腸上皮は、栄養素の吸収だけでなく、有害物質に対する保護も与えます。頂端 - 最上皮細胞間接合部、すなわちタイトジャンクションは、傍細胞溶質およびイオン透過性を調節する。ここでは、粘膜シートの調製およびUssingチャンバー技術を用いたタイトジャンクションのイオン選択性の評価のためのプロトコルが記載されている。
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この記事について
サマリー
要約
ウッシングチャンバー技術は、カエルの皮膚を横切るナトリウムの細胞間輸送を研究するために、1951年にデンマークの科学者Hans Ussingによって最初に発明されました。それ以来、この技術は、膜を横切る輸送の生理学的パラメータを研究するために、多くの異なる組織に適用されてきた。Ussingチャンバー法は、天然組織を使用できるため、他の方法よりも好ましく、 生体内で起こっていることにより適用可能である。しかし、天然組織が使用されるため、スループットが低く、時間が限られ、組織調製にはスキルとトレーニングが必要です。これらのチャンバーは、様々な組織における特定のトランスポータータンパク質の研究、嚢胞性線維症などの疾患病態生理学の理解、薬物輸送および取り込みの研究、および腸内の栄養輸送の理解に特に貢献するために使用されてきた。組織の上皮輸送プロセス全体を考えると、経上皮経路だけでなく、傍細胞経路も重要である。タイトジャンクションは、腸を横切る組織特異的な傍細胞透過性の重要な決定因子である。この記事では、Ussingチャンバー技術を使用して、経上皮コンダクタンスと希釈電位を測定することによってイオンの傍細胞透過性を評価します。
概要
ウッシングチャンバー法は、デンマークの科学者ハンス・ウッシングによって最初に開発されました。Ussingは、NaClが急峻な濃度勾配に対して皮膚を横切って輸送できることが観察された後、カエルの皮膚を横切るナトリウム輸送の短絡電流を測定するために最初にそれを使用した1。彼のシステムは、皮膚の両側にアクセスできる2つの部屋の間に取り付けられたカエルの皮膚で構成されていました。各チャンバーにはリンゲルの溶液が含まれており、それらは循環され、曝気された。皮膚の近くに位置し、飽和KCl-カロメル電極に接続された2つの狭い寒天リンガーブリッジは、ポテンショネータによって読み取られた電位差を測定した。第2の対の寒天リンガーブリッジは、AgClで飽和した飽和KClを有するビーカーに接続された各チャンバの反対側の端に位置し、電池によって提供される起電力を印加した。電位分配器を使用して電圧を調整し、皮膚両端の電位差がゼロのままになるようにし、短絡状態を作り出しました。マイクロアンペアメーターも接続され、皮膚を通過する電流を読み取ることができました(元のチャンバー設計については、参考文献1 の図を参照)。
過去70年以上にわたり、この技術は、栄養素およびイオン輸送を研究するために、多くの異なる組織、特に腸組織に適用されてきた。例えば、これらのチャンバーにウサギ回腸を装着することにより、コレラ誘発性下痢の....
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プロトコル
これらの実験に使用した動物はすべて静岡大学の動物飼育施設で飼育し、静岡大学の動物実験ガイドラインに従って実験を行った。すべての実験は、静岡県立大学動物愛護利用委員会の承認を得て実施した(許可書#205272、#656-2303)。
1. NaCl電極の作製
注:これらの実験で使用された電極は、濃縮NaClまたはKClからなる。KCl/カロメル電極は市販品として購入されます。実験を開始する前に、すべての電極が濃縮NaClまたはKCl溶液で上部に充填されていることを確認してください。
- プラスチック製の蓋(容量20mL)で小さなガラス瓶を準備します。
- プラスチック製の蓋に 2 つの穴を開け、1 つは NaCl 塩橋 (直径 2.5 mm)、もう 1 つは銀線 (直径 1 mm; 図1C、NaCl電極)。
- ガラス瓶に飽和NaCl溶液(約15mL、満杯になるまで)を充填する。
- 銀線(直径0.8mm、長さ7cm)を瓶に差し込みますが、瓶の外側の線部分がアリゲータークリップ(小型)を介してアンプシステムに接続できることを確認してください。
- 使用しないときは、電極を包み込み、乾燥を防ぐためにパラフィルムで穴が覆われていることを確認してください。
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結果
このホワイト ペーパーで示されている結果は、完了した大規模なプロジェクトの一部であった結果です (ref.4,23,24 を参照)。
小腸の経上皮電気コンダクタンスはCldn15-/-マウスにおいて減少する。
Cldn15-/-マウスの中央小腸セグメントのベースライン経粘膜コンダクタンス(短絡条件下で)は、野生型マウスで測定されたものよりも低かった(図3A;Cldn15-/-および野生型マウスでそれぞれ22.3mS/cm2および48.7mS/cm2<.......
