Method Article

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示されるミオシン5aを発現および精製する手順は、その特徴付け、アンサンブルおよび単分子の両方を用いて蛍光顕微鏡ベースのアッセイ、およびこれらの方法を非筋筋筋筋2bの特徴付けのためにどのように修飾することができるかである。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミオシンタンパク質は、フィラメントアクチン(F-アクチン)と結合して相互作用し、系統樹全体の生物に見られる。その構造と酵素特性は、細胞内で実行される特定の機能に適合しています。ミオシン5aは、細胞内のメラノソームおよび小胞を輸送するためにF-アクチンをプロセス的に歩く。逆に、非筋筋筋筋2bは、約30分子を含む双極性フィラメントとして動作する。これは、フィラメントの中心に向かって反対極性のF-アクチンを移動し、そこでミオシン分子がアクチンを結合し、パワーストロークを与え、サイクルを繰り返す前に解震するために非同期的に働く。非筋筋筋筋2bは、その他の非筋筋筋2アイソフォームと共に、細胞接着、サイトカネシス、および張力維持を含む役割を有する。ミオシンのメカノケミストリーは、精製タンパク質を用いたインビトロ運動性アッセイを行うことで研究できる。滑空アクチンフィラメントアッセイでは、ミオシンは顕微鏡カバースリップ表面に結合し、蛍光標識されたF-アクチンを転写し、追跡することができます。しかし、単一分子/アンサンブル運動アッセイでは、F-アクチンはカバースリップに結合し、F-アクチン上の蛍光標識ミオシン分子の動きが観察される。本報告では、親和クロマトグラフィーを用いた Sf9 細胞からの組換えミオシン5aの精製について概説する。これに続いて、2つの蛍光顕微鏡ベースのアッセイ:滑空アクチンフィラメントアッセイと反転運動アッセイの概要を説明します。これらのアッセイから、画像解析ソフトウェアを用いてアクチン転位速度や単一分子の実行長さや速度などのパラメータを抽出することができます。これらの技術はまた、非筋筋ミオシン2イソフォームの単一フィラメントの動きを研究するために適用することができ、非筋筋筋2bの文脈で本明細書で議論される。このワークフローは、非筋肉ミオシンの単一分子およびアンサンブルダイナミクスを研究するために使用できるプロトコルと定量的ツールのセットを表します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミオシンは、アデノシン三リン酸(ATP)加水分解に由来するエネルギーを用いてアクチンフィラメントに力を発揮する運動タンパク質である。ミオシンには頭、首、尾のドメインが含まれています。ヘッドドメインは、ATP結合および加水分解の部位と同様にアクチン結合領域を含む。首のドメインは、軽鎖、カルモジュリン、またはカルモジュリン様タンパク質2、3に結合するIQモチーフで構成されています。尾部領域は、ミオシンの各クラスに特有のいくつかの機能を有し、2つの重鎖の二量体化、貨物分子の結合、およびヘッドドメイン1との自己抑制相互作用によるミオシンの調節を含むがこれらに限定されない。

ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なります。これらの特性の一部は、義務比(ミオシンがアクチンに結合しているミオシンの機械的周期の割合)およびプロセス性(剥離前にそのトラック上で複数のステップを行うモーターの能力)を含む4。40以上のミオシンクラスは、配列解析5、6、7、8に基づいて決定された。クラス2ミオシンは、最初に研究されたので、「従来」に分類されます。したがって、ミオシンの他のすべてのクラスは、「型破り」に分類されます。

ミオシン5a(M5a)はクラス5ミオシンであり、プロセスモーターであり、解離する前にアクチンに沿って複数のステップを取ることができることを意味する。これは、高いデューティ比を有し、その機械的サイクルの大部分をアクチン9、10、11、12、13、14に結合して費やしていることを示している。他のミオシンと共通して、重鎖はアクチン結合およびATP加水分解部位の両方を含むN末端モータードメインを含み、続いてレバーアームとして機能する首領域を含み、本質的な軽鎖(ELC)およびカルモジュリン(CaM)15に結合する6つのIQモチーフを有する。尾部領域にはαらせんコイルコイルが含まれており、分子を二量体化し、続いて貨物を結合するための球状尾部領域が続きます。その運動論は、メラノサイトにおけるメラノソームの輸送およびプルキンジェニューロン16,17における小胞体の輸送への関与を反映している。M5aは原型貨物輸送モータ18と考えられている。

クラス2ミオシン、または従来のミオシンは、非筋筋ミオシン2(NM2)アイソフォームに加えて骨格、心臓、平滑筋の収縮に力を与えるミオシン、NM2a、2b、および2c19を含む。NM2アイソフォームは、全ての細胞の細胞質に見出され、サイトカネシス、接着、組織形態形成、および細胞遊マイグレーション19、20、21、22において役割を共有している。本論文では、非筋ミオシン2b(NM2b)23の文脈における従来のミオシンプロトコルについて論議する。NM2bは、M5aと比較して、低いデューティ比を有し、0.2 s-123のVmaxのVを有する酵素的に遅い≈18 s-124のM5aのVmaxと比較した。特に、2つのヘッドを持つ切り捨てられたNM2bコンストラクトは、アクチン上で処理的に容易に移動しません。むしろ、アクチンとの出会いのたびに、パワーストロークが発生し、その後に分子25が解離される。

NM2bには2つのミオシン重鎖が含まれ、それぞれに1つの球状頭ドメイン、1つのレバーアーム(ELCと1つの調節軽鎖(RLC))、およびαヘリカルコイルコイルロッド/テールドメイン(約1,100アミノ酸長)が含まれ、これら2つの重鎖を二量体化します。NM2bの酵素活性および構造状態は、RLC23のリン酸化によって調節される。非リン酸化NM2bは、ATPおよび生理的イオン強度(約150mM塩)の存在下で、2つの頭部が非対称相互作用に関与し、尾部が23の2箇所で頭の上に折り畳まれるコンパクトな立体構造を採用している。この状態では、ミオシンはアクチンと強く相互作用せず、酵素活性が非常に低い。カルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)またはRho関連プロテインキナーゼによるRLCリン酸化の際、その分子は尾部を通して他のミオシンと結合して、約30個のミオシン分子23の双極性フィラメントを形成する。RLCの前述のリン酸化はまた、NM2bのアクチン活性化ATPase活性を約4倍の26、27、28に増加させる。このバイポーラフィラメントの配置は、各端に多くのミオシンモーターを搭載し、収縮および張力維持における役割に最適化されており、対立する極性を有するアクチンフィラメントを互いに23,29に対して相対的に移動させることができる。したがって、NM2bはアクチンと相互作用する際にモータのアンサンブルとして機能することが示されている。このフィラメント内の多数のモータにより、NM2bフィラメントはアクチンフィラメント上でプロセス的に移動でき、インビトロフィラメントの加工性を29を特徴付け可能にする。

