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方法論記事

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

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DOI:

10.3791/62129

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2021年3月3日

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1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。

要約

多能性幹細胞由来心筋細胞(PSC-CM)は、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞(ES/iPS)細胞の両方から生成することができる。これらの細胞は、心疾患のモデリングのための有望な情報源を提供する。心筋症のサルコメア短縮は、成人型心筋細胞と共に疾患の型を調べるために使用される標準的な生理学的評価の1つである。しかし、これらの細胞は位相対比顕微鏡では見えないサルコメアを未発達にしているので、利用可能な方法はPSC-CMの収縮性を評価するのに適切ではない。この問題に対処し、PSC-CMでサルコメア短縮を行うために、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質および蛍光ライブイメージングを使用した。細いZ線とM線は、それぞれ両端とサルコメアの中心に存在する。z-ラインタンパク質は、αアクチニン(ACTN2)、テレトニン(TCAP)、アクチン関連LIMタンパク質(PDLIM3)、および1つのM線タンパク質であるミオメシン-2(Myom2))を蛍光タンパク質でタグ付けしました。これらのタグ付きタンパク質は、内因性対立アレスからノックインまたはアデノ関連ウイルス(AAV)から発現することができる。ここでは、マウスとヒト多能性幹細胞を心筋細胞に分化し、AAVを産生し、ライブイメージングを行い、分析する方法を紹介します。また、PSC-CMのパターン培養用ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプの製造方法についても説明し、蛍光タグ付きタンパク質によるサルコメア短縮の解析を容易にします。サルコメアの短縮を評価するために、拍動細胞のタイムラプス画像を電気刺激(0.5〜1Hz)下で高フレームレート(毎秒50〜100フレーム)で記録した。細胞収縮の過程でサルコメアの長さを分析するために、記録されたタイムラプス画像はImageJ / FijiのプラグインであるSarcOptiMに施されました。我々の戦略は、PSC-CMにおける心疾患のフェノタイプを調査するための簡単なプラットフォームを提供する。

概要

心血管疾患は、世界的に死亡率の主な原因である1と心筋症は、心臓関連死の第三の原因を表す2.心筋症は、心臓の筋肉に影響を与える疾患の集合群です。近年のiPS細胞の誘導多能性幹細胞の開発と、iPS細胞の心筋細胞(PSC-CM)に向けた指向分化が開かれて、心筋症のインビトロモデルとして患者ゲノムを用いた心筋細胞を研究する扉が開かれています。これらの細胞は、心疾患の病態生理を理解し、その分子機構を解明し、異なる治療候補3を試験するために使用することができる。多大な関心があり、したがって、患者由来のiPS細胞が生成されている(例えば、肥大性心筋症[HCM]4、5、不整脈性右心室心筋症[ARVC]6、拡張型心筋症[DCM]7、およびミトコンドリア関連心筋症8、9)。心筋症の特徴の1つはサルコメアの機能不全と破壊であるため、サルコメア機能を均一に測定する有効なツールが必要です。

サルコメア短縮は、サルコメア機能および動物モデルおよびヒトに由来する成体心筋細胞の収縮性を評価するために最も広く使用されている技術である。サルコメア短縮を行うためには、位相コントラスト下で見えるよく発達したサルコメアが必要である。しかしながら、インビトロディスプレイ培養されたPSC-CMは、未発達で組織化されていないサルコメアを培養し、したがって、サルコメア短縮10を適切に測定するために使用することができない。PSC-CMの収縮性を適切に評価するこの難しさは、インビトロで心臓機能を評価するためのプラットフォームとしての使用を妨げる。PSC-CMの収縮性を間接的に評価するために、原子間力顕微鏡、マイクロポストアレイ、トラクションフォース顕微鏡、およびインピーダンス測定が、これらの細胞がそれらの周囲に及ぼす運動の影響を測定するために使用されてきた。実際の細胞運動のより洗練された、より侵襲性の低いビデオ顕微鏡記録(例えば、SONYからのSI8000)は、それらの収縮性を評価するために使用することができるが、しかし、この方法はサルコメア運動または力発生動態14を直接測定しない。

PSC-CMのサルコメア運動を直接測定するために、サルコメアタンパク質への蛍光タグ付けなどの新しいアプローチが出現しています。例えば、Lifeactは、サルコメア運動15,16を測定するために糸状アクチン(F-actin)にラベルを付けるために使用される。遺伝子組み換えiPS細胞は、サルコメアタンパク質(例えば、αアクチニン[ACTN2]およびミオメシン-2[MYOM2])を蛍光タンパク質17、18、19によってタグ付けするためのもう一つの選択肢である。

