膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

サマリー

本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。

要約

生きた膵臓組織スライスは、膵島の生理学と、無傷の膵島微小環境の文脈での機能の研究を可能にする。スライスはアガロースに埋め込まれた生きたヒトおよびマウス膵臓組織から調製され、ビブラートメを使用して切断される。この方法は、組織が1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)などの基礎的な病理を維持することに加えて、生存率と機能を維持することを可能にする。このスライス法は、膵臓の内分泌組織と外分泌組織を構成する複雑な構造および様々な細胞間相互作用の維持を通じて、膵臓の研究における新たな方向性を可能にする。このプロトコルは膵臓のスライス内の生きた内因性免疫細胞の染色およびタイムラプス顕微鏡を、膵臓生理学の評価と共に行う方法を示す。さらに、この手法は、主要な組織適合性複合体多体試薬を用いて、小島細胞抗原に特異的な免疫細胞集団を識別するように精製することができる。

概要

膵臓の関与は、膵炎、T1D、およびT2D1,2,3などの疾患に対する病理性^である。孤立した小島における機能の研究は、通常、周囲^の環境4から小島を除去することを含む。生きた膵臓組織スライス法は、膵臓組織の研究を可能にし、膵臓の微小環境をそのまま維持し、ストレスの多い膵島分離手順^の使用を回避するために開発^{されました。}ヒトドナー組織からの膵組織スライスはT1Dの研究に成功し、免疫細胞浸潤に加えてベータ細胞喪失および機能不全のプロセスを実証した^{8,9,10,11,12,13}。生きた膵臓組織スライス法は、マウスおよびヒト膵組織の両方に適用することができる^5,6,8。臓器提供組織からのヒト膵臓組織スライスは、糖尿病を有する膵臓臓器提供者ネットワーク(nPOD)との共同研究を通じて得られる。マウススライスは、さまざまなマウス株から生成することができます。

このプロトコルは、非肥満糖尿病-再結合活性化遺伝子-1-ヌル(NOD.ラグ1^---)およびT細胞受容体トランスジェニック(AI4)(NOD.ラグ1^-/-.AI4 ^α/β)マウス株。頷く。Rag1^-/- マウスは、組換え活性化遺伝子1(Rag1)¹⁴の破壊によりT細胞およびB細胞を発達させることができない。頷く。ラグ1^-/-.AI4 ^α/β マウスは、インスリンのエピトープを標的とする単一のT細胞クローンを産生し、一貫した小地浸潤および急速な疾患開発をもたらすため、加速1型糖尿病のモデルとして使用されます¹⁵。ここで取り上げたプロトコルは、共焦点顕微鏡法の適用を通じて、生きたヒトおよびマウス膵スライスを用いた機能および免疫学的研究の手順を説明する。本明細書に記載されている技術には、生存率評価、小口同定および位置、細胞細胞細胞^Ca2+ 記録、ならびに免疫細胞集団の染色および同定が含まれる。

プロトコル

注:マウスを使用するすべての実験的プロトコルは、フロリダ大学動物ケア使用委員会(201808642)によって承認されました。両方の男女の組織ドナーからのヒト膵臓切片は、糖尿病を有する膵臓ドナー(nPOD)組織バンク、フロリダ大学の組織バンクのためのネットワークを介して得られた。ヒト膵臓は、臓器提供法および規制に従ってnPODと提携する認定臓器調達機関によってカダベリック臓器提供者から収穫され、フロリダ大学機関審査委員会(IRB)(IRB no.392-2008)によって「非ヒト被験者」に分類され、同意の必要性を放棄しました。このプロジェクトに特に使用されるnPOD組織は、フロリダ大学IRB(IRB20140093)によって非ヒトとして承認されました。このプロトコルのセクション1-3の目的は、正常にマウスを解剖し、膵臓を準備し、処理し、生きた膵臓組織スライスを生成する方法を説明することです。解決策は事前に準備する必要があり、レシピは 補足表1に記載されています。時間は、これらのプロトコル・ステップの中で最も重要な要素です。マウスが犠牲になると、組織の生存率が低下し始めます。このプロトコルの 3 つの部分は、必要なスライスがすべて生成されるまで、できるだけ早く完了する必要があります。