細胞内のミオシンの役割を理解する上で進歩が見られましたが、タンパク質レベルで個々の特性を理解する必要があります。細胞内ではなく、単純なタンパク質とタンパク質相互作用レベルでのアクトミオシン相互作用を理解するために、インビトロ研究で使用するために組み換えミオシンを発現し、精製することができます。このような研究の結果は、メカノバイオスレーターに、最終的に複雑な細胞プロセスを駆動する特定のミオシンの生物物理学的性質について知らせる12,13,14,25,29.通常、これは、全長または切り捨てられたミオシンコンストラクトにアフィニティタグを追加し、アフィニティークロマトグラフィー29、30、31を介して精製することによって達成される。さらに、この構築物は、遺伝的にエンコエーブルなフルオロフォアまたは合成フルオロフォアでのタンパク質標識用のタグを含むように設計することができる。このような蛍光標識を添加することにより、ミオシン力学および運動学を観察する単一分子イメージング研究が行える。

精製後、ミオシンは、いくつかの方法で特徴づけることができる。ATPase活性は、異なる条件32の下でモータの全体的なエネルギー消費量とアクチン親和性についての洞察を提供する、色分け法によって測定することができる。その運動性のメカノケミストリーについて学ぶためには、さらなる実験が必要です。本論文では、精製ミオシンタンパク質の運動特性を特徴付けるために使用できる2つのin vitro蛍光顕微鏡ベースの方法について詳しく述べています。

これらの方法の第1は、滑空アクチンフィラメントアッセイであり、ミオシンモータのアンサンブル特性を定量的に研究し、精製タンパク質33のバッチの品質を定性的に研究することができる。本論文では、本アッセイに対する全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡の使用について論じるが、これらの実験は、多くの研究室34に広く見られるデジタルカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡を用いて効果的に行うことができる。このアッセイでは、ミオシンモータの飽和層がカバースリップに取り付けられています。これはニトロセルロース、抗体、膜、SiO2-誘導体化表面(トリメチルクロロシランなど)を用いて達成できるが、とりわけ29、33、35、36、37、38。蛍光標識アクチンフィラメントはカバースリップチャンバーを通過し、その上にアクチンが表面に付着したミオシンに結合する。ATP(およびNM2の研究におけるキナーゼ)を添加すると、チャンバーは、表面結合ミオシンによるアクチンフィラメントの転位を観察するために画像化される。トラッキングソフトウェアは、各滑空アクチンフィラメントの速度と長さを相関させるために使用することができます。解析ソフトウェアは、移動型および静止型アクチンフィラメントの数の測定値を提供することもできるため、所定のミオシン製剤の品質を判断するのに有用である可能性があります。失速したフィラメントの割合は、アクチンの表面テザリングによって他のタンパク質に対する意図的に変調し、ミオシン39の負荷依存性を決定するために測定することもできる。各アクチンフィラメントは多数の利用可能なモータによって推進できるため、このアッセイは非常に再現性が高く、最終的な測定速度は、開始ミオシン濃度の変化や溶液内の追加の因子の存在などの摂動に強い。これは、変化したリン酸化、温度、イオン強度、溶液粘度、表面テザーによって誘発される負荷の影響など、異なる条件下でミオシン活性を研究するために容易に変更できることを意味します。ATP加水分解ができない強結合ミオシン「デッドヘッド」などの要因は、アクチンフィラメントの停滞を引き起こす可能性がありますが、そのような問題を軽減し、正確な測定を可能にする複数の方法があります。ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なり、使用される特定のミオシンに応じて、このアッセイにおけるアクチンフィラメント滑空の速度は20 nm/s(ミオシン9)40、41、および60,000nm/s(シャラセアンミオシン11)42の下で変化する可能性がある。

第2アッセイは、滑空アクチンフィラメントアッセイ12の幾何学を反転させる。ここで、アクチンフィラメントはカバースリップ表面に付着しており、M5aの単一分子またはNM2bの個々の双極性フィラメントの動きが可視化される。このアッセイは、アクチン上の単一のミオシン分子またはフィラメントの実行長および速度を定量化するために使用することができる。カバースリップは、非特異的結合をブロックし、同時にビオチンポリエチレングリコール(ビオチン-PEG)などの表面を機能させる化学化合物でコーティングされています。修飾アビジン誘導体の添加は、表面を素数化し、ビオチン化アクチンがチャンバーを通過し、チャンバーの底に安定して結合したF-アクチンの層をもたらす。最後に、活性化および蛍光標識ミオシン(通常1-100 nM)がチャンバーを流れ、次いで静止したアクチンフィラメント上のミオシンの動きを観察するために画像化される。

これらのモダリティは、非筋肉と筋ミオシンの両方のダイナミクスを調べるために採用することができる迅速かつ再現可能な方法を表します。本報告書は、M5aとNM2bの両方を精製し、特徴付ける手順を概説し、それぞれ非伝統的なミオシンを表す。その後、ミオシン特異的な適応の一部について議論が行われ、2種類のアッセイで動きのキャプチャを成功させるために行うことができる。

発現・分子生物学
対象のミオシンのcDNAは、M5a-HMMを発現する場合はC末端FLAGタグ(DYKDDDK)、またはNM2b23、43、44、45、46の全長分子を発現する場合はN末端FLAGタグのために符号化する修正されたpFastBac1ベクターにクローン化されなければならない。NM2b上のC末端FLAGタグは、FLAG-アフィニティーカラムに対するタンパク質の親和性が弱くなります。対照的に、N末端FLAGタグ付きタンパク質は、通常、FLAGアフィニティーカラム23によく結合する。N末端にタグ付けされたタンパク質は、酵素活性、機械的活性およびリン酸化依存性調節23を保持する。

本論文では、フラグタグとミオシン重鎖のC末語との間にGFPを有する切り捨てられたマウスM5a重メロミオシン(HMM)様の構造を用いた。NM2bとは異なり、M5a-HMMはN端子またはC端子FLAGタグで正常にタグ付けおよび精製することができ、どちらの場合も結果として得られる構成体がアクティブになることに注意してください。M5a重鎖はアミノ酸1090で切り捨てられ、M5a47のGFPとコイルコイル領域との間に3つのアミノ酸リンカー(GCG)を含む。GFP と FLAG タグの間にリンカーが追加されなかった。M5a-HMMはカルモジュリンと共に発現した。全長ヒトNM2b構築物をELCおよびRLCと共に発現した。RLCのN末語を5アミノ酸のリンカーを介してGFPと融合した(SGLRS)。FLAGタグに直接アタッチされたのはハロタグでした。ハロタグとミオシン重鎖のN末語との間には、2つのアミノ酸(AS)からなるリンカーであった。