本論文では、Myom2-TagRFP(マウス胚性幹細胞[ES]細胞)およびACTN2-mCherry(ヒトiPS細胞)を用いてサルコメア短縮を測定するためのタイムラプスイメージングを行う方法について述べた。我々はまた、パターン化された文化がサルコメアのアライメントを促進することを示す。さらに、患者由来のiPS細胞に広く応用できるアデノ関連ウイルス(AAV)を用いたサルコメア標識の代替方法について述べています。

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プロトコル

1. マウス多能性幹細胞の分化

  1. マウスES細胞のメンテナンス
    1. メンテナンス培地:50mLのウシ胎児血清(FBS)、L-アラニン-L-グルタミン5mL、非必須アミノ酸5mL(NEAA)、100mMナトリウムピルビン酸ナトリウム、55mM 2-メルカプトエタノールの909 μlを450 mLの最小必須培地(GMEM)に混合します。補充白血病阻害因子(LIF)、CHIR-99021、PD0325901を最終濃度1000 U/mL、1μM、3μMでそれぞれ補充します。0.22 μmフィルターを介して培地を殺菌します。
    2. FBS培地:55mLのFBS、L-アラニン-L-グルタミン5.5mL、ピルビン酸ナトリウム5.5mL、NEAA5 mLから500mLのダルベッコの変性イーグルミディアム(DMEM)高グルコースを混合します。0.22 μmフィルターを通して培地を濾過して滅菌します。
    3. 培養SMM18マウスES細胞では、TagRFPが前述の18のように、維持培地中のゼラチン化された6cm皿上のMyom2遺伝子座にノックされた。2~3日ごとに通路。
  2. 無血清分化(SFD)培地の調製
    1. Basal SFD:ハムのF-12の250 mL、イスコーブの修正ダルベッコ培地(IMDM)の750 mL、B27サプリメントからビタミンAを差し引いた10 mLを混ぜて、 N2サプリメントの5 mL、L-アラニン-L-グルタミンの10 mL、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%のウシ血清アルブミンの5 mL、ペニシリンおよびストレプトマイシンの10 mL(10,000 U/mL)。0.22 μmのストレーナーを通してフィルターを切り取り、殺菌する。
    2. アスコルビン酸を蒸留水に5mg/mLで溶解し、0.22 μmのストレーナーを通して濾過して滅菌します。
    3. 1-チオグリセロールの13 μLを1 mLのIMDMに希釈します。本明細書において、この希釈された1-チオグリセロールをMTGと呼ぶ。
    4. 使用日に1mLの基底SFDに10μLのアスコルビン酸(5mg/mL)と3μLのMTGを加えます。本明細書において、この混合物を完全なSFDと呼ぶ。
  3. 0日目、分化のための胚体(EB)形成
    1. SMM18マウスES細胞を組換えトリプシン様プロテアーゼ(rトリプシン)で収穫し、細胞を数えます。
    2. 遠心分離5 x 105細胞を300 x gで4°Cで3分間、完全なSFDの10 mLで再懸濁し、10cmのペトリ皿に播種する。細胞を37°Cで5%CO2で50時間培養した。
  4. 分化2日目
    1. アクチビンA、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGF)、および骨形態形成タンパク質4(BMP4)を加えて、それぞれ5ng/mL、5 ng/mL、および1.9ng/mLの最終濃度でSFDを完了する。
      注:BMP4濃度はBMP4のロットによって異なる場合があります。新しいロットを使用する前に小規模試験でいくつかの濃度をテストし、心臓分化のための最良の濃度を決定します。