1. マウス膵臓スライスの生成準備

1. ビブラートメブレードホルダーにブレードを固定しますが、まだビブラートメに取り付けないでください。
2. 100 mL を 1.25% w/v 低融点アガロースを電子レンジで溶融します。電子レンジを1分間隔で操作し、アガロース溶液が沸騰し始めた場合は電子レンジを10s停止します。アガロースが溶けて均一な溶液が生成されるまで、このプロセスを繰り返します。ボトルを37°Cの水浴に入れます。
   注:低アガロース濃度は、マウス膵臓の低密度を考慮することです。
3. 10 mL ルアーロックシリンジに3 mLの温かいアガロースを充填します。27 G 25 mm の針をシリンジに取り付けます。溶液が注入されるまで、37°Cの水浴にキャップ付き針で注射器を保管してください。
   注:27G針は体重10〜25gの間のマウスの共通胆管にしっかりと収まり、非常に粘性の高いアガロース溶液の流れを可能にするので好ましい。より大きなボア針を使用するために選択することができますが、これらはアガロース溶液でより容易に詰まる可能性があるため、より小さな(より大きなゲージ)針はお勧めできません。
4. 10cmのペトリ皿に20mLの冷蔵細胞外溶液(ECS)を加えます。
   メモ: ECS はどの時点でもバブルする必要はありません。
5. 10 cmの未処理のペトリ皿2個に、1皿当たり0.1mg/mLの濃度で3mM Dグルコースと大豆トリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸水素緩衝液(KRBH)15 mLで満たします。
   注:このプロトコルを通して、スライスを維持するために使用されるすべての溶液は膵臓消化プロテアーゼによって引き起こされる組織損傷を防ぐためにダイズトリプシン阻害剤を含むことが不可欠です。

2. マウス膵臓切除・組織処理

注:膵臓を切除し、組織を処理し、スライスを生成するためのプロトコルは、マルシニアックら^al5から変更されます。組織の生存率を確保するために、膵臓の除去とスライスの生成の間の時間を最小限に抑えます。必要なすべての機器は、事前に準備し、以下の手順を通じて迅速な進行を可能にする方法で指向する必要があります。胆管のカヌレーションと注射だけでなく、膵切除は、ステレオスコープの下で行われるのが最善です。

1. マウスはイオブルランで深く麻酔され、頸部脱臼によって犠牲にされる。
   注: イソフルランは、望ましい麻酔法です。5%のイオブルランの濃度を使用する必要があります。例えば、0.26 mLは1 Lチャン^バー16と共に使用する必要があります。CO2を使用した場合、膵臓組織の生存率の低下が認められた。
2. マウスに70%のv/vエタノールを自由にスプレーして、解剖と切除中に毛皮で組織汚染を減らします。マウスを下側に置き、左前側の腹側を上向きに置きます。
3. はさみを使用して腹根を開き、心臓または隣接する血管を穿刺しないように注意して、肋骨ケージを取り除きます。鉗子を使用して肝臓を胸腔に入れ、腸を体腔から移動して一般的な胆管を露出させます。ジョンズ・ホプキンスのブルドッグクランプを使用して、ヴァーターのアンクーラを閉塞します。
4. 37°Cの水浴から3 mLの温かいアガロース溶液をプリロードした10 mLルアーロックシリンジを取り出します。
   注:アガロースと注射器が水浴から取り除かれると、アガロースが冷却され、注射器にセットする前に、膵臓注射を迅速に行う必要があります。
5. 鉗子を左手に持ち、それを使用して、インジェクション用の胆管を穏やかに支え、安定させる。
6. 右側のシリンジを持ち、針ベベル側を胆管に差し込みます。ゆっくりと着実に膵臓を注入する。注射が始まると、注射器と膵臓でアガロース硬化なしに流れを止めることはできません。
   メモ:使用するボリュームは、マウスの重みによって異なります。経験に基づいて、最大体積2mLのマウス体重10gにつき1mLのアガロース溶液を使用することが推奨される。膵臓は、より決定的な構造でわずかに膨らんで見えるはずですが、過剰に拡張されていません。過剰注射は、外分泌組織から分離され、スライスに「吹き飛ばされた」外観を有する小島で生じる。
7. マウスからアガロースで満たされた膵臓を切除する。鉗子とはさみを使って、膵臓を切り取り、胃から始まり、腸に移動し、脾臓で終わる。切り取ったら、注入した膵臓を鉗子でそっと取り出し、冷やしたECSで満たされた10cmのペトリ皿に入れます。
8. はさみを使用して、脂肪、結合組織、線維組織、およびアガロースを注射されていない膵臓の一部を除去します。
   注:除去されるべき組織の部分は、強く確立された構造を持っていないし、ややゼラチンに表示されます。
9. 組織をトリミングした後、はさみを使用して直径約5mmの小さな部分に切り、ECSの下に沈んだままにします。組織を慎重に切断し、アガロースを組織から押し出さないのに注意してください。
10. ECSから組織の破片を取り出し、2つの間のワイパーの上に置きます( 材料表を参照)。フォースを使用してワイパーにそっとロールして余分な液体を取り除きます。
11. 鉗子を使用して、慎重にプレートあたり4個以下で35ミリメートルペトリ皿にティッシュの部分を置きます。組織ブロックの最も平坦な側を下向きに置きます。鉗子を使用して組織を軽く押し下げます。
    注:組織の部分の間に少なくとも数ミリメートルのスペースがあり、プレートの端に触れていないことを確認してください。
12. 37°Cのアガロースをゆっくりと皿に注ぎ、ティッシュに直接注がないように注意してください。組織片が完全に覆われるように十分に注ぎます。この部分は標本ホルダーに接着されますので、組織片の上にアガロースの層があることを確認してください。
13. 慎重にアガロースが設定できるように冷蔵庫にティッシュの部分と皿を転送します。ティッシュピースがシフトしたり、浮遊を開始したりしないようにしてください。もしそうなら、鉗子を使ってすぐにそれらを取り付けなさい。
    注:アガロースの設定は数分で行ってください。
14. アガロースが設定されたら、メスを使用して組織の周りを直線で切断し、組織の断片の間にグリッドを作るかのようにアガロースブロックを作ります。組織のすべての側面を囲むアガロースの数ミリメートルを残すようにしてください。
    注:アガロースから突き出た組織があってはならない。各ブロックは、約5 mm x 5 mm x 5 mm 体積の立方体でなければなりません。
15. メスを使用して、プレートの縁の周りにカットされたアガロースの空の部分を反転させます。鉗子で慎重にそれらを持ち上げることによって皿からティッシュとブロックを取り除きます。