両方のミオシン製剤を、約2 x 106細胞/mLの密度でバキュロウイルスに感染したSf9細胞培養物の1リットルから精製した。各サブユニットのバキュロウイルスの量は、メーカーの指示によって決定されるウイルスの感染の多重度に依存した。M5aの場合、細胞はカルモジュリン用の2つの異なるバキュロウイルス1とM5a重鎖用の1つを共感染した。NM2bの場合、細胞はELC用の3つの異なるウイルス1、RLC用、NM2b重鎖用のウイルス1種と共感染した。多様なミオシン(または他の多複雑なタンパク質)を扱うラボでは、重鎖と軽鎖の多くの組み合わせを可能にし、カルモジュリンなどの一般的に使用される軽鎖は、多くの異なるミオシン重鎖と共にトランスフェクションすることができるので、このアプローチは効率的です。すべての細胞作業は、汚染を避けるために適切な滅菌技術を備えたバイオセーフティキャビネットで完了しました。

M5aおよびNM2bの両方の発現に関して、組換えミオシンを産生する Sf9 細胞を感染後2〜3日回収し、遠心分離を介して、−80°Cで保存した。 細胞ペレットは、2,800 x gで30分間4°CでコフェクトされたSf9細胞を遠心した。タンパク質精製プロセスについて、以下で詳しく説明します。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. タンパク質精製

  1. 細胞のリシスとタンパク質抽出
    1. 表 1に基づいて 1.5 倍の抽出バッファを準備します。4 °Cでフィルターして保管します。
    2. 氷の上の細胞ペレットの解凍を開始します。ペレットが解凍されている間、1.2 mMジチオスレイトール(DTT)、5 μg/mLロイペプチン、0.5 μMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)および2つのプロテアーゼ阻害剤錠剤で抽出バッファーの100 mLを補います。氷の上に置いておきなさい。
    3. ペレットが解凍されたら、細胞培養の10 mLあたり1mLの補充抽出バッファーを加える。例えば、細胞ペレットを500mLの細胞培養から形成した場合、ペレットに50mLの補充抽出バッファーを加える。
    4. 細胞ペレットを氷の上に保ちながら超音波処理します。各ペレットに対して、5 s ON、5 s OFF、5 分の持続時間、4-5 の電源を使用します。
    5. すべての均質化溶解液をビーカーに集め、ATPの最終濃度が1mMになるようにATP(0.1 Mストック溶液;pH 7.0)を加えます。冷たい部屋で15分間かき混ぜます。ATPは活性ミオシンをアクチンから解離し、以下の遠心分離工程で分離することを可能にする。したがって、ATPの枯渇およびアクチンへの再結合の可能性を最小限に抑えるためには、直ちに次のステップに進む必要がある。
    6. 48,000xgで48,000xgでリセートを遠心分離する。 これが起こっている間、メーカーの指示に従って、抗FLAGアフィニティー樹脂(細胞の1 Lから形成されたペレットの場合)の50%スラリーの1〜5 mLを100 mLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し始めます。例えば、5mLの樹脂については、50%スラリーの10mLを洗浄する。最終洗浄工程では、50%スラリーを作成するのに十分な量のPBSの1〜5 mLで樹脂を再懸濁します。
    7. 溶石遠心分離に続いて、上清と洗浄された樹脂スラリーを組み合わせ、冷たい部屋で1〜4時間静かに揺れる。待ち中に、 表1 に記載されているバッファーを作り、氷の上に保管します。
  2. フラグアフィニティー精製製剤
    1. ステップ1.7で4°Cで5分間5分間の 溶液を遠 心分離する。 樹脂はチューブの底部に詰め込まれます。樹脂を邪魔することなく、上清を取り除く。
    2. 表1に詳述したバッファーAの50mL、500xgの遠心分離機で4°Cで5分間再懸濁します。 樹脂を邪魔することなく、上清を取り除く。
    3. 表1に詳述したバッファーBの50mL、500xgの遠心分離機で4°Cで5分間再懸濁する。 このステップをもう一度繰り返し、20 mLのバッファーBで樹脂を再懸濁します。その後、チューブを手で約10回軽く反転させることにより、樹脂と緩衝液を十分に混ぜます。
  3. タンパク質の溶出と濃縮
    1. 表1に記載されているように溶出バッファーの30 mLを作り、氷の上で冷やします。
    2. 冷たい部屋に溶出列を設定します。樹脂スラリーを軽く柱に注ぎます。底面に樹脂パックとしてバッファーBの1〜2カラムの体積でカラムを洗浄し、樹脂が乾燥しないようにします。
    3. 樹脂を通して溶出バッファーの1 mLを流れ、1.5 mLの管の流れを集める。12,1mL分が集められるような繰り返しを行う。
    4. この時点で、分数に対して粗いブラッドフォード検定を実行して、最も濃縮された48の分数を定性的に判断します。96ウェルプレートの1列に、ピペット60 μL 1xブラッドフォード試薬。分数を収集すると、各分画の20 μLをウェルごとに混合します。濃い青色の色は、より濃い分数を示します。
    5. 50 mLチューブ内で、残りの溶出バッファーをカラムを通して静かにピペットして残りのタンパク質を回収し、カラムフロースルー中の樹脂に結合した残りのミオシンを放出する。このフロースルーは次のステップに集中します。再使用のために樹脂を再生成し、製造元の指示に従って保管してください。
    6. 3つの最も濃縮された分率をプールし、さらに100,000 MWの濃縮管を使用して、50 mLチューブにフロースルーを集中させ、残りの1mL画分を濃縮します。プールしたサンプルを濃縮チューブと遠心分離機に750 x g で4°Cで15分間ロードし、溶出したタンパク質がすべて約0.5〜1mLの最終体積になるまで繰り返します。
      注:この孔サイズは、分子量カットオフの数倍の質量を有するミオシン分子の保持を可能にする。この濃度の過程で、この時点で軽鎖は、最終製品に対してSDS-PAGEゲル電気泳動を行うことで検証されるように、モータドメインにしっかりと結合したままです。
  4. 透析とフラッシュフリーズ
    1. 表 1に記載されているように、透析バッファーの 2 L を作成します。冷たい部屋で一晩透析袋またはチャンバーにサンプルをロードし、透析します。なお、透析バッファーの組成は、NM2bとM5aで異なっている。
      注:NM2bの場合、この透析工程の目的は、低イオン強度バッファー内にミオシンフィラメントを形成することです。これらのフィラメントの沈降は、次に、追加の精製工程を提供し、サンプルの濃度を可能にします。したがって、翌日の透析室には可視の白色沈殿物が存在する。これらのフィラメントは、遠心分離によって回収され、ステップ5.1で脱重合される。M5a-HMMの場合、一晩透析後、タンパク質は、その後のアッセイで使用するために十分に純粋であろう。必要に応じて、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーなどのさらなる精製工程を行うことができる。透析後のM5a回復については、ステップ5.2に進みます。
  5. 透析後のミオシンの回復
    1. NM2bの場合、サンプル全体を透析用バッグまたはチャンバーから4°Cで49,000 x g で15分間慎重にアンロードし、ミオシンフィラメントを収集します。上清を捨てて、 表1に記載されているように、ペレットにストレージバッファを徐々に加えて、溶解させます。穏やかな上下のピペットはペレットを可溶化するのに役立ちます。通常、これはチューブあたり500 μL以上を必要としません。ペレットが高イオン強度貯蔵バッファーに完全に溶解していることを確認した後、ミオシンが非重合され、上清に残るため、必要に応じて追加の遠心分離ステップ(49,000 x gで 15 分)を実行して不要な凝集体を除去することができます。
    2. M5a-HMMの場合、不要な凝集物が存在する場合に備えて、4°Cの透析チャンバーと遠心分離機からサンプル全体を49,000 x g で15分間慎重に回収してください。上清を取る。
  6. 濃度決定とフラッシュ凍結
    1. 製品の濃度を決定するには、波長260、280、290、および320nmの分光光度計を使用して吸光度を測定します。式1でmg/mL(cmg/mL)で濃度を計算し、A280は280nmでの吸収を表し、A320は320nmでの吸収を表します。mg/mLの結果として得られる濃度は、式2でミオシン分子のμMに変換することができ、Mはタンパク質全体の分子量(重鎖、軽鎖、フルオロフォア、およびすべてのタグを含む)である。
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      μM分子= 1000cmg/mL/M(2)
      注: 希釈が必要な場合は、高イオン強度バッファーで行う必要があります。絶滅係数(ε)は、タンパク質のアミノ酸配列をExPASyなどのプログラムにインポートすることによって決定することができる。M5a-HMMの典型的な収量は約0.5-1 mLの1-5 mg/mLタンパク質であり、全長NM2bの場合は0.5-2 mg/mLの0.5-1 mLです。本論文で用いたM5a-HMMの消光係数は0.671であった。本論文で用いたNM2bの消光係数は0.611であった。
    2. 精製したミオシンを2つの方法のいずれかで保管します。アリコートは、重合連鎖反応チューブなどの薄壁チューブに10〜20μLの間で、フラッシュ凍結のために液体窒素の容器にチューブをドロップします。あるいは、20~25μLのミオシンを液体窒素に直接ピペットし、凍結したタンパク質ビーズを無菌極低温管に保存します。いずれの場合も、得られたチューブは、将来の使用のために-80°Cまたは液体窒素で保存することができます。
      注:以下に説明する両方の運動性アッセイは、非常に少量のタンパク質を必要とするため、小さなアリコートでの貯蔵は、説明したように、経済的である。