    2. ペトリ皿から15mLチューブに、遠心分離機を50~100 x gで4°Cで3分間転送します。
    3. 一方、手順1.4.1で調製した培地をペトリ皿に加えて、残りのEBが乾燥するのを保護します。
    4. 上清を15 mLチューブから吸引し、ペトリ皿の中の培地でEBを再懸濁し、EB溶液を皿に戻します。その後、37°Cで5%CO2の46時間の培養を行います。
  5. 分化4日目
    1. ゼラチン化し、10cmの組織培養処理皿を、0.1%のゼラチンの5〜10mLで少なくとも5分間培養した。細胞を播種する直前にゼラチンを吸引する。
    2. 培地を準備する:塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF10、およびhVEGFを混合して、それぞれ5 ng/mL、25 ng/mL、および5 ng/mLの最終濃度でSFDを完了する。10cmの皿の場合は、10 mLを準備します。
    3. ペトリ皿から15mLチューブに細胞を移す。ペトリ皿にPBSの5mLを加え、数回洗浄し、残りの細胞を収集するために15mLチューブに移します。50〜100 x gで遠心分離機、 4 °C、 3 分.
    4. 吸気上清、rトリプシン1 mLを加え、37°Cで3分間インキュベートする。
    5. 渦は短時間でEJBの解化を行い、9 mLのFBS培地を加え、再び渦を加え、細胞を数える。
    6. 遠心分離機1.5 x 107細胞を300xgで、4°Cで3分間、ステップ1.4.2で調製した培地で再懸濁し、ゼラチン化皿に播種する。37°C、5%CO2で2日間インキュベートする。
      注: 7 日目または 8 日目までに、PSC-CM の広範な拍動が観察されます。
  6. 分化日7および9の薬物選択:分化の7日目と9日目に非心筋細胞を排除するために、プロマイシン(最終濃度で2μg/mL)で培地を再供給する。
    注:SMM18の親のラインはsyNP4マウスES細胞であり、NCX1プロモーター駆動のピューロマイシン耐性遺伝子20を収容する。
  7. 10日目、将来の実験のために再プレート
    1. ガラス底培養プレートまたはポリマーカバースリップを含む35mmのイメージング皿に0.1%ゼラチンをコーティングします。成熟を高めるには、ラミニン-511 E8フラグメント(LN511-E8)を1 μg/cm2 で室温18で30〜60分間コーティングします。PSC-CMを特定のパターンで培養するには、ポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプを準備するためのステップ4と5を参照してください。
    2. SMM18 PSC-CMを収穫するには、PBSで皿を2回洗い、1mLのrTrypsinを塗布し、37°Cで3分間インキュベートします。
    3. 10%FBS培地の9 mLのセルを収集し、セルを中断し、カウントします。24ウェルプレートの1つのウェルまたは35mmイメージング皿の250,000-500,000細胞の1つのウェルに50,000-100,000細胞で細胞をプレートします。
    4. 遠心分離機は十分な数の細胞(300xg、3分)を有し、FBS(最終濃度10%)を補充した完全なSFDで細胞を再懸濁する。
    5. 一晩インキュベートし、培養培地を変更して、ピューロマイシンでSFDを完了する。
    6. 14日目から、Myom2-RFPが顕著になる21-28日目まで、完全なSFDで週に2〜3回培養培地を変更する。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質のAAVベースのトランスダクションについては、ステップ3をご参照ください。

