この発表は、気道、肺胞、インタースティジウム内の細胞の位置を維持し、構造機能解析用の肺の血管灌流固定を用いた空気膨張の方法である。固定剤は右心室を介して浸透している間一定の気道圧力は空気膨張部屋と維持される。肺は組織学的研究のために処理される。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
肺の病態は、肺の恒常性および病態の病態の間に空域細胞が提供する寄与を調査するためにしばしば使用される。しかし、一般的に使用される点熱ベースの固定方法は、空域細胞および粘液を末端気道に置き換えることができ、組織形態を変える可能性がある。それに比べて、血管灌流固定技術は、空域および粘膜内の細胞の位置および形態を維持する上で優れている。しかし、気道の正気圧が同時に加えなければ、肺の領域が崩壊し、毛細血管が歯槽の空間に膨らみ、肺の解剖学的歪みにつながる。ここでは、下流の組織学的研究のために、気道および肺胞細胞および間質の形態および位置を維持するための血管灌流固定中の空気膨張のための安価な方法を説明する。固定性が右心室を通して浸透している間、固定性は調節可能な液体コラムを介して圧力を維持する密封された空気満たされた部屋からの気管を介して一定の空気圧力が肺に渡される。
概要
肺の構造学は、健康と病気の間に肺アーキテクチャを評価するためのゴールドスタンダードを表し、肺の研究者によって最も一般的に使用されるツールの1です。この技術の最も重要な側面の1つは、肺組織の適切な単離と保存であり、このステップのばらつきは組織の質が悪く、誤った結果1、2、3につながる可能性がある。生きている動物では、肺容積は、肺の内向き弾性反動と、胸壁から伝わる外向きの力と表面張力による横隔膜とのバランスによって決定される。したがって、胸郭が入ると、外向きの力が失われ、肺が崩壊する。崩壊した肺から作製された組織学的部分は、混雑した外観を有し、解剖区画(すなわち、空域、血管系、および間質)の間の境界を区別することは困難であり得る。この課題を回避するために、研究者はしばしば化学固定中に肺を膨らませ、空域の大きさと建築を維持します。
肺は空気または液体で膨らませることができます。肺を同じ体積に膨らませるために必要な圧力は、空気と液体の界面での分子間力によって空気と液体の膨張の間で異なります。表面張力を克服し、崩壊した胞壁4を開くために、液体インフレ(例えば、12cmH2O)よりも空気膨張時に高い圧力(例えば、25cmH2O)が必要である。肺胞が募集されると、低圧は肺胞を圧力体積曲線台と同じ体積に開いたままにし、パスカルの法則4、5、6、7、8に従って肺全体に圧力が均等化する。
肺の膨張と固定の2つの主要な方法は、血液学のためにマウスの肺を保存するために存在する。最も一般的には、空域は液体を植え付け、しばしば固定剤を含む。このアプローチの主な利点は、比較的簡単で、トレーニングをほとんど必要としなくて済む点です。固定液の気管内点眼は血管系に焦点を当てた研究で好ましいかもしれないが、気管を介して植え付けられた液体は、空気インフレ率が1、3、4、9、10、11ではない間、近位気道細胞およびムチンをより遠位の空域に押し込む傾向がある。さらに、液体インフレ時に上皮から白血球を不注意に剥離すると形態が変化し、実際にそれらに単純で丸みを帯びた外観4、10、11、12を与える。最後に、液体を用いた肺の膨張は、意図せずにインタースティジウム4、10、11を圧縮する可能性がある。これらの要因は、一緒に保存された肺内の正常な解剖学および細胞分布を歪め、したがって技術を制限する。
組織保存の別の方法は、血管灌流固定である。この方法では、固定剤は、静脈または右心室を介して肺血管系に浸透する。この方法は、空腔内のセルの位置と形態を保持します。しかし、灌流固定中に肺が膨張しない限り、肺組織は崩壊する可能性が高い。
血管灌流固定を伴う空気膨張は、上記の各固定技術の強みを利用します。ここでは、この技術のプロトコルを提供する。必要な材料や機器は比較的安価で、簡単に入手して組み立てることができます。 図1Aに示す完成したセットアップは、調節可能な流体充填カラムを介して肺に一定の気道圧力を提供し、蠕動ポンプは右心室を介して固定性を提供します。保存された形態を有する肺は、構造機能解析のためにさらに処理することができる。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