3. マウス膵スライス発生

1. 鉗子を使用して、標本のホールダーのブロックを配置する;彼らはスーパー接着剤に反転されることを念頭に置いて、横にそれらを配置します。ブレード幅より長く伸びないようにブロックを配置します。ビブラートがゆっくりと動く中、ブレードが最短距離で前進するようにブロックを配置します。
   注: 3 つまたは 4 つのブロックの 2 つの行は、行の間に数ミリメートルでうまく動作します。同じ行内のブロックは互いに接触する可能性がありますが、両方の行が接触すると、ブロックから離れたスライスを取得するのが難しくなる場合があります。
2. 標本のホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端部を使用して、接着剤を薄い層に広げます。組織に最も近い側が上向きになるように、組織ブロックを接着剤にひっくり返します。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。
3. ビブラートメモデルに応じて、通常はネジまたはマグネットでブレードホルダーとプレートをビブラートメに取り付けます。ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上に移動するように、ブレードの高さと移動距離を調整します。
   メモ:鉗子は刃の高さを調節する間役に立つ。それらはブロックに触れることなく、できるだけブロックの上部に近いブレードを配置するのに役立つ組織ブロックの上に置くことができます。
4. ブロックにフォースをそっとくっつけて接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまでビブラートメトレイに冷やしたECSを充填します。0.175 mm/sの速度、70 Hzの周波数、1mmの振幅で120μmの厚さのスライスを作るようにビブラートメをセットします。
   メモ:ビブラートの速度は、組織を切断し易さに応じて調整することができます。
5. ビブラートメを起動し、スライスが組織ブロックから外れ始めるときに注意してください。10 cmのグレイフ鉗子または小さい第4の絵筆を使用して、ブロックから浮かんだら慎重にスライスを取り除き、3 mM D-グルコースとトリプシン阻害剤を含むKRBHで10cmプレートに入れます。その下にペイントブラシや鉗子を置き、スライスをそっと持ち上げてスライスを拾います。1枚のプレートに15枚以上のスライスを一緒にインキュベートしないでください。
   注:ビブラートは、スライスが作成されていないブロックの上にいくつかのパスを持つことは正常ですが、これらは時間のために最小限に抑える必要があります。スライスが組織ブロックから完全に分離しない場合は、ハサミを用意してください。この場合、ビブラートメブレードが通過した後、スライスの隅または端がブロックに貼り付けられます。貼り付け切れたスライスを削除する場合は、スライスまたはブロックを取り外しません。
6. スライスを入れ、プレートをロッカーの室温と25 rpmで置きます。スライスは室温で1時間休ませます。長く放置する場合は、15mLのスライス培養培地( 補足表1参照)をインキュベーターに入れる。37°Cでの当日研究のために調製した切片、および24°Cで一晩培養した培養スライスをインキュベートし、実験の少なくとも1時間前に37°Cに移した。
   注:長期的には、スライスは24°Cで培養すると生存率が高くなりますが、37°Cは、おそらくより低い温度で分泌されたプロテアーゼ酵素の活性が低いため、本来の生理学的環境に近いです。マウスとヒト膵臓組織スライスは、両方とも同じ温度で、1皿あたり最大15スライスで培養されます。ただし、メディアのレシピは、人間とマウスのスライスで異なります。両方の製剤が 補足表1に記載されている。さらに、この手順は、マウスおよびヒトのスライスを生成する場合と同じであり、安定化のためにアガロースによる注射を必要とするマウス膵臓を除く。人間のスライスは、nPOD膵スライスプログラムを介して取得されます。マウスと人間のスライスの両方の厚さ120μmです。スライスに対してさまざまな実験を行うことができます。計画された実験に最適な染色パネルを選択してください。