2. グライダーアクチンフィラメントアッセイ

  1. カバースリップ準備
    1. アセテートアミルで1%ニトロセルロース溶液を作ります。
    2. ティッシュ培養皿(150 x 25 mm)を入手し、皿の底に円形のろ紙(直径125mm)を加えます。
    3. 8つのNo.1.5厚さ22mmの正方形のカバースリップをラックに積み込み、約2〜5mLの200プルーフエタノールで洗浄し、続いて蒸留水(dH2O)を2〜5 mLで洗浄します。水で終わるこの洗浄ステップを繰り返します。次に、フィルターエアラインまたはN2-ラインを使用してカバーリップを完全に乾燥させます。
    4. スリップの1つの端に沿って1%ニトロセルロース溶液の1カバースリップとゆっくりとピペット10 μLを取ります。次に、1つの滑らかな動きで、滑らかな側面の200 μLピペットチップの側面を使用してカバースリップの残りの部分に塗り付けます。ニトロセルロース側を上にして、このカバースリップを組織培養皿の上に置きます。残りのカバーリップについて繰り返し、残りの試薬を調製しながら乾燥させ、コーティング後24時間以内にカバースリップを使用します。
  2. チャンバー準備
    1. 光学レンズ紙で顕微鏡スライドを拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚カットし、長さ約2cm。
    2. 顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1個を置きます。テープの端がスライドの端に合っていることを確認します。2枚目のテープをテープの最初の部分の約2mm下に置き、2枚が平行に整列するようにします。これにより、約 10 μL の溶液を保持できるフローチャンバが作成されます( 図 1を参照)。
    3. 第1部からニトロセルロースコーティングされたカバーリップの1つを取ります。ニトロセルロースでコーティングされた側面がテープと直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます( 図1を参照)。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェイスを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。スライドの端に掛かる余分なテープをカミソリの刃で切ります。
  3. アクチン製剤
    1. 20 μM F-アクチンを重合バッファー(50 mM KCl,2 mM MgCl2,1mM DTT,25 mM MOPS(pH 7.0))で重合して4°Cで作ります。
    2. F-アクチンを運動バッファーに5 μMに希釈します(20 mM MOPS、5mM MgCl 2、0.1 mM EGTA、1 mM DTT(pH 7.4))。ローダミン-ファロイジンの少なくとも1.2倍モル過剰の標識。氷の上に少なくとも2時間(アルミホイルで覆われている)を残します。これは氷の上に貯えられる1-2ヶ月まで使用することができる。
  4. ミオシン5aグライダーアクチンフィラメントアッセイを行う
    注: 本項では、ミオシン5a(HMM)のグライダーアッセイの詳細を提供します。
    1. 表2に記載のミオシン5aの溶液を調製し、氷の上に保管する。
    2. ミオシン5a(50-100 nM)の10μLで流れ、流れチャンバを通り、1分間待ちます。
    3. 1 mM DTT(低塩」バッファー)を用いた50 mM MB の 1 mg/mL BSA の 10 μL で流れます。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーのコーナーを使用して、流れチャンバー出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯に入れます。
    4. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. 黒いアクチン溶液(5 μM F-actin、1 μMのカルモジュリン、1 mMのM M MBで1 mMのATP、1 mM DTT)の10 μLの流れは、 議論 のセクションで説明したように「死んだ頭部」を除去する。
      1. ピペット溶液を1mLシリンジと27G針で、アクチンフィラメントを剪断してからチャンバーに導入した。この手順をさらに 2 回繰り返し、3 回目の 1 分後に待機します。約20のピペットイベントで十分です。
      2. 「デッドヘッド」スピンを行う場合、500mMの塩濃度で1mM ATPと1 mMMgCl2 の存在下でミオシンにF-アクチンの量論量を加えます。その後、480,000 x g で4°Cで15分間超遠心分離機を使用します。 死んだミオシンはペレットになります。
    6. 50 μL の 50 μL の流量 50 mM MB 1 mM DTT と 1 mM ATP フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させます。
    7. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返して、任意のATPのチャンバーを枯渇します。
    8. 1 mM DTTを50mM MBに含む20nMローダミンアクチン(Rh-アクチン)溶液の10μLで流れ、1分間待って、カバースリップの表面に付着したミオシン5aにアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする。
    9. 1 mM DTTで10μLの50mM MBで洗浄し、表面に縛られていないRh-アクチンフィラメントを洗い流します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. 最終バッファの30 μLの流れ。
    11. 561 nmの励起波長を使用して蛍光顕微鏡で画像を記録し、Rh-アクチンを可視化します。適切な露出時間は、1.4 mWレーザーパワーで200 msで、合計取得時間は0.5〜1分です。