この議定書に記載されているすべての方法は、国民ユダヤ人保健の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注: プロトコルは 3 つのコンポーネントに分かれています。最初のコンポーネントは、灌流/固定装置による空気膨張の構築を詳述します。2 番目のセクションでは、実験用の機器のセットアップ方法について説明します。最後のセクションでは、動物を準備し、実験を行う方法について説明します。
1. 水柱装置の構成(図1B)
- 60 mL スリップチップシリンジからプランジャーを取り外します。
- 30 mLマークでシリンジの周りにテープを貼ります。25 cmH2O の初期インフレ圧力のこのマークに、シリンジの高さを設定します。これは、列の水位が手順全体を通してあるべきである場所でもあります。テープに「25 cm」( 図 1Aに示すように)または「インフレーション」のラベルを付けます。
注:25 cmH2Oのインフレ圧力は崩壊した空域の採用を保障するために使用される。いったん胞地を募集すると、気管が膨張しないように圧力を20cmH2Oに下げます。 - テープからプランジャーの端に向かって5cmを測定し、別のテープをシリンジに取り付けます。固定中に20 cmH2Oにインフレ圧力を下げるには、このマークまでシリンジを下に移動します。テープに「20 cm」( 図 1Aに示すように)または「固定」のいずれかのラベルを付けます。
- 180 ポリ塩化ビニル(PVC)チューブをシリンジのスリップ先端端に取り付けます。チューブの長さは、シリンジと空気膨張室(約25〜30cm)間の距離に依存します。
- オスの Luer (2) スレッド スタイルのティー (長さ 1.219 インチ、高さ 0.904 インチ、内径 0.0904 インチ) をチューブのもう一方の端に配置します。この男性ルアーは、空気インフレ室のストップコックに接続します(ステップ2.4)。
2. 空気膨張室の建設(図1C)
- ねじ込みキャップ付きの500 mLプラスチック容器に2つの穴(直径約4mm)をドリルします。穴は、女性のルアーズと同じサイズでなければなりません(長さ1.224インチ、高さ0.312インチ、内径0.098インチ)。
注:空のメディアやバッファ容器は、空気膨張室のために利用することができます。 - シリコンガスケットメーカーで女性Luersのスレッドをコーティングし、容器の事前に掘削された穴に小さな側を置きます。
- 女性のルアーズの周りにシリコーンガスケットメーカーを追加し、容器に入り、気密シールを確保します。
- 空気インフレ室の下の女性ルアーの一方通行のストップコックをねじ込みます。
- 約25cmの長さにチューブをカットし、チューブの自由な端に男性のルアーズを取り付けます。チューブの一方の端にある男性Luerを、空気インフレ室の無料の女性ルアーに接続します。もう一人のオスのルアーは、動物加工容器に接続します。
3. 動物加工容器の建設(図1D)
- 大きなプラスチック容器の側面に穴(直径約4mm)を掘削します。穴は雌のルアーの直径でなければなりません。プラスチック容器は過剰な固定液を捕まえるために必要である。
注:30 cm x 22 cm、3.8 Lプラスチック製の貯蔵容器が使用されました。 - シリコンガスケットメーカーで女性ルアーのスレッドをコーティングし、容器の事前に開いた穴に小さな側を置きます。
- 女性のルアーの周りにシリコーンガスケットメーカーを追加し、容器に出入りして気密シールを確保します。
- 一方行のストップコックをメスのルアーにねじ込みます。空気インフレ室からの管はこの栓コックに付す。
4. ソリューションの準備
- ヘパリン溶液
- カルシウムフリーのPBSとヘパリン(20 U/mL)で容器を満たします。各マウスに対して合計10 mLヘパリン溶液を調製します。ヘパリンは、灌流固定中に血管内で血栓が形成されるのを防ぐ抗凝固剤です。ヘパリン溶液は、灌流固定の前に肺から血液を洗い流すために使用されます.