4. 染色手順のスライス準備

1. 計画実験の少なくとも1時間前に37°Cでスライスを培養する。37°Cの水浴に3mM D-グルコースを含む温かいKRBH。3mM D-グルコースを含むKRBHの2mLを35mm皿に移し、絵筆を使ってスライスを皿にそっと入れます。
2. スライスが培地から移された場合は、3 mM D-グルコースを含むKRBHで2回洗浄します。慎重に3 mM D-グルコースでKRBHを吸引し、移管ピペットまたはパスツールピペットを使用して、スライスを乱さないように注意してください。染色パネルを調製した状態で、3 mM D-グルコースを含むKRBHでプレートにスライスを保管します。

5. ディチゾン染色

注:ジチゾンは島を赤く染色するために使用することができますが、それは^islets17に細胞毒性であることが判明したので、スライスを殺すでしょう。

1. 12.5mgのジチゾンを測定し、1.25mLのジメチルスルホキシドに加え、この混合物を50 mLシリンジに取り込みます。ハンクスバランスソルト溶液を使用して25mLのボリュームにシリンジを充填し、シリンジの端にフィルターを取り付けます。3 mM D-グルコースを有するKRBHのアリコート2 mL、および50 mLシリンジから35mm皿に濾過ジチゾン溶液を2滴加えた。
2. ペイントブラシを使用して、慎重に35ミリメートルのシャーレにスライスを置きます。実体顕微鏡を用いて赤いジチゾン染色で示される小島でスライスを画像化します。

6. 生存性染色

注: プロトコルのこのセクションでは、カルセイン AM とブルー蛍光 SYTOX ブルーを使用してスライスの生存率を評価する方法について説明 します(材料表を参照)。カルセイン-AMは、1 μMで4 μMおよびSYTOXブルーの濃度で使用する必要があります。

1. アリコート2 mLのKRBHは、3mMD-グルコースを含み、2μLのカルセインAM色素とSYTOXブルーを加えて、アリコートを分離した。5 sの混合物を渦。
2. 3 mM D-グルコースとカルセインAM染料を含むKRBHの200 μLを8ウェルチャンバーカバーグラスの各ウェルに加えます。
   注:8ウェルチャンバーカバーグラス以外の代替プレートおよび/またはイメージングチャンバーを使用することができます。
3. ペイントブラシを使用して、プレートの各ウェルに慎重にスライスを入れ、スライスを入れ、プレートを37°Cインキュベーターに20分間移します。3 mM D-グルコースを含むKRBHでスライスを2回洗います。慎重にスライスを邪魔しないように注意して、転送またはパスツールピペットを使用してKRBHを吸引します。
4. 3 mM D-グルコースと2 μLのKRBHを含む35mmカバーグラス底ペトリ皿にスライスを入れ、溶液1 mLあたり1 μLの濃度でSYTOXブルーを2μLします。スライスをスライスアンカーで覆い、ハープのある側が下向きであることを確認します。スライスの画像を撮ります。
   注:スライスアンカーが浮いたままの場合は、3 mM D-グルコースを含むKRBHで両側に濡らして溶液に沈めます。色素のロード中でも、プロテアーゼ阻害剤を含む溶液中のスライスを常に維持することが重要です。使用する生存性の染色は、特定の実験または顕微鏡のセットアップに適合させることができる。

7.スライス^Ca2+ インジケータ染色

注: このセクションでは、オレゴングリーン 488 BAPTA-1、AM、SYTOX Blue を使用して、マウススライスで ^Ca2+ 録音のスライスを染色する方法について説明 します(資料一覧を参照)。オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMは5.6 μMの濃度で使用し、SYTOXブルーは1μMで使用する必要があります。ヒトのスライスでは、Fluo-4-AMは6.4 μMの濃度で使用する必要があります。