      注: 取得レートが移動するフィラメントの速度に合わせて適切にスケーリングされていることを確認します。トラッキングプログラムで使用するためにデータを収集する前に重要な考慮事項は、取得フレームレートです。フレーム間のサブピクセルの動きは速度の過大評価をもたらし、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。最適な取得レートは、フレーム間の少なくとも 1 ピクセルの距離に対して滑空を行う機能です。ここでのイメージングに使用されるTIRF顕微鏡の場合、この閾値は130 nmに変換されます。したがって、1μm/sの移動が予想されるミオシンは、200 nmの移動を達成するために5フレーム/秒(0.2秒間隔)の速度で画像化する必要がありますが、ミオシンは0.05フレーム/秒(20秒間隔)を必要とします。したがって、必要に応じてこの段階でデータをダウンサンプリングできます (詳細については 、「ディスカッション 」を参照)。
  5. 非マッスルミオシン2bグライダーアクチンフィラメントアッセイを行う
    注:本項では、全長非筋ミオシン2b滑空アッセイの詳細を提供する。非筋筋ミオシン2b滑空アクチンフィラメントアッセイプロトコルは、特定のステップでのミオシン5aプロトコルとは異なる。これらの各ステップに対して、正しいバッファーが使用されていることを確認してください。例えば、NM2bアッセイは高塩バッファー内のカバースリップへのミオシンの付着を必要とし、M5aは高塩バッファーまたは低塩バッファー内のカバースリップに取り付けることができます。さらに、M5aグライダーアクチンフィラメントアッセイは、取得中に分解アクチンフィラメントの頻度を軽減するために、ミオシンの低濃度を使用します。
    1. 表2に記載されているNM2bのソリューションを準備し、氷の上に保管します。
    2. 非筋2b(0.2μM)の10μLで、500 mM運動バッファー(MB)(高塩バッファー)および1 mMジチオスライトール(DTT)が流れチャンバーを通り、1分間待機します。
      注:高塩バッファーは、ミオシンフィラメントを解離し、表面への単一ミオシン分子の結合を可能にします, 非筋筋筋筋2bは、イオン濃度<150 mMでフィラメントに重合することができます.
    3. 表2に記載されているように1mM DTT(「高塩」緩衝液)を有する500mMMBの1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)の10μLの流れ。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    4. 表2に記載されているように、1mM DTTで10μLの500mM MBで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. 「デッドヘッド」を排除するために 表2 に記載されているように、黒いアクチン溶液の10 μLの流れは 、さらに議論 のセクションで説明したように。黒アクチン溶液には、5 μMの未ラベルF-アクチン、1-10 nM MLCK、1 mM ATP、0.2 mM CaCl2、1μM CaM、および1 mM DTTが50 mM NaCl運動バッファーに含まれ、非マッスルミオシン2bをチャンバ表面にリン酸化します。
      1. ピペット溶液を1mLシリンジと27G針で、アクチンフィラメントを剪断してからチャンバーに導入した。この手順をさらに 2 回繰り返し、3 回目の 1 分後に待機します。約20のピペットイベントで十分です。
    6. 50 μL の 50 μL の流量 50 mM MB 1 mM DTT と 1 mM ATP フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させます。
    7. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返して、任意のATPのチャンバーを枯渇します。
    8. 1mM DTTを50mMMBに含む20nM Rh-Actin溶液の10μLで流れ、1分間待って、カバースリップの表面に付着した非筋肉筋2bにアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする。
    9. 1 mM DTTで10μLの50mM MBで洗浄し、表面に縛られていないRh-アクチンフィラメントを洗い流します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. 最終バッファの30 μLの流れ。非マッスルミオシン2b滑空アクチンフィラメントアッセイの場合、最終緩衝液には、ビデオイメージング中に非筋筋筋筋2bの完全なリン酸化を提供するカルモジュリン、CaCl2、およびミオシン軽鎖キナーゼも含まれる。0.7%メチルセルロースは、アクチンフィラメントが緩やかに結合しているか、表面に結合されていない場合、最終バッファに含めることもできます。これについては、「 ディスカッション」 セクションで詳しく説明します。
    11. 561 nmの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で画像を記録します。適切な露出時間は、1.4 mWレーザーパワーで200 msで、合計取得時間は 0.5〜3分です。
      注: 取得レートが移動するフィラメントの速度に合わせて適切にスケーリングされていることを確認します。トラッキングプログラムで使用するためにデータを収集する前に重要な考慮事項は、取得フレームレートです。フレーム間のサブピクセルの動きは速度の過大評価をもたらし、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。最適な取得レートは、フレーム間の少なくとも 1 ピクセルの距離に対して滑空を行う機能です。ここでのイメージングに使用されるTIRF顕微鏡の場合、この閾値は130 nmに変換されます。したがって、1μm/sの移動が予想されるミオシンは、200 nmの移動を達成するために5フレーム/秒(0.2秒間隔)の速度で画像化する必要がありますが、ミオシンは0.05フレーム/秒(20秒間隔)を必要とします。したがって、必要に応じて、この段階でデータをダウンサンプリングできます (詳細については 、「ディスカッション 」を参照)。

