タンパク質アルギニンメチルトランスレシーゼ1-9細胞内活性を研究する定量的方法

サマリー

これらのプロトコルは、細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスファーゼ(PRMT)ファミリーの個々のメンバーの酵素活性を評価するために使用される方法論を提供する。内因性および外因性バイオマーカー、メチルアルギニン認識抗体、および阻害剤ツール化合物を用いたPRMT活性評価に関する詳細なガイドラインが記載されている。

要約

タンパク質メチルトランスファー酵素(PRMT)は、基質タンパク質のアルギニン残基へのメチル基の転移を触媒します。PRMTファミリーは、アルギニン残基を単メチル化または対称/非対称的にジメチル化することができる9つのメンバーから構成されています。様々なタンパク質のアルギニンメチル化の異なるタイプを認識するいくつかの抗体が利用可能です;従って、PRMT活性バイオマーカーアッセイの開発のためのツールを提供する。PRMT抗体ベースのアッセイは、重なり合う基質とモチーフベースの抗体特異性により困難です。これらの問題と個々のPRMTによって寄与するアルギニンメチル化を調査するための実験的なセットアップが議論されている。9つのPRMTのうち8つのバイオマーカーである代表的な基質を慎重に選択して、PRMT活性アッセイのパネルを設計しました。ここで、細胞アッセイ用のプロトコルは、細胞内のPRMTファミリーの個々のメンバーの酵素活性を定量的に測定する方法が報告されている。上記の方法の利点は、細胞培養および蛍光ウェスタンブロット機能を備えたあらゆる実験室でのそれらの簡単な性能である。基質特異性および選択された抗体信頼性は、ノックダウンおよび過剰発現アプローチで完全に検証された。アッセイバイオマーカーおよび抗体の詳細なガイドラインに加えて、PRMTのためのインヒビターツール化合物コレクションの使用に関する情報も提供される。

概要

アルギニンメチル化は、タンパク質とタンパク質とRNAの相互作用を調節する重要な翻訳後修飾であり、mRNA前スプライシング、DNA損傷、転写応答、および成長因子媒介伝達^1,2などの様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。アルギニンは、モノメチルアルギニン(Rme1)、非対称ジメチルアルギニン(Rme2a)、または対称型ジメチルアルギニン(Rme2s)3を生じるタンパク質アルギニンメチルトランスレシエート(PRMT)によってメチル化される。メチル化タイプに基づいて、PRMTは、モノメチル化と非対称ジメチル化を触媒するI型(PRMT1、2、3、4、6、および8)の3つのグループに分類されます。モノおよび対称的なジメチル化を触媒するII型(PRMT5およびPRMT9)。そしてIII型(PRMT7)は、アルギニン3のモノメチル化しか^{できない。}

市販のアルギニンメチル化特異的抗体の数が増えているため、PRMT活性はウェスタンブロッティングを使用して測定することができます。蛍光性ウェスタンブロットは、より大きなダイナミックレンジと直線性、高感度、および多重化を可能にする4に起因する化学発光検出よりも好ましい^{技術である。}タンパク質メチル化レベルを定量するためには、メチル化シグナルを全タンパク質レベルに正規化することが必要です。異なる宿主種(例えば、マウスおよびウサギ)で育てられた全量およびメチル化タンパク質に対する抗体を選択することにより、異なるフルオロフォアで標識された二次抗体を使用することができ、両方の抗体のシグナルを同じサンプルバンドで決定することができる。メチルアルギニン抗体は、特定の文脈でメチルアルギニンが見つかるモノメチル化、非対称、または対称的にジメチル化タンパク質を同定し、特徴付けるために開発されました。PRMTsメチル化グリシンとアルギニンが豊富なモチーフの大部分が基質⁵の中で、それぞれ、モノメチルまたは非対称の対称ジメチルアルギニングリシン反復を含むペプチドに対していくつかの抗体が発生した。他のメチルアルギニン抗体は、これらの特定の文脈におけるメチルアルギニンの検出を容易にする反復文脈における非対称、対称ジメチル−およびモノメチルアルギニンを含むペプチドライブラリーに対して生成^{された6。}ヒストンH4R3me2aやBAF155-R1064me2aなどのメチル化を選択的に検出できる単一タンパク質上の特定のアルギニンマークを認識する抗体も増えています。

市販のPRMT阻害剤は、PRMT細胞アッセイ用のツールとして使用できるいくつかの市販のPRMT阻害剤があります。しかし、それらのすべてが選択性とオフターゲット効果のために完全に特徴付けられているわけではないし、いくつかは慎重に使用する必要があります。構造ゲノムコンソーシアムは、学術機関や製薬パートナーと共同で、科学界の制限なく使用できる強力で選択的で細胞透過性のPRMT阻害剤(化学プローブ)を開発しました。これらの阻害剤に関する情報は、https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics および https://www.chemicalprobes.org/ に記載されています。化学プローブは、インビトロIC₅₀または_Kd<100nM、同じファミリー内のタンパク質に対する30倍以上の選択性、および1μMでの有意な細胞活性を有する低分子阻害剤であり、さらに、各化学プローブは、意図された標的^{7、8、9、10、11、12}に対して不活性である近い化学類似体を有する。

