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方法論記事

一過性両側性頸動脈閉塞による虚血性筋炎損傷のマウスモデル

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DOI:

10.3791/61865

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2020年11月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Photobiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 3Animal eye care, Tokyo Animal Eye Clinic, 4Tsubota Laboratory, Inc.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、単純な縫合糸とクランプを用いた一過性両側共通頸動脈閉塞によるレチナル虚血のマウスモデルについて述べている。このモデルは、心血管異常によって引き起こされる虚血の病的メカニズムを理解するのに有用である。

要約

糖尿病性網膜症、網膜静脈または動脈の閉塞、眼性虚血症候群などの多様な血管疾患は、網膜虚血を引き起こす可能性があります。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、関連する実験モデルを開発する必要がある。解剖学的に、主な眼の血液供給血管は眼動脈(OpA)であり、OpAは一般的な頸動脈(CCA)の内頚動脈に由来する。したがって、CCAの破壊は効果的に、虚血の原因となりうる。ここでは、一過性両側性一般的な頸動脈閉塞(tBCCAO)によるレチナル虚血のマウスモデルを確立し、右CCAを6-0シルク縫合糸で結び付け、クランプを介して左CCAを一時的に2秒間閉塞させ、tBCCAOが急性レチナル虚血を誘発し、性間機能障害を引き起こす可能性があることを示した。現在の方法は、手術針とクランプのみを使用することによって手術器具への依存を減らし、中大脳動脈閉塞のマウスモデルによく見られる予期せぬ動物の死を最小限に抑えるために閉塞時間を短縮し、一般的な再発性虚血所見の再現性を維持する。このモデルは、マウスにおける虚血性網膜症の病態生理を調べるのに利用でき、さらにインビボ薬物スクリーニングに使用することができる。

概要

このレティナは、視覚機能のための神経感覚組織である。視覚機能には相当量の酸素が必要であるため、このレティナは体内で最も酸素要求の多い組織の1つとして知られている。このレティナは、酸素が血管を介して送達される血管疾患の影響を受けやすい。糖尿病性網膜症や網膜血管(静脈または動脈)閉塞などの血管疾患の様々なタイプは、網膜虚血を誘発することができます。レチナル虚血の病理的メカニズムを調べるには、再現性と臨床的に関連する、レチナル虚血の実験モデルが必要と考えられる。中大脳動脈閉塞(MCAO)は、インビボ歯止め薬の実験用虚血2,3の開発に最も一般的に利用される方法である内無血フィラメントの挿入による。MCAに対する眼動脈(OpA)の近接性のために、MCAOモデルは、網膜虚血4、5、6の病態生理を理解するために同時に使用される。脳虚血を、レチナル虚血と共に誘導するために、長いフィラメントは通常、一般的な頸動脈(CCA)または外頸動脈(ECA)の切開を通して挿入される。これらの方法は、実行するのが困難であり、手術を完了するのに長い時間(1つのマウスで60分以上)を必要とし、手術後の結果に高い変動性をもたらす7。これらの懸念を改善するために、より良いモデルを開発することが依然として重要です。

本研究では、短い一過性の両側CCA閉塞(tBCCAO)を針とクランプで使用してマウスの裂精虚血を誘導し、陰部における虚血性傷害の典型的な結果を分析した。このビデオでは、tBCCAO の手順のデモンストレーションを行います。

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プロトコル

ここに記載されている方法はすべて、慶應義塾大学医学部のIACUC(IACUC)の教育機関で承認されています。

1. 手術器具・動物の準備

  1. オートクレーブ手術器具を70%エチルアルコールに保ちます。新しい外科手術の前に、70%のエチルアルコールを使用して慎重に外科用器具を洗浄する。
  2. 雄BALB/cAJc1マウス(生後6週、26~28kg)を、手術前、手術中、手術後の無菌状態を維持するために、特異的病原体フリー(SPF)の部屋に準備します。

2. 一過性両側性大動脈閉塞(tBCCAO)