2. ヒト多能性幹細胞の分化

  1. 分化メディアの作成
    1. RPMI+B27-Ins: 500 mLの RPMI 1640培地、10 mLの B27 マイナスインスリン、および 5.25 mL の L-アラニン-L-グルタミンを混合します。
    2. RPMI+B27+イン:500 mLのRPMI、10 mLのB27サプリメント、および5.25 mLのL-アラニン-L-グルタミンを混合する。
  2. ヒトiPS細胞の維持
    1. ヒトiPS細胞を週2回、LN511-E8でAK02Nを用いて、いくつかの修正を加えた以前に公表された方法に従う。
    2. rトリプシンの3分の処置で細胞を収穫し、10%FBS媒体に集める。細胞と遠心分離機を300xgで4°Cで3分間カウントします。 シード 75,000-125,000 細胞は、6 ウェルプレートの 1 ウェルプレートに 2 mL の AK02N を付加し、LN511-E8 と Y27632 を最終濃度の 0.5 μg/mL (0.1 μg/cm2)および 10 μM で補いました。
    3. 37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、翌日の培地を補助なしで2 mLのAK02Nに交換してください。2~3日ごとにメディアを交換し、3~4日ごとに通過します。
  3. 日-4:差別化前に再プレート
    1. 6ウェルプレートに0.5 μg/cm2のLN511-E8をPBSで希釈してコーティングします。次いで、室温で37°Cで30分間、5%CO2または1時間インキュベートする。細胞を播種する直前に吸引コーティング液。
    2. ステップ 2.2.2 のように rTrypsin でヒト iPS 細胞を収穫し、セルを数えます。
    3. 遠心分離機1.25 x 105 細胞は、300 x gの6ウェルプレートのウェルを4°Cで3分間、2mLで再懸濁し、LN511-E8(最終濃度0.5 μg/mLまたは0.1 μg/cm 2)およびY27632(10μM)を補うAK02Nの2mLで再中断する。
    4. 吸引コーティング溶液は、コーティングされたプレートに再懸濁された細胞を種子、及び37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
  4. 日 -3 および -1: AK02N の 2 mL で媒体を交換します。
  5. 0日目:分化を開始するために、培地をCHIR99021(最終濃度6μM)で補充したRPMI+B27-Insの2mLに交換してください。
  6. 2日目:培地を2mLのRPMI+B27-Insに交換し、WntC59(最終濃度2μM)をウェルあたりに置き換えます。
  7. 4日目:培地をウェルあたりRPMI +B27-Insの2mLに交換してください。
  8. 7日目と9日目:培地を2mLのRPMI+B27+Insに置き換え、PSC-CMを選択的に培養する場合は、培地を1ウェルあたりピューロマイシン(最終濃度10μg/mL)に置き換えます。
    注:本研究で使用されるACTN2-mCherryラインは、内部リボソームエントリーサイト(IRES)、TNNT2遺伝子の3′非翻訳領域(UTR)に挿入されたピューロマイシン耐性遺伝子のカセットを有し、ACTN2のストップコドンを置き換えるmCherryを有する。ノックインなしで心筋細胞を浄化するには、手順3と4を参照してください。
  9. 10日目:将来の実験のための再プレート
    1. 35 mmのイメージング皿に、0.5~1 μg/cm2 のLN511-E8を0.1%ゼラチンで希釈したポリマーカバースリップをコーティングします。長期生存率のために室温で2〜4時間インキュベートする。希望するパターンでPSC-CMを培養するには、PDMSスタンプの準備手順4と5を参照してください。
    2. ヒトのPSC-CMを収穫するには、PBSで皿を2回洗い、1ウェルあたり1mLのrTrypsinを塗布し、37°Cで3分間インキュベートする。
    3. 10%FBS培地の4mLで細胞を収集し、セルを中断し、カウントします。プレート 250,000-500,000 細胞あたり 35 mm イメージング皿。
    4. 遠心分離機は4°Cで3分間3分間300xgの細胞を十分に数え、RPMI+B27+Insでピューロマイシン(10 μg/mL)で再懸濁し、コーティングされた35mmイメージング皿のプレートを再中断します。
    5. 一晩インキュベート。翌朝、培養培地をRPMI+B27+Insに置き換え、ピューロマイシン(10 μg/mL)に置き換えます。
    6. 14日目から、イメージング用のRPMI+B27+Insで週2~3回培養培地を21~28日目まで変更する。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質のAAVベースのトランスダクションについては、ステップ3をご参照ください。