このプロトコルの目的は、蛍光ウェスタンブロット法を用いて個々のPRMTファミリーメンバーの細胞活性を測定することです。ここでは、検証済みのアッセイバイオマーカー、抗体、および強力な細胞活性阻害剤に関する詳細情報と、アッセイの実装を成功させるための貴重な戦略が提供されています。

プロトコル

1. 細胞培養とめっき

注:マイコプラズマ汚染について、推奨媒体とテストを行う培養細胞。HEK293T、MCF7、およびC2C12細胞は、PRMTアッセイでこれらの細胞株が正常に使用されたので、例として選ばれました。

1. DMEMにおける培養HEK293T、MCF7、およびC2C12は、10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U^mL−1)、およびストレプトマイシン(100μg^mL−1)を10cmの組織培養処理(TC)ディッシュで補充した。
2. PRMT8アッセイの場合、アッセイ開始前に3日間、ドキシサイクリン(2 μg/mL)を含む培地でPRMT1誘導ノックダウンHEK293T細胞を増殖させます。
3. 細胞をプレートするには、プレートから培地を取り出して捨てます。
4. 10 mLのPBS(Ca⁺² およびMg⁺² イオンを含まない)を加え、細胞を洗浄し、溶液を廃棄します。
5. トリプシンEDTA(0.25%)を1 mL加え、室温(RT)で1分間インキュベートし、溶液を廃棄します。細胞が丸くなるまでインキュベートし、プレートから取り外します。必要に応じて、プレートをタップしてセルを取り外します。C2C12などのトリプシン化が困難な細胞の場合は、37°Cでプレートを1〜2分間インキュベートします。
   注:細胞の生存率を低下させるため、トリプシン溶液への細胞暴露を長期間(>10分)避けてください。
6. プレートに1mLのプリウォームされた培地を加え、ピペット細胞を上下にそっと分解して細胞の塊を分解します。細胞を15mLチューブに移し、3〜5mLの培地を加えます。
7. 細胞数を測定するには、10 μLのトリパンブルーと10 μLのセルを混合し、10 μLをヘモサイトメーターに移すか、他の細胞計法を使用します。
8. 推奨セル密度にセルを希釈し、500 μL/wellを24ウェルTCプレートに入れる(表1)。内因性アッセイ(PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7、およびPRMT9)については、ステップ3.1に進みます。

2. 細胞トランスフェクション

1. 外因性アッセイ(PRMT3、PRMT6、PRMT8)の場合、推奨量のDNAを用いてHEK293T細胞をトランスフェクトする(表2)。HEK293T細胞はトランスフェクトが容易なので、メーカーの指示に従って、あらゆるトランスフェクション試薬を使用できます。

3. 複合処理

注:培養培地中の最終ジメチルスルホキシド(DMSO)濃度を0.1%超えないでください。各ウェルに同じDMSO濃度を保ちます。選択的PRMT阻害剤(化学プローブ)およびそれらの密接に関連する不活性な類似体を 表3に示す。

1. 内因性アッセイ(PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7、PRMT9)の場合は、細胞から培地を取り出し、化合物またはDMSO単独で500μLの培地に置き換えます(コントロール)。
   注:通常、Rメチル化レベルの80%以上の減少を観察するのに2日かかります。
2. 外因性アッセイ(PRMT3、PRMT6、PRMT8)の場合、トランスフェクション後4時間の培地を取り出し、化合物またはDMSO単独(対照)で500μLの培地を添加し、20〜24時間インキュベートします。

4. 細胞のライセート調製

1. ウェルからすべてのメディアを取り除き、100 μLのPBSで洗浄して残留培地を取り除き、 60 μLのリシスバッファー(20 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、1 mMエチレンジアミント酢酸(EDTA)、10 mM MgCl 2、0.5% トリトン X-100、12.5 U mL-1 ベンゾナーゼ、完全なEDTAフリー阻害剤をそれぞれ加えます。
   1. RTで1分未満インキュベートし、プレートを揺らし、細胞上にリシスバッファーを分配する。次に、20%の3μLを加えて、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、最終的な1%濃度にし、軽く振って混ぜます。ライセートをマイクロ遠心チューブに移し、氷の上に保管します。
      注:使用前に新鮮なベンゾナーゼとタンパク質阻害剤カクテルを追加します。ベンゾナス酸の添加は、細胞のリゼート粘度を低下させる核酸を迅速に加水分解する。
2. BCAプロテインアッセイキットを使用してサンプルのタンパク質濃度を決定するか、溶液中の1%SDSを許容する他の方法を使用してください。
   1. 96ウェルクリアプレートのウェルに、2 μLのライセートおよびタンパク質標準(リシスバッファー内の BSA の 0、1、2、4、および 8 μg/mL)を加えます。
   2. 試薬Aと試薬Bを50:1比で混合し、1ウェルあたり200μLを加えます。37°Cで20分間インキュベートし、吸光度を読み取ります。
3. サンプル全体で等しくなるように、リシスバッファーでタンパク質濃度を調整します。
4. 4xローディングバッファーの20 μLを60 μLのセルライセートに加え、95°Cで5分間加熱します。熱変性後、ライセートは-20°Cで保存することができる。