  1. ミダゾラム(40μg/100 μL)、メデトミジン(7.5 μg/100 μL)およびブトルファンノール酒石酸塩(50μg/100 μL)の組み合わせで腹腔内注射を介して麻酔下にマウスを入れて、前述の8,9と呼ばれる「MMB」と呼ばれる。マウスの背中のスキンを保持して、マウスが完全に麻酔状態になるまでマウスが目をぶつけないようにします。
    1. 麻酔の深さを判断するには、マウスのつま先を応答がなくなるまでつまんで、その方法は完全な麻酔10をチェックするために一般的に使用される。
      注:一般的に、マウスが眠りに落ちるためには5分未満が必要です。全身麻酔のための適切なレシピは、機関によって異なる場合があります。
  2. 麻酔下で目の乾燥を防ぐために、0.1%精製したヒアルロン酸ナトリウムアイドロップ溶液を1滴ずつ目に塗布します。
  3. 背中にマウスを置き、粘着テープを使用してマウスの足を固定します。
  4. 手術前に70%エチルアルコールを使用してマウスの首の領域を消毒する。
    注:毛皮の追加のクリッピングは、これが原因で、その後の皮膚の炎症11、12を引き起こす可能性があるため、実行されませんでした。
  5. 首の矢状切開をブレードで行う(図1)。
    注意:切開は首、胸骨、気管の間の正中線で行う必要があります。
  6. 唾液腺を慎重に2つの鉗子を使って分離し、それらを動員して基礎となるCCAを視覚化する。
  7. 右のCCAをそれぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から慎重に分離し、その構造を損なうことなく、CCAの下に2つの6-0シルク縫合糸を置きます。2つのネクタイをしっかりと結び、血流を遮断します(図1)。
    注:手順中に、小さな静脈が損傷する可能性があります。出血が見られる場合は、CCAを明確に可視化するために拭き取る必要があります。
  8. 左のCCAを構造に害を与えることなく、それぞれの迷走神経とそれに付随する静脈から注意深く見つけ、クランプで2秒間左CCAを閉塞させる(図1)。
    注:クランプ用の部位をマークするには、左CCAの下に6-0シルク縫合針を配置する必要があります。
  9. 左CCAを再開した後、6-0シルク縫合糸による首の縫合傷を、細菌感染を阻害するために、頸部に抗生物質(50μL)のダブを適用する。
    注:左CCAを再開するときに動脈壁を損傷しないようにクランプを柔らかく取り外します。
  10. マウスをマウスに0.75mg/kg注入し、深部麻酔から回復したマウスを助けます。マウスをプリヒーテッドパッドでマウスケージに戻します。
    注:マウスが胸骨の不備を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。
  11. マウスが目を覚ますときの痛みの管理のために、マウスに0.4mg/kgのブトルファンノール酒を注入します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。tBCCAOを成功させるための最初のヒントとして、マウスの眼瞼垂動が観察される(図2)。
  12. 安楽死のために、マウスにMMB混合物の3倍を注入し、実験のためにそれらを犠牲にする。

3. 一般的な観測(生存率と眼瞼下垂)

  1. 手術後、0日目(手術後)、1、3、7のすべての死因の生存率を確認してください。
  2. 4点の評価スケールで眼瞼垂れを評価する:1 = 垂れ下がらない、2 = 軽度の垂れ下がり(〜50%)、3 = 重度の垂れ下がり(50%以上)、4 = 眼の排出による重度の垂れ下がり。

4. レチン血性輸血

  1. マウスの左心室にFITC-dextran(25mg/mL)の200μLを注入し、マウスの眼科の血管13,14における輸血の観察に一般的に使用される。
  2. 循環後2分、目を欠核化し、4%パラホルムアルデヒドに1時間固定する。このレティナを注意深く得て平らに取り付け、先に説明した15を、蛍光顕微鏡を介して調べた。
  3. 4倍の倍率でレティナルマウント全体の写真を撮り、マージアナライザを使用して単一にマージします。
  4. NIH フィジー/ImageJ ソフトウェアの容器分析ツールを使用して、浸透した領域を測定します。

5. ウェスタンブロット

  1. tBCCAOの3時間及び6時間後、マウスの目を得て、すぐに冷たいPBSを含むペトリ皿に移して、レチナを単離する。
  2. レティナを分離した後、前述の9のようにウェスタンブロッティングを行う。
  3. 低酸素誘導因子-1α(HIF-1α;一般的な低酸素マーカー)およびβアクチン(内部ローディングコントロール)に対する抗体を一晩インキュベートし、続いてHRP共役二次抗体をインキュベートする。化学発光を介して信号を可視化.

6. 定量PCR (qPCR)

  1. 6、12および24時間後に、qPCRについて得られたレチナを処理し、前述の17.
  2. リアルタイム PCR システムを介して qPCR を実行します。使用するプライマーを 表 1に示します。ΔΔCT 法により、異なるトランスクリプトのレベル間の折り畳み変化を計算します。

7. 免疫検査(IHC)

  1. tBCCAOの3日後、マウスの目を得てパラフィンに埋め込む。
  2. パラフィン埋め込んだ目をミクロトームで切り、目の切片を得る。
  3. 前に説明した5μmの厚さの目の切片を脱パラフィン化し、染色する13.
  4. グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;レチナにおけるアストロサイトおよびミュラー細胞の信頼できるマーカー)に対する抗体と一晩のインキュベート、続いてアレクサフルオール555結合二次抗体のインキュベーション。
  5. DAPI(4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)を使用して、レチナの核を染色します。蛍光顕微鏡で信号を可視化。
  6. 前述の13、18:0=信号なし、1 = ガングリオン細胞層(GCL)の正のグリア端フィートの少ない、GCLから外核層(ONL)に到達する標識されたプロセスの数が少なく、3 = GCLからONLに到達する最もラベル付きされたプロセスで、4点の評価スケールでの形態スコア付けを評価する。

8. 電解法(ERG)