- 固定ソリューション
注意:固定剤は健康被害を提示することができ、化学発煙フードに使用する必要があります。すべての装置は固定剤の吸入を防ぐために化学発煙フードに置かれてあります。- カルシウムを含まないPBSとパラホルムアルデヒド(4%最終濃度)で容器を充填します。各マウスに対して合計50 mLの固定溶液を用意します。
注: 使用される固定剤の種類は、下流の組織学的研究によって異なる場合があります。
- カルシウムを含まないPBSとパラホルムアルデヒド(4%最終濃度)で容器を充填します。各マウスに対して合計50 mLの固定溶液を用意します。
5. 灌流装置の準備
注:蠕動ポンプは、一定の流量を確保するために脈管内に流体を送達するために提案されています。以下の方向は、蠕動ポンプを設定するためのものであり、モデルごとに異なる場合があります。あるいは、蠕動ポンプが利用できない場合、第2の水柱装置は、高さ35cmH2Oから流体を透過するように構築され得る。
- まず、ローラーアセンブリの周りにチューブを配置します。
- チューブをノッチポストに固定します。
- 最初に左レバーをチューブの周りに置き、上部と右のレバーで所定の位置に固定して、レバーを所定の位置にラッチします。
- チューブの近位端をヘパリン溶液に入れ、遠端を動物処理容器に入れます。
- 配管から空気を排出するためにポンプを実行することにより、チューブにヘパリン溶液をプリロード。
- チューブの左側の端に25G x 5/8インチの針を固定します。
6. 空気膨張装置の準備
- 水柱の注射器をリングホルダーに入れます。
- 動物のプラットホームから水柱の「25 cm」テープマーク(ステップ1.2)までの縦高25 cmを測定しなさい。
- 水柱のチューブの端部を空気室の栓に取り付けます。
- 空気室の雌のルアーから動物処理容器の栓にチューブを取り付けます。
注: 図 1Cに示すように空気膨張室を構成する場合、逆の順序でチューブを取り付けると、気管カニューレに接続するチューブに水が漏れる可能性があります。 - 空気室へのキャップがしっかりと閉じられていることを確認します。
- 動物処理容器の外側にある栓が閉じ、水柱から空気膨張室に通じる管の栓コックが開いていることを確認してください。
- 「25 cm」マークに水で注射器を充填します。水は空気室にチューブを通して注射器を残します。圧力が均等化されると、水は流れなくなります。
- 化学フード内の周囲の空気圧が変動するにつれて、空気膨張室に水がゆっくりと漏れる可能性があります。シリンジ内の水位に目を光らせて、必要に応じてさらに追加してください。手順全体で「25 cm」マークで水位を維持します。
注:通常、水位は25 cmH2Oで空気インフレの最初の部分のために一貫したままになります。しかし、固定中にシリンジに水を加える必要が生じるでしょう。水が流れ止まらなければ、空気膨張室内に空気漏れが存在する可能性が高い。より多くのシリコーンガスケットメーカーは、空気漏れを防ぐためにLuersの周りに適用する必要があります。
- 化学フード内の周囲の空気圧が変動するにつれて、空気膨張室に水がゆっくりと漏れる可能性があります。シリンジ内の水位に目を光らせて、必要に応じてさらに追加してください。手順全体で「25 cm」マークで水位を維持します。
7. 動物の準備 (図 2)
注: この手順は Gage ら13から変更されています。私たちは、様々な年齢の成人男性と女性のマウスに関するこの手順を完了し、年齢や性別バイアスに注意してください。
- ペントバルビタールナトリウム(150mg/kg、腹腔内)で動物を安楽死させる。解剖を始める前に、動物が死んでいることを確認してください。