5. ウェスタンブロット分析

1. ヒストンタンパク質の分析用に5~20μgの全細胞ライセートを、他のタンパク質に対して20~100 μgを4-12%ビストリスタンパク質ゲルにロードします。
2. MOPS SDSランニングバッファ(50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1%SDS w/v、1 mM EDTA、pH 7.7)で、100Vで約2時間、または色素フロントがゲルの底部に達するまで、ゲルを実行します。
3. 湿式移送を行う場合は、氷冷トリスグリシン転送バッファー(25 mMトリス、192 mMグリシン、20%v/vメタノール、および0.05%w/v SDS)でトランスファーサンドイッチを組み立てます。
   1. メーカーの指示に従ってスポンジ、フィルターペーパー、PVDF膜、ゲルを配置します。メタノールに浸漬してPVDF膜を活性化し、アセンブリ前に30秒間の転写バッファーにゲルを平衡化します。
      注:ヒストンなどの低分子量タンパク質に対する自己蛍光性と適合性が低いため、推奨されるPVDFウェスタンブロッティングメンブレンを使用してください(材料表)。
4. トリスグリシン移動バッファーでゲルから PVDF 膜にタンパク質を 1.5 時間氷上で転送します。
5. ブロックバッファー内の30分間のブロック膜 (5% w/v 乳酸緩衝塩分、PBS).洗浄バッファー(PBST:PBSで0.1%v/v Tween-20)を用いてリンスし、ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中の一次抗体(PBST中5%BSA)を一晩4°Cでインキュベートする(表3)。
   注:長期保存のために、フィルター殺菌BSA溶液、0.02%w/vナトリウムアジドを加え、4°Cに保ちます。
6. PBSTで3×5分洗浄します。その後、ヤギ抗ウサギ(IR800)とロバ抗マウス(IR680)抗体を推奨ブロッキングバッファー(材料表、表3)でRTで30分間インキュベートし、PBSTで3 x 5分洗浄します。
7. 800および700 nmの蛍光ウェスタンブロットイメージャーの信号を読み取る。高感度かつダイナミックレンジ、高い信号対雑音比、画像飽和度に達したときの警告、同じサンプルバンド内の2つの蛍光色の多重化を持つ単一の画像で、強いバンドとかすかなバンドを明確にイメージングできる機器を使用するのが好ましい。
8. 蛍光ウェスタンイメージング用の適切なソフトウェアを使用して、ウェスタンブロット分析のためのバンド強度を決定します。

結果

個々のPRMTの細胞アッセイに関するウェスタンブロット結果の例を以下に示す。アッセイの詳細も 表4にまとめた。

PRMT1アッセイ
PRMT1は、ヒストン4アルギニン3不斉ジメチル化(H4R3me2a)細胞¹³の主な貢献者です。PRMT1活動の喪失時に、グローバルRme1およびRme2sのレベルは¹³を大幅に増加させる。図1Aおよび1Bに示すように、いくつかの抗体は、Rme1、Rme2a、Rme2s、およびH4R3me2aのグローバルな変化を監視するために使用することができる。グローバル Rme2a および H4R3me2a レベルの大幅な低下と Rme1 および Rme2s の増加は、PRMT1ノックダウンの 3 日後に観察できます (図 1A、B)。基底H4R3me2aシグナルにおいて細胞株が異なり、従って、PRMT1活性の低下を監視しやすくするために、高い基底メチル化レベルを有するMCF7などの細胞株が使用できる(図1C)。PRMT1阻害の効果を観察するのに最適な時間は、例えばI型PRMT阻害剤MS023⁸による治療に対して、2日間である(図1D、1E)。より長い治療は、細胞の生存率および成長を減少させる。

PRMT3アッセイ
PRMT3細胞アッセイでは、PRMT3のノックダウンや過剰発現時に、メチル化変化を検出できる選択的バイオマーカータンパク質は検出できませんでした。PRMT3は、インビトロ¹⁴においてH4R3を非対称的にジメチル化することが示されたが、マークはPRMT1によって主に堆積し、したがって過剰発現PRMT3を有する外因性アッセイが設計された。インビトロの所見と一致して、野生型PRMT3の過剰発現は、その触媒変異体(E338Q)ではなくH4R3me2aレベルの増加につながった(図2A)。HEK293T細胞は、このマークの低基底メチル化を有するので使用された(図1C)。このアッセイはさらにPRMT3選択的阻害剤SGC707⁷で検証され、これはPRMT3依存性H4R3非対称メチル化を阻害した(図2B)。