  1. tBCCAOの3日と7日後に、ガンツフェルトドーム、取得システムおよびLED刺激装置を用いてERGを行う、前述の9.
  2. 一晩の暗い適応の後、薄暗い赤色光の下でMMBの組み合わせでマウスを麻酔する。
  3. 0.5%のトロピックアミドと0.5%フェニレフリンの混合溶液を使用して瞳孔を拡張する。
  4. アクティブ電極をコンタクトレンズに置き、参照電極を口に入れます。
  5. 各動物の両眼からERG応答を得る。
  6. 様々な刺激で暗い適応の下でスコトピック応答を記録する。
  7. ベースラインから波の最低点までの波の振幅を測定します。
  8. 波の最も低い点からb波のピークまでのb波の振幅を測定します。
  9. ヒートパッドを使用して手順中にすべてのマウスを暖かく保ちます。

9. 光コハレンス断層撮影(OCT)

  1. tBCCAO の 2 週間後に、前に報告された8,9のように、SD-OCT システムを使用して OCTを実行します。
  2. 測定のために、対象マウスは0.5%のトロピックアミドと0.5%フェニレフリンの混合溶液によりマイドリア症を、MMBの混合物による全身麻酔にする。
  3. 赤道スライスのen-faceスキャンからBスキャン画像を取得します。
  4. 視神経の頭部から0.2、0.4および0.6mmのレティナを調べてください。
  5. レチナル神経繊維層(NFL)から外部制限膜(ELM)までのレチナル厚さを測定し、個々のマウスのレチナル厚として測定値の平均を考える。
  6. 結果をスパイダー ダイアグラムとしてプロットします。

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結果

2分間のFITC-dextranの全身循環後、恥動マウスおよびtBCCAO操作マウスにおける左右のレチナの眼管切開を調べた(補足図1)。FITC-dextranは、tBCCAO操作マウスのシャム操作マウスと左レチナの両方で完全に見えるが、tBCCAO操作マウスの右左部内で部分的に検出可能であった。

tBCCAOの後、眼瞼垂れを調べた(図2)。右目は軽度(スコア2;75%)を示したと重度のまぶた (スコア 3 と 4; 25%)左目は垂れ下がっていない間、垂れ下がった(スコア1;93.75%)1つのマウス(スコア2;6.25%)を除く。tBCCAO操作マウスでは眼の排出による眼下垂がかなり認められなかったが、この表現型(スコア4;6.25%)のマウスが1匹見られた。

組織における酸素状態の低下は、HIF-1αの安定化とEPO、VEGFおよびBNIP319、20、21...

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ディスカッション

この研究では、単純な縫合糸とクランプを使用したtBCCAOが、眼科虚血およびそれに伴う筋機能障害を引き起こす可能性があることを示している。さらに、我々は、レチナル虚血のマウスモデルの開発のための我々の現在のプロトコルは、2、3、7の陰部虚血損傷モデルの開発のための他の以前のプロトコルと比較してより簡単かつ迅速であることを実証した。

解剖学的には、左右の大脳動脈は、個々の血管24,25の閉塞または狭窄からの流れの中断に対して中枢神経系への十分な血液供給を維持するためにウィリスの円中に副循環を提供する後部伝達動脈(PCA)を介して接続することができる(図1)。Leeら. 示されたレチナル血中灌流は、C57BL6マウス

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、文部科学省(MEXT)から科学研究助成(KAKENHI)(18K09424から栗原敏秀、20K18393から三輪幸宏)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アチパメゾール塩酸塩ゼノアックアンチセダン抗麻酔用
アプライドバイオシステムズ 7500 ファストアプライドバイオシステムズqPCR用
酒石酸ブトルファノール明治製菓トルファレ麻酔用
BZ-IIアナライザーキーエンス-画像合成用
BALB/cAJc1CLEA-マウスstrain
β-Actin (8H10D10) マウス mAbCST3700ウェスタンブロット用
クランプ鉗子ワールド精密機器WPI 500451手術用
デュモン鉗子 #5ファインサイエンスツール11251-10手術用
DAPIソリューション同人堂340-07971IHC
用 Envisu SD-OCTシステムライカR4310OCTの場合
FITC-デキストランメルクFD2000S網膜血液灌流用
蛍光顕微鏡キーエンスBZ-9000蛍光検出用
ガチフロキサシン水和物千住製薬ガチフロ抗菌感染症用
GFAPモノクローナル抗体 (2.2B10)サーモ13-0300IHC用
加熱パッドマルカンRH-200用
HIF-1&α;(D1S7W)XP Rabbit mAbCST36169ウェスタンブロット用
ImageQuant LAS 4000 miniGE Healthcare-化学発光用
ミダゾラムサンド 株式会社サンドス麻酔
ミクロトーム組織-Tek TEC 6さくら-切片用
メデトミジンオリオンコーポレーションドミター麻酔
針用ホルダーハンダヤHS-2307手術用
PuRECMAYOCorporation-ERG
用 はさみファインサイエンスツール91460-11手術用
ヒアルロン酸ナトリウム参天製薬ハイアレイン眼の潤滑用
トロピカミド/ペニレフリン塩酸塩参天製薬Mydrin-P散瞳用
6-0 シルク縫合糸夏目E12-60N2手術用
ベ手術用

参考文献

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