、しばしば組織学的変化と密接に相関しています。疾患の重症度を監視および評価するためのこの二重のアプローチにより、より高い感度と信頼性の高い測定結果が得られます。

EAUは、免疫介在性眼疾患の前臨床試験および調査に広く使用されている、確立されたモデルです。このモデルは、>95%の疾患発生率で信頼性が高く再現性があり、世界中の労働年齢失明の主な原因である眼内炎症性疾患の治療のための新しい治療法を検証または否定するために使用できる包括的なデータを生成します¹⁰。

プロトコル

すべての実験は、1986年の英国動物(科学的手順)法、および制度的動物福祉および倫理審査機関(AWERB)のガイドラインに従って実施されました。

1. C57BL/6Jマウスの収容

1. ハウスマウスを特定の病原体のない環境下で、12時間の明暗サイクルで、食物および水を 自由摂取で利用可能とする。
2. 成人女性C57BL / 6Jですべての実験を実行します(ブドウ膜炎患者では女性から男性の発生率が1.4対1であるため、女性が優先的に選択されます)。6〜8週齢の雌C57BL / 6Jマウスを体重と年齢でランダム化します。ケージあたり5〜6匹のマウスのグループで、個別に換気されたケージ(IVC)にマウスを収容します。

2. C57BL/6マウスの免疫

1. IRBP_{1-20 -} CFAエマルジョン調製
   注:エマルジョン調製は、疾患の再現性と発生率に不可欠です。そのため、準備プロセス全体および実験全体で一貫性を維持するためにあらゆる努力を払う必要があります。エマルジョンを調製するとき、損失は事前にすべての試薬の計算で考慮されるべきです。この損失は、免疫化が計画されているマウスの数に基づいて、約1.5倍(または準備された量の50%追加)になる可能性があります。以下の例を参照してください。10匹のマウスを免疫するには、15匹のマウスを準備し、400 μg(マウス20 gあたりのペプチド)x 15 マウス= 6 mgを使用します。各マウスは、免疫のために200 μL(合計3 mL)を受け取る必要があります。最終容量は、ペプチド溶液とCFAの1:1の比率で構成されているため、1.5 mLのペプチド溶液と1.5 mLのCFAが含まれます。
   1. 無菌技術を使用して、層流キャビネット内のすべての滅菌溶液を調製します。
   2. ヒトIRBP_1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT)凍結乾燥ペプチドの所望の量(マウス20gあたり400μg)を秤量する。ペプチドを100%DMSOに溶解します。ストックは凍結乾燥の形で-20°Cで保存してください。
      注意: 粉末が完全に溶解していることを確認するには、各フレークが最初にDMSOと接触し、残留固体の兆候を示さないようにする必要があります。PBSを少しずつ追加して、最終的なボリュームに到達します。渦と混ぜないで、代わりにピペットで穏やかに攪拌してください。DMSOの最終濃度は、全ペプチド調製量の1%を超えてはなりません。底がテーパー状の20 mLプラスチックチューブでエマルジョンを調製すると、凍結乾燥粉末へのDMSOのアクセス性が向上します。
   3. すでに1.5 mg/mLの死滅した 結核菌 を添加したCFAにDMSO-PBSペプチド溶液を1:1 v/vで添加し、最終濃度2.5 mg/mLにします。滴下し、穏やかかつ頻繁にピペッティングして、粘性のある均一に分布したエマルジョンを形成します。
   4. 1000 μLのピペット(さらなる損失を防ぐために700 μLに設定)とピペットを使用してペプチド溶液とCFAを通気し、クリーミーで濃厚な粘稠度を生成します。この技術では、ピペットを使用して、目的の厚さに達するまで上下に繰り返し吸引します。最適な結果を得るには、注射前に抗原溶液とアジュバントが完全に混合されていることを確認してください。
2. 百日咳毒素の腹腔内注射
   1. 1.5 μgの 百日咳 菌毒素を、1%マウス血清を添加した100 μLのRPMI 1640培地に懸濁します¹¹。
   2. 滅菌注射器と23G針でi.p.注射を行います。
      注:注射部位への障害を避けるために、百日咳毒素は抗原を注射する前に投与する必要があります。
   3. 各マウスを一時的に別々のケージに移し、 百日咳菌 毒素の100 μL i.p.注射を1回受けます。
3. IRBPエマルジョンの皮下注射
   1. 次に、IRBPエマルジョンを皮下注射する。このプロセスでは、健康と安全の規制に従って適切に保護された2人の動物取扱者が必要です。
   2. 訓練を受けた1人に、ケージの上部にあるマウスを首筋のような姿勢で軽く拘束し、胃を下に向けてもらい、もう1人の訓練を受けた人に皮膚をつまんで首の後ろにテントのような構造を形成し、針を挿入して指と親指の間に挿入できるようにします。
      注意: 針刺しによる怪我の危険があります。
   3. 針を配置したら、200 μLのIRBPエマルジョンを注入します。針を抜くときは、針頭を回転させて皮膚を閉じてから引き抜き、その後注射部位に圧力を加えて乳液の逆流を防ぎます。
      注意:エマルジョンは、刺激を引き起こし、より重篤な場合には病変が発生する可能性があるため、マウスの皮膚や毛皮と接触してはなりません。これが発生した場合は、70%エタノールを使用してその領域を直ちに完全に拭いてから乾燥させる必要があります。
      注:研究の最後に検査のために排液リンパ節が必要な場合、注射部位は異なります。この場合、脇腹の両側に100μLを皮下注射します。これにより、排出中の鼠径リンパ節でより強い反応が得られ、収穫時に切除することができます。ただし、意図した結果がEAUの発症のみである場合は、複数の注射部位からの不快感を避けるために、首の後ろに200μLの単回注射が好ましい。