PRMT4アッセイ
アルギニン1064¹⁵でPRMT4非対称ジメチル化BAF155.抗体検出BAF165-R1064me2aは市販されているので、細胞内のPRMT4活性は、R1064me2aマークレベルの変化を検出することによってウェスタンブロットによってモニタリングすることができる。PRMT4選択的阻害剤によるPRMT4タンパク質の消失または触媒活性の阻害は、TP-064 10、BAF165-R1064me2aレベルの低下をもたらす(図3)。2日間の治療は、通常、メチル化シグナルのほとんどを除去するのに十分です。

PRMT5アッセイ
PRMT5は、タンパク質アルギニン対称ジメチル化の大部分を担っています.SmBB'を含む様々なSMN複合体タンパク質がPRMT5基質¹⁶であると以前に報告されている。PRMT5活性は、対称アルギニンジメチル化またはSmBBタンパク質の対称的なジメチル化のグローバルレベルの変化を見ることによって監視することができる。PRMT5のノックダウンは、PRMT1、3、4、6、および 7ではなく、グローバル Rme2s レベルの低下を生じます (図 4A)。ほとんどの細胞株において、2〜3日間のPRMT5選択的阻害剤LLY-283¹¹およびGSK591を有する細胞の治療は、SmBB'Rme2sシグナルの大部分を抑制した(図4B)。ほとんどの細胞はPRMT5阻害に敏感であり、長期の阻害剤暴露による細胞増殖および細胞死の減少をもたらす。

PRMT6アッセイ
PRMT6がヒストンH3アルギニン2不斉ジメチル化(H3R2me2a)細胞¹⁷の主な貢献者であると報告されている。HEK293T細胞において 、3日間のPRMT6 ノックダウンはH3R2me2aレベルの有意な減少を観察するのに十分ではなかった。しかし、野生型PRMT6の過剰発現は、その触媒変異体(V86K/D88A)ではなく、H3R2me2aのレベルを増加させるとともに、H3R8me2aおよびH4R3me2a(図5A)である。異なる効力および選択性を有するPRMT6活性を阻害するいくつかの阻害剤がある:選択的、アロステリックPRMT6阻害剤SGC6870^18、PRMT型I型阻害剤MS023^8、およびPRMT4/6阻害剤MS049^9。これらの阻害されたPRMT6の全て依存性H3R2(図5B)、ならびにH4R3およびH3R8不斉ジメチル化(データは示さない)が含まれる。

PRMT7アッセイ
PrMT7モノメチル化アルギニン469は、HSP70の構成および誘導可能な形態の両方(HSPA8およびHSPA1/6、それぞれ⁾¹²である。HSP70-R469me1レベルを検出する市販の抗体はありませんが、このマークは、パンモノメチル抗体で検出できます。PRMT7選択的阻害剤によるPRMT7タンパク質の消失または触媒活性の阻害は、SGC3027 12、HSP70-R469me1の低下したレベルをもたらす(図6A、B)。SGC3027は細胞透過性プロドラッグであり、細胞内ではレダクターゼによってPRMT7選択的阻害剤SGC8158に変換され、したがって細胞力は細胞株間で異なる場合がある。いくつかの癌細胞株は、高レベルで誘導性HSP70アイソフォームを発現し、かつ、核起源の重複非特異的バンドによるメチル化を検出することは困難であり得る(図6C)。したがって、PRMT7細胞アッセイについては、主にC2C12のようなHSPA8を発現する細胞株が推奨され、またはHSP70が主に細胞質に局在するため、好ましい細胞株の細胞質画分でHSP70-R469me1レベルを決定する。

PRMT8アッセイ
PRMT8は、組織制限発現パターンを有する唯一のPRMTであり、主に脳¹⁹で発現する。それは80%の配列類似性を共有し、PRMT1¹⁹と同様の基質好みを有する。主にN末語でPRMT1と異なり、そこでは、マイリストイル化はPRMT8と形質膜²⁰との関連を生じる。PRMT8と共にPRMT1メチル化RNA結合タンパク質 EWS²¹.PRMT8活性は非神経細胞株では低く、また、EWSもPRMT1によってメチル化することができるので 、PRMT1 ノックダウン細胞においてPMRT8がEWSと共に過剰発現するアッセイが開発された。 PRMT1 は必須遺伝子であり、その長期損失は細胞死に起因するので 、PRMT1がPRMT8 アッセイで使用される前に3日間倒される誘導性システムが利用された(図7A)。野生型PRMT8の共発現は、触媒的に不活性な変異体(E185Q)ではないが、EWSと共にEWS非対称ジメチル化のレベルが増加した(図7B)。いくつかの非対称ジメチルアルギニン抗体を試験し、メチル化はAsym25抗体でのみ検出された。このアッセイは、PRMT型I型選択的化学プローブMS023⁸によりさらに検証され、外因性EWSのPRMT8依存性不斉二メチル化が減少した(図7B)。MS023は インビトロ アッセイでPRMT8を阻害する上で非常に強力であるが、細胞内で高濃度のMS023はメチル化阻害²¹を見る必要がある。