3. アデノ関連ウイルスを用いたサルコメアの蛍光標識

  1. AAV生産前の準備
    1. 10 cmの組織培養プレート上にFBS(最終濃度10%)を加えたDMEM中のHEK293T細胞を維持します。パッセージ細胞は週に3回。
    2. ポリエチレニミン(PEI)を1mg/mLで調製する。ポリエチレニミンMAX 40000と40mLの超純水を50mg混合します。1 N NaOH を使用して pH を 7.0 に調整します。その後、超純水で最終体積を50 mLにし、0.22 μmのストレーナーを通してフィルターを行います。
    3. サルコメア標識遺伝子(例えば、TCAPまたはPDLIM3と緑色蛍光タンパク質(GFP)と融合)を用いてシャトルベクターを調製し、心臓トロポニンT(cTNT)22などの心筋細胞特異的プロモーターによって駆動する。
      注:この例では、V163A、S202T、L221V23の突然変異を伴う単量体強化GFPを使用しました。
  2. 0日目、ヘック細胞を通過
    1. 細胞が合流に達すると、2.0 x 107 HEK293T細胞を10%FBSで20mLのDMEMを有する15cm組織培養プレートに通過させる。
  3. 1日目、トランスフェクション
    1. シャトルベクターの13.5 μg、pHelperの26 μg(アデノウイルスのベクトルコードE2A、E4、VA)、pRC6の16.5 μg(AAV2 RepおよびAAV6キャップ遺伝子をコードするベクター)、および1 mLのDMEMをピルビン酸ナトリウム(DMEM-Pyr)なしで混合する。
    2. 224 μLの PEI (1 mg/mL、ステップ 3.1.2 で調製) と 776 μL の DMEM-Pyr を混合します。
    3. プラスミド溶液とPEI溶液を室温で30分間混合してインキュベートします。
    4. ステップ3.2で調製したHEK293T細胞にプラスミド/PEI溶液を加えます。
  4. 2日目、中程度の変更
    1. トランスフェクション後24時間で、培地をDMEM-Pyrに変更する。培養細胞は7日目にAAVを収穫するまでである。AAVは、培養メディアにリリースされます。
  5. 7日目、最小精製法24を用いたAAV採取、濃縮、および緩衝液置換
    1. PBSで15分間、遠心性限外ろ過ユニット(100k分子量カットオフ[MWCO])をPBSで1%BSAの5mLでインキュベートします。次いで、2分間500xgで遠心分離機を500xgで、濾過し、残りの溶液の両方を吸引する。
    2. AAVを製造した15cm皿から新しい50mL円錐形管および遠心分離機(500 x g、5分)に媒体を移す。上清を0.45 μmのシリンジストレーナーでろ過し、細胞の破片を除去し、懸濁液を除き、限外ろ過ユニットに塗布します。
    3. 遠心分離機は90分間、または培養上清0.5〜1mLを濃縮するまで2000xgで。
    4. 濾液を吸引し、15mLのPBSを限外濾過ユニットに塗布する。
    5. 濃縮物が0.5〜1mLになるまで遠心分離を繰り返します。
    6. 3.5.4 と 3.5.5 を繰り返します。
    7. 濃縮AAVを新しい1.5mLチューブに移し、4°Cまたは-20°Cで保管してください。
      注: AAV は P1 施設で使用できますが、現地の規則や規制に従ってください。AAVは、従来の方法でも製造できます。
  6. AAVのtiterの計算
    1. AAV 5 μL、DMEM-Pyr 195 μL、ベンゾネーゼ10 Uを混合し、37°Cで1時間インキュベートします。
    2. 200 μL のプロテナーゼ K バッファー (0.02 M トリス HCl および 1% SDS) と 5 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL) を加え、37 °C で 1 時間インキュベートします。
    3. 25:24:1 フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液の400 μL、1分間のボルテックス、20,000 x gの遠心分離機を1分間慎重に準備します。
    4. 水相の200μLを新しい1.5mLチューブに移し、元のAAVゲノムの約半分を得ます。
    5. グリコーゲン(20 mg/mL)を1 μL加え、3 M CH3COONa(pH 5.2)と渦の20 μLに加えます。2-プロパノールの250 μLを100 μLのエタノールと渦を再び加えます。
    6. -80°Cで15分間インキュベートします。その後、4°Cで30分間20,000xgで遠心分離機。
    7. 吸気上清をチューブに70%エタノールを加えます。その後、20,000xgで遠心分離機、4°Cで5分間用いた。
    8. 吸気上清はペレットが透明になるまで上清と空気乾燥。
    9. トリス-エチレンジアミンテトラ酢酸(TE;pH 8.0)を200 μL添加して、AAVゲノムを解決します。その後、試料をTEで100倍に希釈する。
    10. TE で pAAV-CMV ベクターを 6.5 ng/μL にして標準を作成し、109 個 のベクターゲノム (vg)/μL を得ます。次に、TEで104 から108 までの一連の10倍希釈を行う。
    11. サンプルDNA(または標準)の1 μL、プライマー(5 μM)の0.4 μL、蒸留水の3.6 μL、SYBRグリーンマスターミックスの5 μLを混合します。ITRに位置するプライマーは、5'-GGAACCCCタグガッガガクト-3′および5'-CGGCCTCTGTGAGCGA-3'です。
    12. 60 sの場合は95°Cでの初期変性、15sの95°Cで変性の40サイクル、30sの60°Cでのアニールと延長、続いて融解曲線を使用してリアルタイムPCRを行います。
    13. 標準とCt値に基づいて、リアルタイムPCRマシンはサンプルの1μLのベクターゲノムのコピー数を提供します。元のAAV価を計算する:リアルタイムPCR(vg/μL)x 8 x 103 x 2で提供されるコピー数、AAVゲノム分離中の希釈因子として8 x 10 3、AAV(一本鎖)とプラスミド(二重鎖)の差率として2を挙げます。
  7. PSC-CMへの導入
    1. 余分な井戸や余分な皿でPSC-CMを数えます。
    2. PBSで50 μLを構成するためにAAV(1 x 104〜1 x 106 vg/cell)を希釈します。AAVを1 x104~1 x 106 vg/cellの多重性でPSC-CMに適用し、マウスおよびヒトPSC-CM用の対応する分化媒体にAAVを使用して3日間PSC-CMおよび培養PSC-CMに適用し、AAVなしで培地を培地に変更する。
    3. PSC-CMは、7日以上の転写後のライブセルイメージングに使用します。