3. 単一分子TIRFアッセイ

  1. カバースリップ準備
    1. ストックパウダーをメトキシペグシラン(mPEG)の10mgアリコート(1.5 mLチューブ)とビオチンペグシラン(bPEG)の10mgアリコートに分けます。密閉された、湿気のない容器に-20 °Cで保管し、6ヶ月以内に使用してください。
    2. 8 No.1.5H(高精度)の厚さ22mmの正方形のカバースリップをラックに積み込み、200mLの200プルーフエタノールで洗浄し、続いて2〜5mLの蒸留水を洗浄します。水で終わるこの洗浄ステップを繰り返します。次に、エアラインまたはN2 を使用してカバースリップを完全に乾燥させ、3分間アルゴンでプラズマクリーンにします。
    3. きれいなカバーリップを濾紙(90mm)の上に組織培養皿(100 x 20 mm)に入れ、70°Cのオーブンでインキュベートし、次の手順を実行します。
      注:プラズマ洗浄は、他の化学洗浄方法49に置き換えることができます。
    4. dH2Oで80%エタノール溶液を調製し、HClを使用してpHを2.0に調整し、mPEGの10mgアリコートに1mL、1mLを10mgのアリコートに加えます。溶解する渦は、30sを超える必要はない。
    5. bPEG溶液を100μLとし、80%エタノール(pH2.0)の900 μLを加えます。この溶液は1 mg/mL bPEGである。次に、両方のPEGの溶液を次のようにして、十分に混合します。
      1. 200 μL 10 mg/mL mPEG (最終濃度: 2 mg/mL)。
      2. 1 mg/mL bPEGの10 μL(最終濃度:10 μg/mL)。
      3. 790 μLの80%エタノール(pH 2.0)溶液。
    6. オーブンからカバーリップを取り出します。100 μLのPEG溶液を各カバースリップの中央に慎重に分配し、上部表面だけが濡れているか確認します。その後、スリップをオーブンに戻し、20〜30分間インキュベートします。
    7. カバーリップが表面全体に見える小さな円で穴のあいた外観を取り始めると、オーブンからそれらを取り除きます。
    8. 各カバースリップを100%エタノールで洗い、エアラインで乾燥させ、オーブンに戻します。ステップ2でチャンバーを作成するのに必要な時間だけインキュベートします。
  2. チャンバー準備
    1. チャンバーを作るのに使用するための顕微鏡のスライドをきれいにしなさい。両面テープを2枚カットし、長さ約2cm。
    2. 顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1個を置きます。テープの端がスライドの端に合っていることを確認します。2枚目のテープをテープの最初の部分の約2mm下に置き、2枚が平行に整列するようにします。
    3. オーブンから機能したカバーリップの1つを取ります(3.1で作成)。 図 1に示すように、PEG でコーティングされた側面が裏面下にしてテープに直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェイスを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。
    4. スライドの上にぶら下がっている余分なテープをカミソリの刃で切ります。これらのチャンバはすぐに使用されるか、または50 mLの管に対に置かれ、将来の使用のために-80°Cのフリーザーに貯えられる。すぐに保存することが重要であるか、表面が劣化します。
  3. ミオシン5a TIRF顕微鏡測定の実施
    1. 表3に記載のミオシン5a逆運動性アッセイの溶液を調製し、氷の上に保管する。
    2. 1 mM DTTで50mM MBの10 μLでチャンバーを洗います。
    3. 1 mM DTT で 50 mM MB の 1 mg/mL BSA の 10 μL で流れます。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    4. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. NeutrAvidin溶液の10 μLで1mM DTTで50 mM MBの流れ、1分間待ちます。
    6. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    7. 1 mM DTTを50mMMBに含むビオチン化ローダミンアクチン(bRh-アクチン)の10μLの流れで1分待ちます。このステップでは、大きな退屈なピペットチップを使用し、蛍光アクチンフィラメントの剪断を最小限に抑えるために上下にピペットを避け、長いアクチンフィラメントを表面(20〜30 μm以上)に取り付けられるようにします。効果的な代替手段は、標準的なピペットチップのコーンを切断することです(≈1-1.5 mmの開口部を有する)。
    8. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    9. 10 nMミオシン5aを加えた最終バッファの30 μLの流れは、TIRFのイメージングモダリティに最適な焦点を見つけた後、TIRF顕微鏡に直ちにロードし、記録します。100〜200 msの間の暴露時間は、アクチンおよびGFP標識ミオシンに対して1.4 mWレーザーパワーで適切である。速度解析の適切な取得時間は3分です。
  4. 非筋筋ミオシン2b TIRF顕微鏡測定の実施
    注:本項では、ポリマー化およびリン酸化フィラメントを用いた非筋筋筋2b TIRFアッセイの詳細が提供される。チューブ内の非筋筋筋-2bをリン酸化および重合するための詳細なプロトコル(セクション4.1〜4.3)が含まれる。
    1. 精製したNM2bをリン酸化するには、2 mM CaCl2、1μM CaM、1-10 nM MLCK、および0.1 mM ATPの条件で10倍キナーゼミックスを作ります。これは10 mM DTTで500 mM MBのボリュームに持ち込むことができます。10xキナーゼミックスを1:10の体積比でミオシンに加え、室温で20〜30分間インキュベートします。通常、このステップのミオシン濃度は1μMである。
    2. リン酸化ミオシンをフィラメントに重合するには、NM2bの塩濃度を150 mM NaClに下げる。これを行うには、4x MBをdH2Oで4回希釈して塩を含み1x運動バッファー(1x MB)を作る。この1x MBは、NM2bを500mMの塩バッファーで凍結したため、塩濃度を下げるために使用することができる。
    3. 3 μLの在庫NM2bごとに、1x MBの7 μLを加えて塩濃度を150 mM NaClに下げ、氷上で20〜30分間インキュベートしてNM2bフィラメントを形成します。
      注: セクション 4.1-4.3 の順序は、NM2b がリン酸化され、最終的な塩濃度が 150 mM である限り、重要ではありません。30分-1時間の順序でインキュベーションは完全なリン酸化および重合のための十分な時間を可能にする。
    4. 非筋筋筋筋2bの逆運動性アッセイに対する溶液を 表3 に記載の準備し、氷の上に保管する。
    5. 1 mM DTTで150 mM MBの10 μLでチャンバーを洗浄します。
    6. 1 mM DTT 1 mM DTT で 1 mg/mL BSA の 10 μL の流れ 1mM MB この洗浄を 2 回繰り返し、3 回目の洗浄後 1 分間待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    7. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    8. 1 mM DTT で 150 mM MB の NeutrAvidin 溶液の 10 μL の流れ、1 分間待ちます。
    9. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. bRh-アクチンの10 μLで流れ、1分待ちます。このステップでは、大きな退屈なピペットチップを使用し、蛍光アクチンフィラメントのせん断を最小限に抑えるために上下にピペットを避け、長いアクチンフィラメントを表面(20〜30 μm以上)に取り付けることができるようにします。効果的な代替手段は、標準的なピペットチップのコーンを切断することです。
    11. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    12. 非筋筋ミオシン2b溶液(約30nM)の10μLで流れ、1分間待ちます。
    13. 1 mM DTT で 150 MB の 10 μL で洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    14. 最終バッファの30 μLで流れ、TIRFの撮像モダリティに最適な焦点を見つけた後、TIRF顕微鏡に直ちに積み込んで記録します。100〜200 msの間の暴露時間は、アクチンおよびGFP標識ミオシンに対して1.4 mWレーザーパワーで適切である。速度解析の適切な取得時間は3分です。