1. アリコート2 mLのKRBHは、3mM D-グルコースを含有し、オレゴングリーン488 BAPTA-1の7μLを加え、AMと渦混合物を5秒にする。
   注:人間の組織のスライスの場合は、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMの代わりにFluo-4-AMを使用してください。Fluo-4-AMは、細胞内^Ca2+ 濃度が上昇すると明るくなるため好ましい。しかし、マウス膵臓組織ではうまく負荷されません。このプロトコルは、Fluo-4-AMの場合は、30分間だけインキュベートする必要があるという点を除き、上記のFluo-4-AMと同じです。
2. 3mM D-グルコースを含むKRBHの200 μLと8ウェルチャンバーカバーグラスの各ウェルに染料を加えます。ペイントブラシを使用して、チャンバーカバーグラスの各ウェルに慎重にスライスを置きます。チャンバーカバーグラスをスライスで37°Cインキュベーターに45分間移します。
3. 3 mM D-グルコースを含むKRBHでスライスを2回洗います。慎重に3 mM D-グルコースでKRBHを吸引し、スライスを乱さないように注意して、移管またはパスツールピペットを使用します。
4. 3 mM D-グルコースとSYTOXブルーを含むKRBHを1mLあたり1μLの濃度でイメージングプレートまたはチャンバーに入れ、スライスアンカーで覆い、ハープが下向きに向かっていることを確認します。スライスの画像を撮ります。
   注:このプロトコルでは、3 mM D-グルコースとSYTOXブルーの2 μLを含むKRBHの2 mLで満たされた35ミリメートル皿が使用されました。スライスアンカーが浮いたままの場合は、3 mM D-グルコースを含むKRBHで両側に濡らして溶液に沈めます。

8.マウススライス^Ca2+ 録音

注:次のセクションでは、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMおよびSYTOXブルーを使用して、マウス膵臓組織スライスに対して^Ca2+ 録音を実行する方法について説明します。画像化は、共焦点レーザー走査顕微鏡で行いました(詳細は 材料表 を参照)。使用されたレーザーは、SYTOXブルーの場合は405nm、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AM、反射率638nmの場合は488nmでした。オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMにHyD検出器が使用されました。光増倍管(PMT)検出器は、反射率およびSYTOXブルーに使用された。Ca2⁺ イメージングプロトコルは、Fluo-4-AMが指標として使用されたことを除いて、ヒト膵臓組織スライスで同じです。レーザーパワーレベル、ゲイン、ピンホールサイズは、サンプルと特定の小口画像に基づいて調整する必要があります。通常、1.5風通しのユニットのピンホールと1%のレーザーパワーが良い出発点です。

1. 記録する前に少なくとも1時間、顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップまたはケージスタイルのインキュベーターを37°Cに平衡させます。 蓋を外した後、スライスを含む35mmのカバーグラス底ペトリ皿をステージに置きます。顕微鏡を10倍の目的と明視野モードに設定して焦点を合わせます。スライス内のオレンジ褐色の楕円形を探して、明視野を使用して島を見つけます。
2. 可能性のある小地が見つかったら、顕微鏡を共焦点イメージングモードに切り替えます。反射率で島を確認するには、638 nmレーザーをオンにして、レーザーパワーを1~2%に設定し、通常は後方散乱光を除去する638 nmノッチフィルタをオフにします。PMT 検出器の検出限界値を、約 20 nm の帯域幅に設定します。
   メモ:反射率モードで顕微鏡を操作すると検出器が損傷する可能性がありますので、注意してください。内分泌組織の粒度が高いため、反射光を使用して小島を見つけることができます。この反射チャネル上の細かい細胞の明るい後方散乱のグループとして島が現れます。
3. SYTOXブルーを表示するには、405 nmレーザーとPMT検出器のスイッチをオンにし、レーザーパワーを1%~2%の間に設定します。ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。関心のある小地が後方散乱によって見つかり、確認されたら、20倍の目的に切り替え、小地がフレームの大部分を占めるようにズームインします。
4. 1.5 μmのzステップサイズの小子のZスタックを取ります。ほとんどの細胞が生きている(SYTOXブルーの陰性)、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMまたはFluo-4-AMでよくロードされている小地の最良の光学セクションを見つけてください。
   注:大量の染料で過負荷状態で、非常に明るい細胞を見ることは珍しいことではありません。これらは、小胞子に^Ca2+ 貯蔵が放出され、高レベルの負荷をもたらす膵臓細胞を死にかけている可能性があります。これらは記録するのに理想的なセルではありません。染料を明確にロードしたが、検出器を過飽和にしていない細胞を探して、細胞内^Ca2+ レベルが変動したときに発生する明るさの増加が見えるようにします。スライス内の小島の染料のロードは可変です。しかし、染料は通常、小子の〜10〜15μmを通してよくロードされます。しかし、染色負荷は、細胞が組織の奥深くにある場合、視覚化するのが困難な場合があります。
5. 記録中に色素のフェージングを防ぐには、488 nm チャンネルのレーザーパワーが2%を超えないようにしてください。ピンホールを2風通しの良いユニットに増やして、励起力を低くしてより多くの信号を集めます。
6. XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定します。フレームレートをフレームあたり2秒以下に抑える設定を最適化します。
   注: フレームレートを下げるために行うことができる設定の調整には、双方向スキャンのオン、ラインの平均化の減少またはオフの切り分け、スキャン速度の向上などがあります。
7. 設定が最適化されたら、数分間の基礎活動を記録します。
   注:組織生存率のもう一つの良い指標は、細胞が活性に見え、基底活動のこの記録中に目に見えて点滅している場合です。
8. 100μLの20倍濃縮グルコースとKRCLのKClを、与えられた時点で200 μLマイクロピペットを使用してプレートに加え、16.7 mMグルコースまたは30mM KClの最終濃度を達成します。
   注:録音中にスライスを邪魔しないように注意して、慎重にソリューションを追加します。マイクロピペットでプレートをぶつけないようにしてください。これらの刺激に応答して組織の収縮を見ることは典型的です。Ca2⁺ フラックス記録は、^ImageJ18で処理および定量化されました。ImageJソフトウェアを用いて、オレゴングリーン488 BAPTA-1の染色強度を、対象領域(ROI)を手動で選択して細胞内で測定した。これらのROIからの蛍光強度は、後の時点での蛍光値を細胞の初期蛍光値(F/_F0)で除算して算出した。灌流システムは、特殊なイメージングチャンバと一緒に使用して、手動で追加するのではなく、動的にスライスするソリューションを管理することができます。輸液システムおよびイメージングチャンバーの推奨事項は、 材料表にあります。