4. [オプション] PsC-CM の AAV ベースの精製

  1. AAVの準備
    1. cTNTプロモーターの制御下でブラシシジン耐性遺伝子を発現するシャトルベクターを用いてステップ3に記載したAAVを調製する。
  2. iPS細胞の分化への導入
    1. ステップ2で説明したプロトコルの後の4日間、ヒトiPS細胞を分化し、余分なウェル内の細胞数を数えます。
    2. 4日目にメディアを交換した後、1 x 105 vg/cellのMOIでAAVをRPMI+B27-InsメディアのPSCを差別化します。
    3. 7日目にRPMI+B27+Insで培地をリフレッシュし、ブラストシジンを2.5-10 μg/mL追加します。
    4. 10日目に、PSC-CMは再プレートする準備ができています。

5. PDMSスタンプの作成

  1. コンピュータ支援設計(CAD)描画ソフトウェアを使用して、ストリップ間に10〜25μmの溝と一緒に200 μmストリップのデバイスパターンを設計します。
  2. マスクレスリソグラフィツールのUV光を使用して、AZP1350でコーティングされたクロムフォトマスクにデバイスのパターンを描きます。
  3. フォトマスク上のパターンを一連のポジティブフォトレジスト現像物(例えばクロム・エッチャント)で開発し、DI水でリンスする。
  4. 120°Cのホットプレート上のシリコンウエハーを15分間脱水します。
  5. ウエハーを室温まで冷却し、負のフォトレジストSU-8 3010をスピンコートし、スピンコート機を使用して30sで1500 rpmで10-20 μmの高さを作ります。
  6. メーカーのプロトコルに従ってホットプレート上の2つのステップでウエハーを柔らかく焼きます。
  7. ウエハを室温まで冷却した後、マスクアライナーにウエハを積み込みます。
  8. マスクアライナーを使用して、ウエハのマスクを位置合わせし、ウエハをUV光に露出します。
  9. 製造業者のプロトコルに従ってホットプレートの2つのステップでウエハーへの露出後のベークを行う。
  10. 一連のSU-8現像剤と2-プロパノールでウエハーを開発し、その後、窒素流でウエハを乾燥させます。
  11. ウェハーを適切なサイズのペトリ皿に移します。
  12. PDMSエラストマーとその硬化剤を比率10:1 w/wで混合し、ペトリ皿に注ぎます。
  13. すべての気泡が消えるまでデシケータでPDMSを脱ガスし、80°Cで2時間熱板上のPDMSを硬化させる。
  14. 硬化したPDMSをツイーツァーでマスターモールドから剥がし、その後PDMSスタンプとなる設計で部分を切り取ります。
    注: 形状は正方形にできますが、八角形の形状はエッジでパターンをより適切に転送します。

6. 多能性幹細胞由来心筋細胞のパターン培養

  1. PDMSスタンプの表面から、修理テープを使ってほこりを取り除きます。
  2. 切手を70%エタノールに沈して滅菌します。次に、エアダスターを用いてスタンプの表面からエタノールを吹き飛ばします。
  3. PDMSスタンプの表面に0.5重量%2メタクリロイロエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマー/エタノールの5-10 μLを塗布してください。
    注: MPCポリマーの分布が不均一な場合、パターンが乱れてしまうことがあります。
  4. MPCポリマーが完全に乾燥するまで10〜30分インキュベートする。
  5. ガラス底培養プレートまたはポリマーカバースリップ付きの35mmイメージング皿のカバースリップにスタンプを接触させ、10分間スタンプに重量(例えば、AAAバッテリー)を置きます。
  6. 重量とスタンプを取り除く。次に、パターンが顕微鏡で転がされたことを確認する。
    メモ:刻印されたプレート/皿は室温で1週間まで貯えることができる。
  7. プレス加工の井戸/皿をPBSで2回洗います。
  8. 2-4 μg/mLのPBSでLN511-E8を希釈し、0.5-1 μg/cm2でLN511-E8で皿をコーティングします。ヒトPSC-CMの場合、PBSの代わりに0.1%ゼラチン溶液でLN511-E8を希釈します。次いで、少なくとも1時間(最適に、4時間以上)インキュベートする。
  9. 前のセクションで説明したように、プレート セル。