PRMT9アッセイ
PRMT9は、アルギニン508²²でSAP145を対称的にジメチル化することが示された。残念ながら、市販の抗体はマークを認識できません。PRMT9アッセイでは、ヤンソン・ヤン博士(ベックマン・リサーチ・インスティテュート・オブ・ホープ)から優しく贈られた抗体が使用されました。過剰発現すると、野生型はR508K変異型のSAP145ではなく、PRMT9によってメチル化される(図8A)。このアッセイは、内因性SAP145-R508me2sのレベルを監視するように設計されており、ナノモルポテンシーを持つインビトロでPRMT9を強力に阻害する試作PRMT9阻害剤(進行中の作業、未発表)である化合物Xで検証されました。化合物Xは、用量依存的な方法でSAP145-R508me2sレベルを低下させる(図8B)。

図 1.PRMT1細胞アッセイ。 (A) PRMT1 ノックダウンは、グローバルな非対称アルギニンジメチル化(Rme2a)の減少と対称アルギニンジメチル化(Rme2s)およびモノメチル化(Rme1)のレベルの増加をもたらす。PRMT1のノックダウン効率はパネルBで提示される(B)PRMT1ノックダウンはヒストンH4R3(H4R3me2a)の非対称ジメチル化を減少させる。(C) 基底H4R3me2aレベルは、細胞株によって異なる。(D) I型PRMT阻害剤 MS023は、用量依存的にH4R3me2aレベルを低下させる。MCF7細胞をMS023で2日間処理した。(E)グラフは、H4R3me2a信号強度の非線形適合を合計ヒストンH4に正規化した値を表します。MS023 IC50 = 8.3 nM (n=1) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.PRMT3細胞アッセイ。(A)野生型(WT)の過剰発現は、H338Qの触媒変異体ではないPRMT3のHEK293T細胞においてH4R3me2aレベルを増加させる。細胞は24時間のFLAGタグ付きPRMT3でトランスフェクトした(B)PRMT3選択的阻害剤、SGC707、異所性PRMT3依存性H4R3非対称脱メチル化を減少させ、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。

図 3.PRMT4細胞アッセイ。 (A) PRMT4 ノックダウンはBAF155-R1064非対称アルギニンジメチル化(HEK293T細胞)の減少をもたらす。(B) PRMT4選択的阻害剤、TP-064は、BAF155-R1064Rme2aレベルを低下させる。HEK293T細胞を2日間化合物で処理した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.PRMT5細胞アッセイ。 (A) PRMT5 ノックダウンは、グローバル対称アルギニンジメチル化レベルの低下をもたらす (MCF7 細胞).(B) PRMT5選択的阻害剤 GSK591 および LLY-283, SmBB' 対称アルギニンジメチル化を減少させます (緑), SmBB' の総レベルは変わらない間 (赤).MCF7細胞を2日間化合物で処理した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.PRMT6細胞アッセイ。(A)野生型(WT)の過剰発現は、V86K/D88A触媒変異型PRMT6はHEK293T細胞においてH4R3me2a、H3R2me2aおよびH3R8me2aレベルを増加させる。細胞は24時間(B)PRMT6選択的阻害剤(SGC6870)、PRMT型I阻害剤(MS023)、およびPRMT4/6阻害剤(MS049)がPRMT6依存H3R2me2aレベルを低下させるFLAGタグPRMT6でトランスフェクトした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6.PRMT7細胞アッセイ。 (A) PRMT7 ノックアウトはHSP70-R469モノメチル化(HCT116細胞)の減少をもたらす。(B)PRMT7選択的阻害薬は、SGC3027、C2C12細胞におけるHSP70-R469モノメチル化を減少させる。細胞を2日間化合物で処理した。(C)コンウニングモノメチルアルギニン抗体(Rme1)による誘導性HSP70(HSPA1/6)のHSP70-R469メチル化の検出は、核起源の重複非特異的バンドのために困難な場合がある。細胞質画分でHSP70メチル化レベルを測定することが推奨されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 7.PRMT8細胞アッセイ。 (A) ノックダウンによって PRMT1 アクティビティが阻害された場合に、EWS の PRMT8 メチル化を検出できます。HEK293T細胞を誘導可能な PRMT1 ノックダウンベクターで導入した。3日間のドキシサイクリン治療の後、PRMT1レベルが大幅に低下した。(B) PRMT1 が倒されると、外因性EWSは、過剰発現した野生型PRMT8(E185Q)によって非対称的に二メチル化されるが、PRMT8の触媒変異体(E185Q)ではない。メチル化は、PRMT型I型阻害剤(MS023)の高濃度化により減少する。HEK293T PRMT1KD細胞は、FLAGタグ付きPRMT8野生型または触媒変異体およびGFPタグ付きEWSと共にトランスフェクトし、MS023で20時間処理 した。