3.臨床評価-マウス眼底検査

注:臨床疾患は、眼底検査、眼底鏡を使用した明視野ライブイメージング、および視覚化に使用されるDiscoverソフトウェアを使用してスコアリングされます。

1. 疾患発症時(12〜14日目)に、ケタミン(50 mg / mL)とドミトール(メデトミジン;1 mg / mL)の両方を組み合わせて全身麻酔下でマウスを鎮静させます。.1部ドミターを希釈する。ケタミン1.5部と滅菌注射水2.5部を、次に腹腔内に30gあたり100μLを注入します。上記の麻酔の組み合わせには、1mLの滅菌注射器と23Gの針を使用してください。
2. これに続いて、マウスを監視して、すべての反射が失われ、刺激に反応しなくなることを確認します。
3. i.p.注射を受けた直後、マウスがまだ首筋に保持されている間に、瞳孔拡張のために1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンを各眼に局所的に塗布します。.両方の拡張液で角膜を完全に覆うことを目指します。瞳孔が完全に拡張するまでに数分かかる場合があります。
4. その後、目の粘性軟膏をたっぷりと塗り、目を完全に潤滑して水分補給するために、イメージングプロセス全体を通して維持します。
5. それまでの間、ソフトウェア(ディスカバーなど)を開き、明視野下で画像をキャプチャするようにファンドスコープ(マイクロンなど)を設定します。個々のマウスにフォルダを割り当て、撮影した各目に応じてRまたはLで画像にラベルを付けます。
6. ライブビジュアライゼーション用の専用ステージにマウスを取り付け、網膜に完全にアクセスできるように顕微鏡を配置します。
7. 疾患を正確に表現するには、視神経乳頭に加えて末梢のすべてのコーナーをカバーする網膜領域全体の画像を撮ります。これを実現するには、接眼レンズ全体を調整します。イメージングプロセス全体を通して、目が常に完全に潤滑されたままであることが重要です。一定の割合で目の軟膏を補充することによってこれを確実にしてください。
8. この段階でセクション4(下記)を参照して、フルオレセイン血管造影を実行してください。
9. すべてのイメージングが完了したら、麻酔薬逆転鎮静剤(5 mg / mL抗セダン)を注射可能な水で希釈し、0.1 mg / kgのi.p.で投与します。マウスをケージに戻し、回復するまで湿らせた食事にアクセスできる予熱したマットの上に置きます。完全な回復は、全身の動きと安定した歩行でケージの周りを歩くことを特徴としていますが、通常は数時間かかります。
10. 指定された実験エンドポイント(例:.、21〜23日目)で、手順4.1〜4.5を繰り返し、網膜領域全体の写真を再度撮り、視神経乳頭と周辺のすべてのコーナーを覆い、疾患の正確な表現をキャプチャします。

4.フルオレセイン血管造影

1. これらの動物の血管漏れを測定するには、麻酔下で、各マウスに2%フルオレセインを首の後ろに皮下注射し、網膜がライブ画像の中央に集中するように配置します。
2. 眼底鏡を465〜490nmの青色光励起フィルターに設定します。励起フルオレセインから捕捉される光は、520〜530nmの間である。
3. フルオレセイン注射後1.5分後、各網膜の写真を撮り、7分後に再度繰り返します。
   注:これらのイベントではタイミングが重要であり、両方をキャプチャできない場合は、片方の目を画像化するだけです。