9. 生きた膵臓スライス中のマウスT細胞の染色

注: プロトコルのこのセクションでは、マウス スライス内の免疫細胞を染色する方法について説明します。使用されるマウスのひずみはNODです。ラグ1^-/-.AI4 ^α/β は、このモデルとして一貫して重要な不機嫌症の疾患を発症する。このマウスのCD8⁺ T細胞はすべてインスリンのエピトープを標的とし、フィコエリスリン(PE)標識インスリン-^Db テトラ^マー15の使用を可能にする。CD8抗体は1:20の濃度で、インスリン四量体は1:50で使用する必要があります。

1. 3 mM D-グルコースを含むKRBHのアリコート100μL、2μLのPEインスリンテトラマーと5μLのアロフィコシアニン(APC)CD8抗体を加え、5 sの混合物をボルテックスした。
2. 3 mM D-グルコースと四量体と抗体を含むKRBHの100 μLを8ウェルチャンバーカバーグラスのウェルに加えます。ペイントブラシを使用して、チャンバーカバーグラスのウェルに慎重にスライスを置きます。チャンバーカバーグラスをスライスで37°Cインキュベーターに30分間移します。
3. 3 mM D-グルコースを含む2 mL KRBHでスライスを2回洗浄します。慎重に3 mM D-グルコースでKRBHを吸引し、スライスを乱さないように注意して、移管またはパスツールピペットを使用します。
4. KRBHを含む35mmカバーグラス底ペトリ皿にスライスを3 mM D-グルコース、SYTOXブルーを1mLあたり1μLの濃度で入れ、スライスアンカーで覆い、ハープを下向きにして側面を置きます。スライスの画像を撮ります。
   注:スライスアンカーが浮いたままの場合は、3 mM D-グルコースを含むKRBHで両側に濡らして溶液に沈めます。希釈された抗体および四量体は一度再利用することができる。2つのスライスを染色した後、新鮮な抗体混合物を作る必要があります。

10. マウス免疫細胞の記録

注:次のセクションでは、CD8抗体、PEインスリン四量体、およびSYTOXブルーを使用してマウス膵組織スライスに免疫細胞記録を行う方法について説明します。イメージングの設定は、セクション8で説明した通りです。録音は800×800ピクセルの解像度で行われました。使用したレーザーは、SYTOXブルーの場合は405nm、インスリン四量体用は488nm、CD8抗体および反射率は638nmであった。CD8抗体およびPEインスリン四量体にハイド検出器を用いた。PMT検出器は、反射率とSYTOXブルーに使用されました。免疫細胞イメージングプロトコルは、ヒト組織に対して異なる抗体および抗原複合体HLA-マルチマーを使用する以外は、ヒト膵臓組織スライスで同じです。マウス組織におけるインスリン四量体染色とヒト組織におけるHLA-マルチマー染色の両方について、免疫細胞の共染色を用いて、特異的抗原反応性T細胞の存在を検証する必要がある。ここでは、抗CD8抗体が使用された。抗CD3や抗CD4などの抗体も、標的細胞集団に応じて使用することができる。