図 8.PRMT9細胞アッセイ。 (A) 野生型だが R508K変異型の SAP145 はPRMT9によってメチル化される。HEK293T細胞は、GFPタグ付きSAP145を1日間トランスフェクトした。(B) 試作PRMT9阻害剤(化合物X)は、用量依存的にSAP145のPRMT9依存R508対称ジメチル化を減少させる。HEK293T細胞を2日間化合物で処理した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

PRMT	細胞	1 ml あたりの密度
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	ヘク293T	2 x 105
PRMT4	ヘク293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	ヘク293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	ヘク293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	ヘク293T	2 x 105
*PRMT8アッセイ用めっきの3日前にドキシサイクリン(2μg/mL)で細胞を治療

表 1.PRMTアッセイに推奨される細胞タイプと密度。

PRMT	μg DNA/24ウェル	アドジーン#	その他の注意事項
PRMT3	0.5 フラッグ-PRMT3	164695
	または 0.5 フラグ PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 フラッグ-PRMT6	164697
	または0.5フラッグPRMT6(V86K/D88A)	164698
PRMT8	0.05 EWS-GFP	164701
	0.45 PRMT8-FLAG	164699
	または 0.45 PRMT8(E185Q)-フラグ	164700
PRMT9	0.05 SAP145-GFP	NA	ベックマン希望都市研究所 ヤンソンヤン博士からの贈り物
	または 0.05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 空のベクトル

表 2.トランスフェクション実験に推奨されるDNA濃度。

PRMT	抗体	化学プローブ(細胞活性IC50)	ネガティブコントロール
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 -PRMT タイプ I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1、PRMT6、PRMT3、PRMT4 IC50 = 9、56、1000、5000 nMそれぞれ)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-アクチン (1:500)
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	旗 (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	スキー-73(IC50 = 540 nM)*	スキー-73N*
PRMT5	反SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 nM)	LLY-284
	Rme2s (#13222、 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870(IC50 = 0.9 μM)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 -PRMT タイプ I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1、PRMT6、PRMT3、PRMT4 IC50 = 9、56、1000、5000 nMそれぞれ)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4,6 IC50 = 970,1400 nM, それぞれ)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	旗 ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 μM)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	旗 (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	ベックマン希望都市研究所ヤンソン博士からのSAP145-R508me2s - 親切な贈り物(1:1000)(PIMID:25737013)
二次抗体	ヤギ抗ウサギIgG-IR800 (1:5000)
	ロバアンチマウスIgG-IR680 (1:5000)
*- 抗体はHSPA8、HSPA1およびHSPA6(過剰発現GFPタグタンパク質で試験される)を認識する、*プロドラッグ-IC50は様々な細胞株間で異なる場合がある

表 3.推奨抗体およびPRMT化学プローブ/陰性対照ツール化合物。

PRMT

バイオマーカー

アッセイ読み出し

アッセイ検証

推奨されるセルライン

参照。

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

H4R3me2aレベルは、合計H4グローバルRme1、Rme2aまたはRme2sレベルに正規化され、B-アクチンに正規化された。

PRMT1のノックダウンは、基底H4R3me2aおよびグローバルRme2aレベルを減少させ、細胞内のグローバルRme1およびRme2sレベルを増加させた(図1A、B)。PRMT I型化学プローブMS023は、用量依存的にH4R3me2aのレベルを低下させた(図1D)。

細胞は基底H4R3me2aレベルで異なる(図1C)。MCF7細胞は、PRMT1活性の低下を監視するアッセイのために好ましい高い基底H4R3me2aレベルを有する。

8

PRMT3

H4R3me2a

外因性FLAGタグ付きPRMT3 WTまたは触媒E338Q変異体(バックグラウンド)によって引き起こされるH4R3me2aメチル化レベルは、総ヒストンH4に正規化

野生型PRMT3の過剰発現は、その触媒変異体(E338Q)ではないH4R3me2a(図2A)を増加させた。PRMT3選択的阻害剤SGC707は、H4R3me2aレベルのPRMT3依存性の増加を減少させた(図2B)