7. 蛍光顕微鏡下でのサルコメアのタイムラプスイメージング

  1. 顕微鏡、関連するコンピュータ、および必要なすべての周辺機器をオンにして接続します。
  2. タイムラプスイメージングを実行するには、最高の倍率(100X対物レンズ、オイルエマーシオン)でタイムラプス画像をキャプチャします。
  3. ライブイメージング条件を選択します。良好な代表データを取得するには、最高のフレームレートに調整します(最小で20 msまたは50フレーム/秒を推奨)。シャッターを開けて、必要なビニング(4 X 4)と取得領域のトリミングを適用して、タイムラプスイメージング中の画像間の最短間隔を達成します。
    注: 設定は、顕微鏡の構成によって異なる場合があります。カメラは高感度である必要があり、接続されたPCに十分に速くデータを転送することができます。この場合、カメラリンクでORCAフラッシュを使用しました。紡糸共焦点顕微鏡を試験し、毎秒400フレームで画像を取得しました。
    1. [オプション]細胞の拍動速度が低い場合は、電界刺激によって細胞を呼び起こす。
  4. タイムラプス レコードを実行する
    1. タイムラプス画像の記録中に、画像フィールドがフォーカスを維持していることを確認します。
    2. タイムラプス画像を適切なフォルダに保存します。

8. イメージJ/フィジープラグイン SarcOptiM を使用したタイムラプスイメージングの分析

  1. 一連のタイムラプスイメージを ImageJ にロードします。オリンパスVSI形式の場合は、オリンパスビューアプラグインを介してファイルを開きます。
  2. 画像の明るさとコントラストを調整して、サルコメアパターンをはっきりと観察します(画像||を調整する明るさ/コントラスト)。
  3. SarcOptiM を開くには、[ その他のツール ] メニュー (>>) をクリックし 、[SarcOptiM]を選択します。
  4. ツールバーの Ctrl + Shift + P と1 μm ボタンを押して、ダイアログボックスの指示に従ってプログラムを調整します。
  5. サルコメアの領域を横切って線を引き、サルコメアの短縮を測定するために使用されます。
  6. ツールバーの シングルセル(AVI)を 押して、サルコメア短縮解析を開始します。代表的なデータは図 1 および 図 2に示されています。

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結果

ノックインPSC-CMレポーターラインを使用したサルコメア短縮測定。サルコメアラベルPSC-CMはサルコメア短縮を測定するために使用されました。ラインは内在性の場所からMyom2-RFPとACTN2-mCherryを表現します。TagRFPはMyom2に挿入され、M線に局地化するMタンパク質をコーディングし、mCherryはACTN2にノックインされ、αアクチニンをコーディングし、Z線18、25に局地する。タイムラプス画像を取得し、図1と2とムービー1-3に示すようにサルコメア短縮を決定するために使用されました。

PSC-CMの組織化されていないサルコメアを克服するた...

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ディスカッション

PSC-CMは、心臓病をモデル化し、薬物の効果をテストするためのインビトロプラットフォームとして利用される大きな可能性を秘めています。ただし、PSC-CM 関数を評価する正確で統一された方法を最初に確立する必要があります。機能検査の大部分はPSC-CMで働き、例えば、電気生理学、カルシウム過渡性、および代謝26、および最初の患者由来のPSC-CM試験の1つは、長いQT症候群27についてであった。しかし、心筋細胞の最も重要な機能の1つである収縮性は、まだ評価が困難である。成体心筋細胞では、サルコメアの短縮が広く使用されています。対照的に、PSC-CMの未発達で組織化されていないサルコメアのために、サルコメア短縮のための標準的な方法はこれらの細胞では機能しません。そこで、蛍光性サルコメアタンパク質を用いたPSC-CMのサルコメア短縮を調べる代替方法を発表しました。実証されているように、蛍光タンパク質と融合したMライン(MYOM2)またはZ線(ACTN2、TCAP、およびPDLIM3)に局在するタンパク質を使用することができます。...