1. 記録する前に少なくとも1時間、顕微鏡のスイッチをオンにし、ステージトップインキュベーターを37°Cに平衡化する。 ステージ上のスライスを含む35mmのカバーグラス底ペトリ皿を固定します。明視野モードで10倍の目標を設定して顕微鏡を焦点を合わせます。スライス内のオレンジ色の楕円形を探して、明視野モードを使用して島を見つけます。
2. 顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率で島を表示するには、638レーザーとPMT検出器をオンにして、レーザーパワーを1%~2%の間に設定し、ノッチフィルタをオフにします。
   注:内分泌組織の粒度が高いため、反射光を使用して小島を見つけることができます。このチャネル上の明るい粒状セルのグループとして、小島が表示されます。
3. SYTOXブルー、CD8抗体、およびインスリン四量体を確認するには、レーザーパワーが1%から2%の間であることを確認してください。SYTOXブルーの場合は、405 nmレーザーとPMT検出器をオンにして、3つのそれぞれを表示するには、次の設定を使用します。CD8抗体の場合は、HyD検出器をオンにします。そして、インスリン四量計を表示するには、488 nmレーザーとHyD検出器をオンにします。
4. ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的のアイレットが見つかったら、20x の目的に切り替え、小子がフレームの大部分を占めるようズームインします。1.5 μmのzステップサイズの小子のZスタックを取ります。ほとんどの細胞が生きている(SYTOXブルーの陰性)、そして周囲の免疫細胞が焦点を合わせている小地の最良の光学セクション(5〜10セクションの間のシリーズ)を見つけます。
   注:複数のCD8陽性およびインスリン四量測定細胞が、小地を取り囲む、または浸透しているフレームを見つけてみてください。
5. XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定します。数時間の間に 20 分ごとに選択したステップの Z スタックを記録するように設定を最適化します。
   注:可能であれば、特に4時間以上記録する場合は、温度と_CO2 レベルを制御できるイメージングチャンバでこれらの記録を行うことをお勧めします。夜間記録の場合、過剰な抗体を培地に添加して、T細胞受容体のサイクリングおよび色素退色を補うことができる。さらに、異なる蛍光体をT細胞抗体に使用することができる。経験に基づいて、遠赤色範囲の抗体はT細胞に最も適しています。

結果

このプロトコルは、機能研究と免疫細胞の記録の両方に適した生きた膵臓組織スライスを生み出す。明視野と反射光の下の両方でスライスの外観を図1A,Bに示します。議論したように、小島は、インスリン含有量(図1C)のために発生する粒度の増加による反射光を使用したスライスに見つけることができ、反射光が使用される場合にはバックグラウンド組織と比較して明確に観察される。生存率はスライス生成後に評価されるべきであり、島の20%以上が生存できない場合は、島を記録すべきではない。生存率の高いアイレットを図1Dに示すのに対し、処理不良のスライスの例を補足図1に示します。生存率の低い島はSYTOXブルー染色が重くなり、組織は死んだ細胞の染色された核で覆われます。さらに、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMがここで使用し、Fluo-4-AMなどのカルセインAMと^Ca2+の指標は死んだ細胞にう...

ディスカッション

このプロトコルの目的は、膵臓スライスの生成と機能および免疫学的研究でスライスを採用するために必要な手順を説明することです。生きた膵スライスを使用するには多くの利点があります。しかし、記載された実験プロトコルの間に組織が生存可能で有用であり続けるために不可欠ないくつかの重要なステップがあります。迅速に作業することが不可欠です。膵臓を注入し、ビブラートメ上のスライスを生成する間の時間の長さは、組織の生存率を維持するために最小限に抑える必要があります。生存率はまた室温ECSとは対照的にスライスする前に冷たいECSで膵臓を保つことによって改善される。重要なことに、スライスはプロテアーゼ阻害剤なしで培地に入るべきではありません。プロテアーゼ阻害剤を使わずにスライスをインキュベートすると、生存率が大きく低下する。