4. 画像解析

  1. グライダーアクチンフィラメントアッセイの画像解析
    注: 画像は、資料一覧にリンクされているソフトウェアとマニュアルを使用して分析できます。ここで説明するプログラムには、分析に TIFF スタックが必要であることに注意してください。グライダーアクチンフィラメントアッセイを分析するプロセスは、以下の50.
    1. raw ムービースタックを指定したフォルダ構造にアップロードし、ムービーフォルダの最上位ディレクトリをプログラムに入力します。
      注: プログラムは、このディレクトリとサブディレクトリ全体のファイルを分析し、最下位レベルのディレクトリを複製として扱います。各レプリケート グループの平均統計が生成されます。この場合、ミオシンごとに1つの映画が使用されました。新しいミオシンを特徴付けたり、新しい実験条件を調査したりする場合、チャンバーあたり3つの視野(FOV)の映画を合計3つのチャンバーについて分析し、このワークフローを調査中のミオシンの3つの調製について繰り返すことを推奨します。
    2. スクリプト "stack2tifs" をユーザー入力フレームレートと組み合わせて使用すると、各 TIFF スタックを、一連の個々の TIFF ファイルと、各フレームの開始時刻を含む対応するメタデータ.txtファイルを含むフォルダに変換できます。TIFF スタック形式ではないデータの場合は、まず 、資料表に記載されているようなソフトウェアを使用して変換を適用する必要があります。
      注: このスクリプトは、ソフトウェア パッケージの一部です。スクリプトの情報は、ここで見つけることができます: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. 取得時のピクセル サイズ (nm 単位) である -px パラメーターを使用します。この場合、ピクセルサイズは130nmである。散布図出力の軸をスケーリングするには、-xmax パラメータと -ymax パラメータを使用します。これらは、プロットされたフィラメントの長さが最も長く、最大プロット速度(nm/s)に対応します。
      注: これらは推定値であり、データがプロットに含まれるように、予想より高い値に設定できます。分析後、生データをエクスポートして、他の統計ソフトウェアやグラフ作成ソフトウェアで表示および分析を行うこともできます。
    4. 最小速度カットオフ パラメータである -minv パラメータを使用して、移動しないフィラメントを定義し、したがって解析から除外することができます。NM2b のような遅いミオシンの場合、このパラメータは、真の滑空運動を切り取らないように低く(この例では 5 nm/s)必要があります。M5a のような高速ミオシンの場合、このパラメータはより高く(この例では 100 nm/s)、真の滑空速度分布を維持しながら、より厳しいフィルタを適用することができます。
    5. pt カットオフ パラメータを使用して、スムーズな移動を識別します。各サンプリングウィンドウでは、値は100×速度標準偏差/平均速度と同等に計算されます。カットオフより高い値を持つトラックは、より多くの可変速度を持ち、さらに解析から除外されます。この例では、カットオフ値 33 が使用されています。より高い値を持つトラックは、より多くの可変速度を持ち、さらに解析から除外されます。
    6. 最大値を使用して、フレーム間の最大許容リンク距離を設定します。これは、nm単位でフィラメントの中心によって移動される計算されたフレーム間距離である。これは、散発的な動きやフィラメント間の誤った結合を除外するのに有用であり得る。ここでの例では、パラメータはデフォルト値の 2,000 nm に残されています。
  2. TIRF顕微鏡測定のための画像解析
    注: 特に記載されているイメージングソフトウェア上の単一分子TIRFアッセイを分析するプロセス 資料表 以下の通りです29.
    1. 記録した顕微鏡ビデオをクリックしてソフトウェアのワークスペースにドラッグして、それを開きます 51.次に、取得チャネルを分割します。 [イメージ>カラー>スプリットチャンネル] をクリックします。
      注: 撮影中に非常に大きいなステージドリフトが発生した場合、画像を安定してイメージングプレーンのインストゥルメンタルドリフトを補正する必要があります。この場合、このデータを得るために使用される顕微鏡としてZ軸ドリフトの補償は使用されなかったため、Z-focusを良好に安定化させる。画像解析プログラムでイメージを安定させるためには、 材料リストにリンクされている適切なスタビライザープラグインをインストールします。イメージスタビライザーは、イメージ内のオブジェクトの固定位置を想定し、前のフレームのローリング平均を参照として使用します。したがって、推奨される手順は、ラベル付きアクチンの画像を含むチャネルから始めることです。
    2. プラグインをクリックし、イメージスタビライザーを見つける;[翻訳]が選択されていることを確認し、デフォルト設定を維持します。[変換係数のログ出力] の横にあるチェックボックスをオンにします。このログステップを適用すると、計算されたシフトパラメータを次のステップで他のチャネルに適用できます。プロセスを完了させます。
    3. 次に、ミオシンというラベルの付いたチャンネルを開き、 プラグイン>画像スタビライザーをクリックして安定化を適用します。単一チャネルでの高レートイメージングの要件により、同じ取得中にアクチンの画像を取得できない場合、ドリフトはビオチン化された受託者マーカーやフッ素を含む静的オブジェクトを含む領域をビオチン-PEG表面に非特異的に結合して選択することにより、画像のスタックを安定させます。この領域は、元のスタックから切り取って安定化し、その後、結果のシフト値を元のスタックに適用できます。
      注:実際には、運動性実験で観察されるドリフトは、数百nm/sで移動するミオシンの動きに比べて無視できますが、最も遅いミオシンにとっては重要な考慮事項になります。
    4. 次に、TrackMate を開き、 プラグインをクリックします。その後、ドロップダウンメニューで トラッキング をクリックし、最後に TrackMateをクリックします。この時点で、画像解析は、蛍光素およびアッセイ条件のパラメータに基づいて最適化を受ける。ただし、理想的な開始パラメータは以下の通りです。
      1. 調整設定: すべてのデフォルト値を保持します。
      2. 探知器:LoG検出器。
      3. 推定ブロブ直径: 0.5 -1.0 ミクロン。
      4. しきい値:25-200。(これは、検出されたスポットがムービーに一致するかどうかを確認する番号を選択した後に プレビュー をクリックして、適切に調整することによって決定することができます。
      5. 初期しきい値: 設定されていません。
      6. 表示: ハイパースタックディスプレイ。
      7. スポットにフィルタを設定する:設定しない。
      8. トラッカー:シンプルなLAPトラッカー。
        注: これらはフレームレートとミオシン速度に依存し、異なるパーティクル間の不要な接続を除外しながら、後続の位置を接続するのに十分な大きさである必要があります。
      9. リンク最大距離:1.0ミクロン。
      10. ギャップを閉じる最大距離:1.0ミクロン。
      11. ギャップを閉じる最大フレームギャップ: 1。
      12. トラックにフィルターを設定する:トラックの変位(>0.39-3ピクセル以上移動するスポットのみを含む)、トラック内のスポット(>3-3スポットを持つトラックのみを含む)。「最小速度」などの他のフィルターは、長期間失速するスポットを除外するために導入される場合があります。フィルタリングの結果は、アクチンに関連するトラックを保持しながら、スプリアストラック(すなわち、アクチントラックに沿っていないバックグラウンドでのミオシンの動き)が除去されることを確認するために、トラックの目視検査によってチェックする必要があります。
    5. [表示オプション]画面が表示されたら、関連する出力の[解析]をクリックします。生成された 3 つのテーブル ([統計の追跡]、[トラック統計内のリンク]、および [トラック統計] のスポット) を保存します。トラック統計表には、新しいタンパク質や特定の実験条件の影響などを特徴付けるために後で分析できる速度と変位データが含まれます。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミオシンの精製は、図2に示すようにドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウム(SDS-PAGE)ゲル電気泳動を還元することによって評価することができる。この図は最終的な透析後ミオシンを表すが、SDS-PAGEは、上清に失われた製品を識別するために、精製手順の様々な段階からアリコートに対して行うことができる。ミオシン5aHMMは120-130 kDa範囲のバンドを有し、全長非筋筋筋2bは200−230kDa範囲でバンドを有し、重鎖29、44に対応する。ミオシン5aはまた、カルモジュリンをマーク、17 kDaマークの近くにバンドを持っています。非筋筋筋2bは、ELCを示す約17kDaでバンドを有する。この NM2b 準備では GFP タグ付き RLC が存在するため、RLC は約 47 kDa で表示されます。ただし、GFP でタグ付けされていない場合、ラベルなしの RLC は約 20 kDa に存在します。