注:この手順は安楽死させた動物に対して行われますが、この手順は、動物全体にパーフューズをポンプするために心臓を利用するために生きている動物に対して行うことができます。 - 腹壁を通して2つの横切開を行います。リブケージの下に最初の切開を行い、腰の上に2回目の切開を行います。下切開部から上方切開に向かって中線に沿って切る。
- 鈍いはさみを使用して、慎重に横隔膜の側面に切開を行います。肺は、横隔膜が穿刺されるとすぐに崩壊するはずです。
注:肺の穿刺を避けるために注意する必要があります。穿刺された肺は、後のステップ中に膨張する可能性が低い。 - 横隔膜に沿って横方向に切って胸腔を開きます。
- 胸骨をxiphoidプロセスから頸部ノッチまで優れた位置に切り、胸部を胸部ケージの上に横に切り、心臓と肺を完全に露出させる。胸部の側面を固定します。
- 気管の上の首に中線の切開を行います.気管を取り巻く皮膚、筋肉、甲状腺および結合組織を除去する。
- 湾曲した鉗子を使用して、後部気管の下に糸または縫合糸の2つの部分をスライドさせます。一方の縫合糸を使用してインフレルアースタブアダプタを所定の位置に保持し、もう一方を使用して最終的に空気膨張と血管灌流固定の結論で気管を締めます。
- 18G x 1インチの針またはヴァンナススプリングハサミを使用して、気管に小さな穴を突きます。
- 気管のこの穴に20Gルアースタブアダプタを置きます。
- 気管の周りに1本の糸を直ちに遠ざけ、Luer-stubアダプタが入る場所に接続して所定の位置に保持します。
- 動物を動物処理容器に移す。
- 動物処理容器の内側にある雌のルアーに Luer-スタブ アダプターを取り付けます。
8. 空気の膨張、肺の灌流および固定(図2)
- 心臓の右心室に灌流装置チューブに取り付けられた25G x 5/8"針を置きます。
- 血液が心臓から流出し、肺を通るパーフューズの流れを促進するために腹部大動脈を切断します。
- 肺を膨らませるために動物処理容器の外側の栓コックを開きます。
注:肺が完全に膨張するのに時間がかかる場合があります。注射器の水位を見て、肺に漏れがない限り、それは急速に減少すべきではありません。 - 25 cmH2Oで肺を5分間膨らませる。25 cmH2Oでのインフレは肺を前提条件とし、食前性肺領域の募集を支援する。
注:25cmの高さを維持するために、少量の水をシリンジに加える必要があります。炎症や実験的に誘発された肺損傷は、肺の膨張に影響を与える可能性があります。この場合、アテクティック地域の採用を支援するために、インフレ圧力を最大35cmH2Oまで高める必要があるかもしれません。 - 肺インフレの最後の分の間に、10 mL/minの流量に蠕動ポンプを回す。ヘパリン溶液は、動物にチューブを通してボトルから流れる必要があります。
- ヘパリン注入の目的は、血管内の血栓の形成を防ぐことです。したがって、肺が白くなり、血液が欠けになるまでヘパリンを注入する。肺が白くならない場合は、右心室針の調整が必要な場合があります。
- 5分間膨脹した後、蠕動ポンプをオフにし、ヘパリン溶液から固定液に灌流管を切り替えます。
- 水柱のシリンジを「20 cm」マークに下げます(ステップ1.3)。気泡は、圧力が25から20cmH2Oに変化するので、水柱内で動くのは正常です。
- シリンジの水位を確認してください。それは"25 cm"マークにする必要があります。この時点で追加する必要があるかもしれません。
- 1分間待って、肺が25〜20cmH2Oに収縮するようにします。
- 6.5 mL/minの流量で灌流ポンプを再起動します。
- 血管灌流は10〜15分間固定する。
9. 肺の抽出 (図 3)
- 気管の周りの2番目の糸をLuer-stubアダプタにしっかりと結びます。気管から Luer-スタブ アダプターを取り外します。
- 心臓から針を取り除きます。
- 鈍いはさみで後部の形成に結合組織を切断することによって胸腔から肺および心臓を解放する。肺を穿刺しないように注意してください。
- 慎重に肺から心臓を取り除きます.