HEK293T細胞は、低基底H4R3me2aレベル(図1C)を有し、外因性PRMT3活性を監視するために好ましい

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

BAF155-R1064me2aレベルは合計BAF155に正規化

PRMT4ノックダウンはBAF155の非対称ジメチル化を減少させた(図3A)。PRMT4選択的化学プローブ(TP-064)による2日間の処理は、BAF155の非対称ジメチル化を減少させた(図3B)。

任意のセルライン

10

PRMT5

スムブ'-Rme2s

パン Rme2s 抗体 (CST) で検出された SmBB'-Rme2s レベルは、合計 SmBB' に正規化

PRMT5のノックダウンはSmBBの対称ジメチル化レベルを低下させた(図4A)。PRMT5選択的化学プローブによる2日間の処理,GSK591およびLLY285,SmBB'-Rme2sレベルの低下(図4B)。

任意のセルライン

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a、H3R2me2aまたはH3R8me2aメチル化レベルは、外因性FLAGタグ付きPRMT6 WTによって増加されるが、触媒V86K、D88A変異体(バックグラウンド)は、それぞれ総ヒストンH4またはH3に正規化された

野生型PRMT6の過剰発現は、その触媒変異体(V86K,D88A)ではなく、H3R2me2a、H3R8me2aおよびH4R3me2aレベルを増加させた(図5A)。アロステリックPRMT6阻害剤(SGC6870)、PRMT型I型阻害剤MS023、PRMT4/6阻害剤MS049はH3R2me2aレベルにおけるPRMT6依存性の増加を減少させた(図5B)。

HEK293T細胞は、低基底H4R3me2a、H3R2me2aおよびH3R8me2aレベルを有し、外因性PRMT6活性をモニタリングするために好ましい

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

HSP70-Rme1メチル化レベルは合計HSP70に正規化

PRMT7ノックアウトまたはノックダウンはHSP70モノメチル化を減らした(図6A)。PRMT7選択的化学プローブSGC3027による2日間の処理は、用量依存的にPRMT7依存性HSP70モノメチル化を低下させた(図6B)。

C2C12, HT180 いくつかの癌細胞株は、メチル化シグナルが核起源の非特異的タンパク質と重なるHSP70の誘導可能な形態を発現する(図6C)。この場合、細胞質画分でHSP70メチル化レベルを分析することをお勧めします。

12

PRMT8

EWS-Rme2a

外因性FLAGタグ付きPRMT8 WTまたはE185Q触媒変異体(バックグラウンド)によって引き起こされる外因性GFPタグEWSメチル化レベル(バックグラウンド)は、PRMT1 KO細胞における総GFPシグナルに正規化された。

野生型PRMT8の過剰発現は、PRMT1 KD細胞のみで触媒E185Q変異体メチル化異所EWSを触媒しない(図7A)。PRMT I型化学プローブMS023は、PRMT8による外因性EWSの不斉ジメチル化を阻害した(図8B)。

ヘク293T PRMT1 KD (誘導可能)。 PRMT1ノックダウンは細胞死をもたらすので、誘導可能なシステムを使用することをお勧めします。

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

R145 に正規化された R508 における PRMT9 依存 SAP145 対称ジメチル化

損失PRMT9が、PRMT5ではない場合、SAP145の対称ジメチル化が減少します。GFP タグ付き SAP145 WT が、SAP145mut (R508K) ではなく、PRMT9 (図 8A) によってメチル化されました。コパウンドX、試作PRMT9阻害剤による2日間の治療は、用量依存的に用量依存的にSAP145-R508me2sレベルを低下させた図8B)。

任意のセルライン

21

表 4.PRMTアッセイの概要。

ディスカッション

ここでは、PRMTファミリーのメンバーに対する詳細な細胞アッセイプロトコルについて、蛍光ウェスタンブロッティング法を用いることが記載されている。アルギニンメチル化の変化が個々のPRMT損失または触媒阻害時に容易に検出され、他の家族によって補償することができないユニークな基質が選択された。一部のタンパク質は、複数のPRMT21,23によってメチル化されており^、所与のPRMTが所定のタンパク質基質^{24、25、26、27}に少量の細胞マークのみを寄与する基質特異性における重複を示唆する。したがって、各アッセイでは、ノックダウンおよび/または過剰発現実験を用いた基質および抗体の徹底的な検証と、十分に特徴付けられた選択的阻害剤を用いたさらなる検証が必要でした。PRMT特異的な基質は、間接的にメチルアルギニンマークレベルに影響を与える可能性のある細胞生存率および増殖の複合効果を避けるために、PRMT後2〜3日以内にメチル化マークの変化を検出できることを同定した。PRMT1、4、5、7、9用のユニークな基板を見つけることは可能でしたが、。PRMT3、6、および8では、機能アプローチの利得を採用する必要がありました。いくつかのアルギニンメチル特異的抗体は、様々な細胞標的についてテストされました, しかし、どれもPRMT3とPRMT6ノックダウンの3日以内に有意な変化を検出できませんでした;したがって、バイオマーカーアッセイは、触媒的に不活性な変異体と共に異所性発現酵素を用いて開発され、基線基質メチル化の制御として役立った。PRMT8は近いPRMT1ホモログであり、同様の基質の好みを共有する。PRMT8選択的バイオマーカーを同定できなかったため、PRMT1ノックダウン細胞のアッセイが開発され、そこでPRMT8がEWSと共に発現した。PRMT1はH4R3不斉メチル化を担う主要な酵素でも、従って、H4R3me2aをPRMT3およびPRMT6細胞アッセイのバイオマーカーとして使用し、基底H4R3me2aレベルの低い細胞を選択し、触媒的に不活性な変異体をバックグラウンドコントロールとして使用した。内因性アッセイが好ましいが、外因性アッセイは、いくつかの選択的PRMT阻害剤^7、8、9の細胞力を試験する上で非常に貴重である。PRMT生物学に関する知識の増大に伴い、PRMT3、PRMT6、PRMT8に対してより特異的なバイオマーカータンパク質を見つけることでアッセイを改善することが期待されます。