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開示事項

H.U.はこの原稿に関する特許を出願しています。

謝辞

Jichi医科大学再生医療部門のラボメンバーの皆さん、有益な議論と技術支援を受けたい。本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の助成金により支援されました。日本学術振興会(JSPS;日本循環学会(基礎研究助成)をH.U.に

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-チオグリセロールSigma-AldrichM6145-25
2-メルカプトエタノール (55mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック21985-023
2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン (MPC) ポリマー、日油LIPIDURE-CM5206
2-Propanol富士フイルム和光166-04836
ポリマーカバースリップ付き35-mmイメージングディッシュ (µ-ディッシュ35 mm、高)同上81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		宝6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.610B1 hiPSC系統のACTN2の終止コドンの周りのTNNT2遺伝子座とmCherryの3'UTRにIRES-ピュロマイシン耐性カセットを挿入しました。これは、他の場所に記載されている方法に従って(安西、Methods Mol Biol、印刷中)
B-27サプリメント(50X)、無血清サーモフィッシャーサイエンティフィック17504-044
B-27サプリメント、インスリンを差し引いたモフィッシャーサイエンティフィックA18956-01
B27サプリメント(50X)、ビタミンAを差し引いたサーモフィッシャーサイエンティフィック12587-010
ベンゾナーゼ (25 U/µL)メルクミリポア70746
ブラストサイジンS塩酸塩フイルム和光029-18701
BMP-4、ヒト、組換え体、R&Dシステムズ株式会社314-BP-010
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD 描画ソフトウェア,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
遠心限外ろ過ユニット (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021ケイマン13122
クロムエッチング液日本化学産業(株)N14B
クロムマスク コーティング AZP1350クリーンサーフェステクノロジー(株)CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE 沈殿担体 (グリコーゲン 20mg/mL、酢酸ナトリウム 3 M (pH 5.2))タカラ9094
ダルベッコのモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM) - 高グルコースSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco'のモディファイドイーグル」s Medium (DMEM) - 高グルコース、ピルビン酸ナトリウムなしSigma-AldrichD5796
エタノール (99.5)富士フイルム 和光057-00456
ウシ胎児血清モアゲート59301104
FGF-10, ヒト, 組換え,R&Dシステムズ株式会社345-FG-025
線維芽細胞成長因子(基本)、ヒト、組換え富士フイルム和光060-04543
ブタ皮粉末ゼラチンSigma-AldrichG1890-100g
グラスゴー最小必須培地 (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
ガラス底培養プレートMatTekP24G-1.5-13-F/H
ハム’s F-12サーモフィッシャーサイエンティフィ11765-062
イスコーブ変性ダルベッコ培地 (IMDM)サーモフィッシャーサイエンティフィック12440-061
L-アラニン-L-グルタミン (GlutaMAX Supplement, 200mM)サーモフィッシャーサイエンティフィック35050-061
L(+)-アスコルビン酸ナトリウム塩富士フイルム和光196-01252
ラミニン-511 E8 フラグメント (LN511-E8, iMatrix-511)日乳892012
マスクアライナーユニオンオプティカル(株)、日本PEM-800
マスクレス露光装置ナノシステムソリューションズ(株)、日本D-Light DL-1000
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック11140-050
Millex-HV シリンジフィルターユニット 0.45 & マイクロ;m、PVDF(0.45-µmフィルター)メルクミリポアSLHVR33RS
Myom2-RFP(SMM18)N.A.前回の論文(Chanthra, Sci Rep, 2020)で開発:
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
ペトリ皿三省メディカル株式会社01-004
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)Nippon Gene311-90151
ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマーダウコーニング社 MI, USASILPOT 184
ポリエチレンイミンMAX (MW. 40,000)ポリサイエンス24765-1
ポジ型フォトレジスト現像剤東京応化工業株式会社(株)NMD-3
PowerUp SYBR グリーンマスターミックスサーモフィッシャーサイエンティフィックA25742
プロテイナーゼ K宝9034
ピュロマイシン 二塩酸塩富士フイルム 和光166-23153
組換えヒト/マウス/ラットアクチビンAタンパク質R&Dシステムズ株式会社338-AC-050
換えトリプシン様プロテアーゼ(rTrypsin;TrypLE express)サーモフィッシャーサイエンティフィック12604-039
RPMI1640 中サーモフィッシャーサイエンティフィック11875-119
シリコンウエハー松崎製作所(株)
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)サーモフィッシャーサイエンティフィック11360-070
スピンコーターミカサMS-A100
スピニン共焦点顕微鏡オックスフォード・インスツルメンツアンドール トンボ スピニングディスクシステム
StemSure LIF, マウス, 組換え, 溶液 (10^6U)富士フイルム和光195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 developerKayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 developer
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant富士フイルム 和光226-01781
サー富士ック 日本 組ス 株式会社

参考文献

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多能性幹細胞心筋細胞分化蛍光ライブイメージングパターン化細胞培養AAV導入タイムラプスイメージング心疾患モデリングImageJ SarcOptiM
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