染料のロード中にスライスが阻害剤なしで一時的に放置されたとき、高グルコースおよびKClに応答する^Ca2+フラックスは、スライスにまだ基礎活性がまだ見えないにもかかわらず記録されなくなりました。KRBHを含む生きたスライスと使用されるすべての溶液は、3 mM D-...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#3 スタイル メス ハンドル	フィッシャーブランド	12-000-163
1 M HEPES	ッシャー サイエンティフィック	BP299-100	HEPES バッファー、1M 溶液
10 cm 未処理培養皿	コーニング	430591
10 mL ルアーロック シリンジ		BD 301029	BD シリンジ ルアーロック チップ付き
27 G ニードル	BD	BD 305109	BD一般使用およびPrecisionGlide皮下注射針
35 mmカバーガラス底ペトリ皿	Ibidi	81156	µ-ディッシュ35 mm、高
50 mLシリンジ	BD	309653
8ウェルチャンバーカバーガラス	Ibidi	80826	µ-スライド8ウェル
APC抗マウスCD8a抗体	バイオレジェンド	100712
BSA	フィッシャーScientific	199898
塩化カルシウム		Σ C5670	CaCl2
塩化カルシウム二水和物	Σ	C7902	CaCl2 (二水和物)
コンパクトデジタルロッカー	サーモフィッシャー サイエンティフィ	ック 88880020
共焦点レーザー走査顕微鏡	ライカ	SP8	ピンホール = 1.5-2風通しの良いユニット;10x/0.40 開口数 HC PL APO CS2 dry および 20x/0.75 開口数 HC PL APO CS2 dry 対物レンズで 512&thinsp で取得。×&シンスプ;512ピクセル解像度
D-(+)-Glucose		Sigma G7021	C6H12O6
>ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Dimethyl sulfoxide
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm 組織培養ディッシュ	Corning	353001	Falcon Easy-Grip 組織培養ディッシュ
FBS	Gibco	10082147
Feather No. 10 Surgical Blade	電子顕微鏡 Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	細胞透過性 Ca2+ インジケーター
ゲルコントロール スーパーグルー	Loctite	45198
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11049-10
硬化ファインハサミ	Fine Science Tools	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Balanced Salt Solution
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
アイスバケツ	フィッシャーブランド	03-395-150
イソフルラン	パターソン獣医	NDC 14043-704-05
ジョンズホプキンスブルドッグクランプ	ロボズ外科店	RS-7440	直;500-900グラムの圧力;1.5 "長さ
	Kimwipesキンバリークラークプロフェッショナル	34705	Kimtech科学&貿易;キムワイプ&トレード;デリケートタスクワイパー、2層
LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キット	Invitrogen	L3224	このキットには、calcein-AM生細胞色素が含まれています。
低グルコース DMEM	コーニング	10-014-CV
塩化マグネシウム六水和物	Sigma	M9272	MgCl2 (六水和物)
硫酸マグネシウム七水和物	Σ	M2773	MgSO4 (七水和物)
磁気加熱プラットフォーム	ワーナー・インスツルメンツ	PM-1	動的刺激用イメージングチャンバー用プラットフォーム録音
マイクロ波	GE	JES1460DSWW
Nalgene シリンジフィルター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	726-2520
No.4 ペイントブラシ	マイケルズ	10269140
オープンダイヤモンド バス イメージングチャンバー	ワーナーインスツルメンツ	RC-26	ダイナミックスティミュレーション用イメージングチャンバー
録音 オレゴングリーン 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	細胞透過性 Ca2+
インジケーター オーバーナイトイメージングチャンバー	Okolab	H201-LG
PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20012050	スライス生成用アガロースを作るには
PE標識インスリンテトラマー	エモリーテトラマー 研究コア	配列 YAIENYLEL
ペニシリン ストレプトマイシン	Gibco	15140122
塩化カリウム	Sigma	P5405	KCl
リン酸カリウム 一塩基性	Sigma	P5655	KH2PO4
Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	71998	ビブラトーム用;ダブルエッジステンレススチール、コーティングなし
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque 低融点アガロース	ロンザ	50101	スライス生成用アガロースを作るには
スライスアンカー	ワーナーインスツルメンツ	64-1421
スライスアンカー(ダイナミックイメージング)	ワーナーインスツルメンツ	640253	ダイナミックイメージングチャンバー
用スライスアンカー重炭酸ナトリウム	Σ	S5761	NaHCO3
塩化ナトリウム	Σ	S5886	NaCl
リン酸ナトリウム一水和物	Σ	S9638	NaH2PO4 (一水和物)
大豆トリプシン阻害剤	Σ	T6522-1G	グリシンmax(大豆)ステージからのトリプシン阻害剤
アダプター	ワーナー・インスツルメンツ	SA-20MW-AL	顕微鏡ステージでの動的刺激記録のためのイメージングチャンバーに適合
ステージトップインキュベーター	Okolab	H201
ステレオスコープ	ライカ	IC90 E MSV266
SYTOX ブルーデッドセル染色	Invitrogen	S34857	青色蛍光核酸染色
トランスファーピペット	ファルコン	357575	Falcon™プラスチック 使い捨てトランスファー ピペット
バルブ制御システム	ワーナーインスツルメンツ	VCS-8	動的刺激録音用システム
ビブレーター VT1000 S	ライカ	VT1000 S
ウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック	FSGPD02	フィッシャーブランド アイソテンプ ゼネラルパーパス デラックスウォーターバス GPD 02