PRMTアッセイの性能には、検証済みの抗体および適切な制御が重要です。ここで推奨されるすべての抗体は、ノックダウンと過剰発現実験によって徹底的に検証されていますが、バッチ間の違い(特にポリクローナル抗体の場合)は、依然としてその性能に影響を与える可能性があります。したがって、アッセイの信頼性を確認するために、遺伝的方法と化学プローブを密接に関連する陰性制御と組み合わせて使用することが重要です。さらに、タンパク質過剰発現を必要とするPRMTアッセイでは、触媒的に不活性な変異体を野生型タンパク質と共に使用して基底メチル化レベルを決定することが重要です。

細胞内のPRMTの活性をプロファイリングするための定量アッセイのこのコレクションは、基本的な細胞培養および蛍光ウェスタンブロッティング技術のみを含む最小限の装置と限られた技術的専門知識で迅速かつ容易に実施することができるので、科学界にとって広く有用であり得る。PRMTに推奨される抗体および化学プローブは、特定のABPPプローブの適合性を確立し、標的関与を監視し、競合するABPP形式を使用してオフターゲット効果を評価するために、活性ベースのタンパク質プロファイリング(ABPP)アッセイにも利用できます。ここで説明するアッセイ開発アプローチは、タンパク質リジンメチルトランスフェリン酵素やアセチルトランスビセナーゼなどの他の酵素ファミリーに対しても外挿することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm TC皿	Greiner bio-one	664160
24-well TCプレート	Greiner bio-one	662160
4–12% ビストリスタンパク質ゲル	サーモフィッシャー Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
アマシャム ハイボンド P PVDF 膜	ミリポアシグマ	10600021
抗アシム 24	ミリポアシグマ	07-414
抗アシム 25	ミリポアシグマ	09-814
アンチ B-アクチン	サンタクルーズバイオテクノロジー	sc-47778
反BAF155	Santa Cruz Biotechnologies	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
反H3R8me2a	ロックランド	600-401-I67
反H4	アブカム	ab174628
反H4R3me2a	アクティブモチーフ	39705
反HSP / Hsc70	エンツォ	ADI-SPA-820
反PRMT1	ポアシグマ	07-404
反PRMT3	アブ	カム ab191562
反PRMT4	ベチル	#A300-421A
、反PRMT5	アブカム	ab109451
反PRMT6	アブカム	ab47244、
反PRMT7	アブカム	ab179822
反Rme1	CST	8015
反Rme2a	CST	13522
反Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of
Hope anti-SmBB	サンタクルーズ	バイオテクノロジーsc-130670
ベンゾナーゼ			は
、ステファンリチャード博士、マギル大学
		319-005-CL
DMSO	Bioshop	DMS666.100
ロバ抗マウス IgG-IR680	Licor	926-68072
ドキシサイクリン	ミリポアシグマ	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
グリシン	Bioshop	GLN002.5
ヤギ抗ウサギ IgG-IR800	Licor	926-32211
HEK293T			ヨーク大学
Image Studio Software ver 5.2	Licor
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC®HTB-22&トレード;
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
Odyssey ブロッキングバッファー (PBST で 4 倍に希釈)	Licor	927-40000	インターセプト (PBS) ブロッキングバッファーも使用できます # 927-70001
Odyssey CLX イメージングシステム	Licor	モデル番号 9140
PBS (組織培養)	Wisent	311-010-CL
PBS(ウェスタンブロット)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™BCAの蛋白質の試金のキット	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
脱脂粉乳	Bioshop	SKI400.500
TC20 自動化された細胞カウンターBiorad		1450102
Tripsin-EDTA(0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
トリットンX-100	バイオショップ	TRX506
トリパン	ブルーGIBCO	15250-061
イーン-20	バイオショップ	TWN510.500