5.臨床疾患スコアリング

1. 視神経乳頭の炎症、網膜血管カフ、網膜組織の浸潤および構造的損傷の重症度に基づいて臨床評価を行います。
2. これらのパラメータのそれぞれに0から5までのスケールでスコアを授与し、集合的な合計は眼全体の臨床疾患を表しており、眼あたり最大スコアは20です。 表1 は、スコアリング基準のガイドとして使用できます。

6.組織学および組織学的スコアリング

1. 頸部脱臼によってマウスを安楽死させた後、眼全体に簡単にアクセスできるようにまぶたを離して目を除核します。
2. 次に、眼窩結合組織と視神経をつかむことを目的として、湾曲した鉗子を地球の後ろに置きます。地球を圧迫しないように注意してください。
3. 固定するには、網膜剥離を最小限に抑えるために最低15分間眼を4%グルタルアルデヒドに入れ、次に少なくとも24時間10%ホルムアルデヒドに移します。
4. パラフィンへの包埋、ミクロトームでの切片作成、および標準プロトコルに従って染色を行います。3〜4μmの断面厚さは、あらゆるタイプの染色に推奨されます。
5. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の標準プロトコルを使用して眼の組織学的検査を実施します。
6. 0〜4のスケールでスコアを割り当て、EAUスコアリングの基準に従って、網膜および脈絡膜内の免疫細胞浸潤の程度、網膜層の破壊、肉芽腫形成の程度、および網膜剥離の程度に基づいて、網膜損傷を示し、前述のように(Agarwal 2013)および表2に要約した¹¹。

結果

このプロトコルでは、IRBPに由来するブドウ膜生成網膜ペプチドをマウスに免疫することにより、実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)のモデルを段階的に誘導する方法を記載します。広く使用され、容易にアクセス可能なアプローチを採用した疾患の評価がカバーされていますが、これらは排他的ではなく、他の画像技術に追加されるか、部分的に置き換えられる可能性があります。C57BL/6JマウスにおけるEAUの最初の徴候は、 図1に示すように、免疫後2週間で検出され、疾患のピークは3週間以内に達することができます。眼底鏡下変化は、免疫細胞の浸潤や構造的損傷に基づく組織学的変化に加えて、網膜組織、血管および視神経乳頭の炎症、網膜構造損傷(図2)などの炎症性変化として疾患進行時に分類されます。これらの臨床的および組織病理学的変化は、免疫後最大85日間検出することができ、評価のために等級付けおよびスコアリングされ、疾患の進行を研究することを提案する。定性的視覚スコアリングにおける意図しないバイアスを避けるために、画像は複数の専門家によって評価される...

ディスカッション

実験動物モデルは、疾患の病因の研究や新しい治療パラダイムの前臨床試験に必要なツールです。現在のプロトコルでは、眼内炎症性ブドウ膜炎の実験モデルであるEAUを誘導、モニタリング、およびスコアリングするための方法論について説明しました。このEAUモデルは、全ての手順が本明細書に概説されたプロトコールに従って実施された場合に95%を超える疾患発生率を有し、慢性の単相性EAUの発症をもたらす。この発生率レベルを達成するために、抗原調製とエマルジョンの注射の重要性を強調します。動物におけるEAUの主な特徴は、網膜および/または脈絡膜炎症、網膜血管炎、光受容体破壊および視力喪失であり、これらはすべてヒト後部ブドウ膜炎の多くの本質的な臨床病理学的特徴を表しています¹²。ブドウ膜炎に関与する基本的な細胞および分子メカニズムの理解の多くは、本明細書に記載される誘導EAUモデルに由来する。EAUは、リンパ球によって認識される網膜抗原による能動免疫によってマウス¹³ およびラット¹¹ において誘導され得る。これらの網...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
antisedan	ZOETIS、完全な	目覚めさせた
のアジュバント;予防接種用CFA	シグマ、英国	F5881
ドミトール	・オリオン・ファーマ、フィンランド		麻酔
Flourescein	Sigma、英国	F2456	血管造影
用 IRBP1-20	>Chamberidge ペプチド、英国		ペプチド;抗原
ケタミン	オリオン ファーマ、フィンランド		麻酔
Micron III	Phoenix Research、米国		、眼底検査、
マウス血清	シグマ、英国	M5905	免疫
Mycobacterium terberculosis	Sigma、英国	予防接種用344289
百日咳毒素	シグマ、予防接種のための英国	P2980
塩酸フェニレフリン2.5%	ボッシュ&ロムUK	PHEN25	拡張用
拡張用トロピカミド1%	SANDOZ
Viscotears	WELDRICKS Pharmacy、英国	眼の潤滑のための	2082642