- 肺を一晩固定剤に入れます。
注: 固定性の持続時間は、下流の組織学的研究によって異なります。- 肺を20~25mLの固定体を含む50 mL円錐形チューブに入れる。円錐形の管の開口部を通して気管を固定する糸を置き、キャップの糸によってしっかり止めます。円錐形のチューブを反転して、浮力のある空気膨張した肺が固定性で完全に水没したままであることを確認します。
- 組織学的研究のために肺を処理する。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
無傷の胸郭では、胸壁によって適用される外側の力によって肺が胸膜空間6、14を介して開いたままになっている。ダイアフラムが解剖中に入ると、胸膜腔の完全性が廃止され、肺が崩壊するはずです(図2A、2B)。肺を再拡張するために、空気インフレが行われる。最初のステップとして、崩壊した空域の募集を確実にするために25cmの水圧が適用される。したがって、動物保持容器の外の栓コックが開くと、気管を介して空気が肺に入り、インフレが容易に観察されるはずです(図2C)。肺が完全に膨張すると、インフレ圧は20cmの水圧まで低下する(図2D)。20cmの水圧は、肺の完全な膨張を維持するが、空域を過度に膨張しないために選択される。
気管結紮後(
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
一般的に使用されているが、気管内ベースの固定法は、気道から白血球を置き換え、正常な肺アーキテクチャを変更することができます。このプロトコルで提供されている血管灌流固定による空気インフレの方法は、これらの落とし穴を克服し、より正確に肺の解剖学を保存します。血管灌流固定法から高品質の組織を得るための鍵は、空気膨張圧の注意深い監視、空気漏れの回避、および血管系への固定液の適切な灌流を確保することを含む。
この手順の1つの制限は、胸郭の完全性が中断されると、肺が崩壊し、崩壊後の肺の再膨張が正確な組織学的評価のために必要であるということです。崩壊することなく肺の膨張を維持するプロトコルに代わるものは、小さな動物の人工呼吸器を使用することです。しかし、このような機器は高価であることが多く、ここでのプロトコルは安価なソリューションを提供します。健康な肺では、肺胞上皮細胞によって産生される界面活性剤は表面張力を低下させるのに役立ち、ほとんどの場合肺は容易に再拡張することができる。しかし、病気の肺では、組織が硬くなり、肺の界面活性剤機能が変化し、肺の崩壊を促進することができる。この効果を軽減するた...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、国立心臓、肺、血液研究所(NHLBI)がHL140039とHL130938を助成金によって資金提供されました。著者たちは、シャノン・ホットとジャザレ・マクレンドンの技術的専門知識に感謝したいと考えています。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 00117XF -ストップコック1ウェイ100 / PK Mルアー | コール-パー | マーMFR#VPB1000050N –アイテム # EW-00117-XF | ストップコック |
| BD 60 mL シリンジ、スリップチップ | BD | 309654 | 水柱の構築に使用されるシリンジ |
| BD PrecisionGlide ニードル 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | 血管灌流/固定用ニードル |
| ルアー スレッド スタイル パネル マウント 1/4-28 UNF からオス ルアー | ノードソン メディカル | FTLLBMLRL-1 | メス ルアー |
| ブタ腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | H3393 | ヘパリン溶液。 |
| ルアースタブアダプター BD Intramedic 20 ゲージ | BD Biosciences 427564 | ルアースタブアダプター | |
| オス ルアー (2) からメス ルアー スレッド スタイル | ティー ノードソン メディカル | LT787-9 | オス ルアー |
| ナルゲン 180 透明プラスチック PVC チューブ | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 8000-9020 | チューブ |
| パラホルムアルデヒド水溶液 - 32% | 電子顕微鏡 | Sciences 15714-S | 固定液。リン酸塩緩衝生理食塩水で4%に希釈 |
| Permatex ウルトラブルー多目的RTVシリコーンガスケットメーカー | Permatex | 81724 | チャンバーの気密シール用シリコーンガスケットメーカー |
| リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1x | コーニング | 21-040-CV | 空気膨張チャンバーの構築に使用されるボトル、およびヘパリンおよび固定液 |
| に使用される緩衝液Steriliteウルトラシール16.0カップ長方形食品保存容器 | Sterilite0342 | 動物加工容器 |
参考文献
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492(2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564(2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