<...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示されるミオシン5aおよび非筋筋筋筋2bの精製およびインビトロ特徴付けのためのワークフローである。この実験は、精製ミオシン構築物のメカノケミカル特性を迅速かつ再現可能な方法で定量するのに有用である。ここに示す2つのミオシンは、多くの可能性のうち2つの具体例に過ぎませんが、条件と技術は、ほとんどのミオシンおよび他の多くの運動タンパク質に、いくつかの仕立てで適用することができます。

ここで説明するプロトコルは、ラボや実験の個々のニーズに応じて、さまざまな影響を受けます。例えば、発現と分子生物学のセクションで説明したように、この論文で使用されるタンパク質は、2つ以上のウイルスの共感染から生成された。しかし、p-FastBac二重発現ベクターやBiGBac発現システム53のような多発現ベクターを用いてタンパク質発現を成功に導くこともある。

いくつかの要因は、組換えタンパク質の成功の生産を妨げる可能性があります。タンパク質の分解を防ぐためには、タンパク質精製のすべてのステップが適切...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このデータ収集に使用する試薬の製造に関する技術的支援に関して、ファン・ザン博士に感謝します。この研究は、NHLBI/NIHイントラウォールリサーチプログラムがHL001786からJ.R.S.に資金を提供することで支援されました。

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Materials

Circular Filter Paper - Gliding Assaystrong>の細胞株(Sf9)。ック

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<強力>1 mL シリンジBD309628
<強力>2 M CaCl2 溶液VWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 ゲージ ニードルベクトン・ディキンソン309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
酢酸ThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
<強>ビオチン化G-アクチンCytoskeleton, Inc.AB07
ウシ血清アルブミンMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
SF-900 II SFM>ThermFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Millipore SigmaC40
strong>ミリポアシグマWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤Millipore Sigma5056489001これは4°Cで保存する必要があります。錠剤は直接使用することも、1錠を2mLの蒸留水に溶解して25倍ストック溶液として再構成することもできます。得られた溶液は4°Cで保存することができます。C:1〜2週間、または-20°Cで少なくとも12週間
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024MWCOが精製されるタンパク質の総分子量よりも小さい限り、チューブのMWCOは必ずしも「万能」ではありません。本明細書のNM2bは100,000 MWCOのチューブで濃縮され、M5aは30,000 MWCOのチューブで濃縮されました。
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assaystrong>VWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
透析チューブ(3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5A透析チューブの直径は異なる場合がありますが、MWCOは同じである必要があります。本明細書で使用したNM2bは、18mm透析チューブで透析した。チューブは、4°Cで20%アルコール溶液に保存できます。
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP105860.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3、および 10 mM MOPS (pH 7.2) を含むバッファーに、最終濃度 50 mg/mL まで溶解できます。これは -20 > で保存できます。C as 300 µLアリコート。 
EGTAMillipore SigmaE4378
溶出カラムBio-Rad761-1550これらは再利用できます。洗浄するには、カラム容量の 2 〜 3 カラムと蒸留水でカラムをすすぎます。カラムを4°Cで冷やします。使用前にC。
エタノールFischer ScientificA4094
G-actinPMID:4254541G-アクチンストックは200 &muで保存できます。液体N2中のM。
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine緩衝液、100 mM、pH 2-2.5、1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTag>PromegaG100A
HClミリポアシグマ320331
KClフィッシャーサイエンティフィックP217-500
<ストロング>ラージオリフィスピペットチップフィッシャーサイエンティフィック02-707-134
<ストロング>ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィック78435
Mark12 未染色標準はしごサーモフィッシャーサイエンティフィックLC5677
<強力>メタノールミリポアシグマMX0482
<強力>メチルセルロースミリポアシグマM0512
<強力>顕微鏡スライド>フィッシャーサイエンティフィック12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAGタグ付きMLCKは、ここでFLAGタグ付きミオシンが精製されたのと同じ方法で精製できます。 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisherScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSFは、イソプロパノール中の0.1 Mストック溶液として作製し、4°Cで保存することができます。イソプロパノールを添加すると結晶沈殿が起こり、室温で攪拌することで溶解することができます。使用直前に、PMSFを急速攪拌溶液に滴下して最終濃度0.1 mMにすることができます。
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock は、100% メタノールで最終濃度 200 μM に希釈できます。
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027これは4°Cで保存する必要があります。その貯蔵寿命は製造日から18ヶ月です。
組織培養ディッシュ - グライディングアッセイコーニング353025各組織培養ディッシュには、約9枚のカバースリップを収納することができます。
組織培養ディッシュ - インバーテッドアッセイコーニング353003各組織培養ディッシュには、約4枚のカバースリップを収納することができます。
<ストロング>スムースサイド200&マイクロ;L ピペットチップトーマス・サイエンティフィック1158U38
<強力>機器
<強力>遠心分離機サーモフィッシャー・サイエンティフィ75006590
<強力>顕微鏡ニコンモデル: 100x TIRF 対物レンズ (N.A. 1.49)
<強力>顕微鏡カメラ >Andor モデル:iXon DU888 EMCCDカメラ(1024 x 1024センサーフォーマット)
<強力>顕微鏡環境制御ボックス東海HITカスタムサーモボックス
<強力>顕微鏡レーザーユニットニコンLU-n4 405nm、488nm、561nm、および640nm
用の固体レーザーを備えた4つのレーザーユニットMid Bench CentrifugeThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-XP 卓上超遠心分離機Beckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystemタイプ:Zepto
Sonicatorプローブ(3.2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderモデル:56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFASTは、Mac OSXおよびLinuxベースのシステムで使用できます。
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate<
strong>Imaging SoftwareNIS Elements (ARパッケージ)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
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