前生体肺の構造と収縮性研究のための効率的なツールとしての精密切断肺スライス

サマリー

ここに提示されるPCLSマウス肺組織の血管収縮性を維持するためのプロトコルは、多数の手順に影響を受けやすい最大10日間保存することができる肺血管構造および気道の洗練された3次元画像をもたらす。

要約

ネズミ肺組織の可視化は、基礎となる気道と脈管構造に関する貴重な構造および細胞情報を提供する。しかし、生理学的状態を真に表す肺血管の保存は依然として課題を提示する。さらに、マウスの肺の繊細な構成は、細胞の組成とアーキテクチャの両方を保持する高品質の画像のサンプルを準備する技術的な課題をもたらす。同様に、細胞収縮アッセイは 、細胞がインビトロで血管収縮剤に応答する可能性を研究するために行うことができるが、これらのアッセイは、無傷の肺の複雑な環境を再現しない。これらの技術的な問題とは対照的に、精密切断肺スライス(PCLS)法は、地域的バイアスなしで3次元で肺組織を可視化し、最大10日間の生きた代理収縮モデルとして機能する効率的な代替手段として適用することができる。PCLSを用いて作製された組織は、構造と空間的指向を保存しており、疾患プロセス ex vivoを研究するのに理想的です。誘導可能なtdTomatoレポーターマウスモデルから採取したPCLS中の内因性tdTomato標識細胞の位置を、共焦点顕微鏡でうまく可視化することができます。血管収縮剤に曝された後、PCLSは、血管収縮性と肺構造の両方の保存を示し、これはタイムラプスモジュールによって捕捉することができる。ウェスタンブロットやRNA解析などの他の手順と組み合わせて、PCLSは、多種多様な障害の根本となるシグナル伝達カスケードの包括的な理解に貢献し、肺血管疾患における病態生理学のより良い理解につながります。

概要

解剖学的構造を犠牲にすることなく細胞成分を保存する肺組織の調製およびイメージングの進歩は、肺疾患の詳細な理解を提供する。生理学的構造を維持しながらタンパク質、RNA、およびその他の生物学的化合物を同定する能力は、多数の肺疾患における病態生理学の理解を広げることができる細胞の空間的配置に関する重要な情報を提供する。これらの詳細な画像は、肺動脈高血圧症などの肺血管疾患を動物モデルに適用すると、より良い理解を導き、治療戦略の改善につながる可能性がある。

技術の進歩にもかかわらず、ネズミ肺組織の高品質の画像を得ることが課題です。呼吸周期は、吸入時に発生する負の胸腔内圧によって駆動される^1.従来、生検を取得し、イメージング用の肺サンプルを準備すると、負圧勾配が失われ、気道と脈管構造が崩壊し、現在の状態ではもはや現像されません。現在の状態を反映した現実的な画像を実現するには、肺気道を再膨張させ、脈管構造を浸透させ、動的肺を静的な固定具に変える必要があります。これらの異なる技術の適用は、構造的完全性、肺血管系、およびマクロファージなどの免疫細胞を含む細胞成分の保存を可能にし、肺組織を可能な限り生理学的状態に近い状態で見ることができます。

精密切断肺スライス(PCLS)は、肺血管構造²の解剖学と生理学を研究するための理想的なツールです。PCL....

プロトコル

すべての動物ケアは、ボストン小児病院と制度動物ケアと使用委員会が承認したプロトコルのガイドラインに従っていました。本研究で使用されたマウスは、野生型C57/B6マウスとCdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato交差マウスである。

1. ソリューションの準備

1. 事前に実験中に必要なリン酸緩衝液(1x PBS)および2%アガロース溶液を調製する。
   1. 100mLのオートクレーブ水に2gのアガロース粉末を混ぜます。溶液が透明になるまで、電子レンジで数秒間加熱します。
   2. 水浴中に溶液を42°Cで入れ、使用するまで入れます。
      注:PBSと2%アガロースの両方を室温で数週間保存することができます。

2. マウス肺の抽出

1. イオブルランの過剰摂取によってマウスを安楽死させる。少量のイオブルランを下のレベルのティッシュペーパーに置き、乾燥剤で上のレベルにマウスを置くことによって、イオブルランの過剰摂取を達成する。マウスは無意識になるまでデシケーターに残ります。
2. 首に劣った圧力をかけ、尾に尾を引っ張って、マウスの死を確実にします。マウスを解剖面に持って行きます。
3. マウスをスピーフィンの位置に置き、テープでテーブルにテーピング足と鼻を所定の位置に固定します。

結果

細胞や組織に添加すると、生存率試薬は、生き生きとしている組織の還元環境によって修飾され、ピンク/赤色に変わり、蛍光性が高くなります。0-1 日と 9-10 日から検出された代表的な色の変化を 図 3に示します。前述のように、溶液は青色で始まり、一晩でピンク色になり、生存率を示しました。色の変化は通常 1 ~ 4 時間以内に発生します。ただし、時間が長くなる場合があります。生存率のアッセイのために、プレートリーダーを使用して、ビブラートメ調製サンプルと4%PFA固定肺スライスの吸光度を決定し、コントロールとして機能した。サンプルをインキュベートしたソリューションは、メーカーの推奨に従って562 nmおよび630 nmの吸光度で読み取られました。ビブラートムで調製した組織の562nmと630nm波長の吸光度と対照組織との比較の間の日次差を 図3に示す。

ビブラートメが調製した肺組織の収縮性を示すために、新鮮な組織を400xで明視野顕微鏡の下に置き、組織が水没するまでK.......

ディスカッション

本稿では、血管構造を維持し、実験の柔軟性を最適化するマウス肺組織の高解像度画像を生成する強化された方法が記載されており、特にPCLSの適用を用いて、血管系の収縮を3次元で見ることができる肺組織の微小スライスを得る。生存率試薬を使用して、プロトコルは慎重に調製され、保存されたスライスが1週間以上生存率を保持できることを実証する。マイクロスライスの生存率を維持することで、血管構造と気道構造で複数の長期実験を行う可能性があり、複数の薬物の ex vivo 応答をテストし、基礎となる分子メカニズムを評価し、試薬をテストするのに理想的なサンプルとなります。これにより、準備されたサンプルは 、インビボ 試験⁴の前に血管の緊張に対する潜在的な治療効果を研究するのに理想的なプラットフォームになります。肺気道と脈管構造の保存により、準備されたサンプルを、本項で説明した収縮性検査などの追加技術で処理し、 表1にまとめることができる。これにより、肺血管構造とシグナル伝達カスケードの空間的配置を詳述した高解像度画像を提供する機会が得られ、肺血管.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シリンジに0.5ccの分画ヘパリン		100 USP単位/mL
1X PBS	コーニング	21-040-CM
20 1/2インチゲージ鈍いエンドニードル気管カニューレ用	Cml 供給	90120050D
30cc シリンジ	BD	309650
アンチ アンチ ソリューション	Gibco	15240096
自動振動ブレード ミクロトーム	ライカ	VT1200S
細胞生存率試薬 (alamarBlue)	サーモフィッシャー	DAL1025
共焦点	ツァイス	880
ダルベッコs Modified Eagle Medium および GLutaMAX、10% FBS、1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
エンドセリン-1	Σ	E7764
KCl	Σ	7447-40-7
モルタルと乳棒	Amazon
RIPA 溶解および抽出バッファー	Thermoscientific	89900
外科用縫合糸 6/0	FST	18020-60
トリゾール試薬	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure 低融点アガロー	ス Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G

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