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ディスカッション
この実験では、Ussingチャンバーを使用して、Cldn15−/−およびWTマウスの小腸におけるNaClのベースライン電気パラメータおよび希釈電位を測定した。Ussingチャンバー実験を行う際には、実験で使用した膜調製物が実行可能であることを確認することが非常に重要です。これは通常、グルコースまたはアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリンを添加し、Isc(マウスでは100-300μA/cm2)に適切な上昇があるかどうかを調べることによって行われる。腸管製剤が使用に許容可能であったかどうかを評価する別の方法は、組織のコンダクタンスを見ることである。損傷した組織は、通常コンダクタンスよりも高い場合が多く(正常コンダクタンス:マウスでは~20~60mS/cm2)、筋肉層が適切に剥離されていない組織は、通常よりも低いコンダクタンスを持つ傾向があります(図2)。すべてのUssingチャンバープロトコルで最も重要なステップは、組織の準備であり、それに損傷がないことを.......
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開示事項
著者らは、開示すべき潜在的な利益相反はない。
謝辞
この作業は、17K00860 (HH 宛) および 19K20152 (NI 宛) でサポートされています。WHは、2018年から2021年までの大塚俊美奨学財団の財政的支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #3 ポリエチレンチューブ | 響 | 外径1.0mm、内径0.5mm | |
| #7 ポリエチレンチューブ | 響 | 外径2.3mm、内径1.3mm | |
| 10mL ロッキングシリンジ | テルモ | SS-10LZ | 充填時に針が抜けるのを防ぐため、ロッキングシリンジが必要 |
| 19g針 | テルモ | NN-1938R | 針を取り扱う際は注意を払い、鋭利物容器に廃棄 |
| 23g針 | テルモ | NN-2332R | 針を取り扱う際は注意して鋭利物容器に廃棄 |
| 5mmパンチ | NA | NA | 濾紙やパラフィルムの鍼に穴を開けるために使用 |
| セイリン | NS | 組織を解剖板にピンで留める解剖ピンとして使用 | |
| 寒天 | 富士フイルム 和光 | 010-15815 | |
| ワニ口クリップ | NA | NA 電極を増幅器に接続します | |
| CaCl2 | 富士フイルム和光 | 038-00445 | |
| D(-)-マンニトール | 富士フイルム和光 | 133-00845 | 希釈 HEPES バッファー |
| D(+)-グルコース | 富士フイルム 和光 | 049-31165 | |
| 解剖キット | 必要になる、はさみや湾曲した鉗子 | ||
| 解剖プレート | 10cmの細胞培養プレートを使用し、シリコンゴムで覆いました | ||
| DMSO Sigma | 472301-500ML | フォルスコリンストックを作るため | |
| 電気レコーダー | 東亜電子工業 | PRR-5041 | その他同等の電気レコーダーが市販されています |
| 上皮電圧クランプアンプ | 日本光電 | CEZ9100 | 他の同等のアンプは |
| 、商業的に濾紙が利用可能で、正方形にカット | NA | NA | 5mmパンチでパンチされ、腸の準備 |
| の細かい鉗子 | ファストジーン | FG-B50476 | 筋肉層の鈍的解剖用 |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | DMSOで10 mMのストックを作成し、最終濃度は10 & microになります。M |
| HEPES Σ | H4034-1KG | ||
| インドメタシン | Σ | I7338-5G | 21 mM NaHCO3 で 1 mM ストックを作成し、最終濃度は 10 & マイクロです。M |
| K2HPO4 | 富士フイルム 和光 | 164-04295 | |
| KCl | 富士フイルム 和光 | 163-03545 | |
| KCl/calomel 電極 | アッシュジャパン株式会社 | SCE-100 | |
| KH2PO4 | 関東化学 | 32379-00 | |
| L(+)-グルタミン | 富士フイルム和光 | 074-00522 | |
| MgCl2 | 富士フイルム和光 | 135-00165 | |
| 混合ガス(95% O2/5% CO2) | 静岡酸素カンパニー | リンガー溶液NaCl使用時のリンガー液・チャンバーのバブリングに使用 | |
| 富士フイルム 和光 | 191-01665 | ||
| NaCl電極 | NA | NaHCO | |
| 3 | 富士フイルム ワコー | 191-01305 | |
| O2 ガス | 静岡酸素株式会社 | HEPES緩衝液パラフィルムを使用する場合、バブリングチャンバーに使用されます | |
| Bemis | PM-996 | Ussingチャンバーのシールに使用 | |
| pHメーター | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES緩衝液は、37°CでpH 7.4に調整する必要があります。C |
| pH メーター電極 | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| シリコーンゴム | 信越化学 | KE-12 | 解剖板の充填に使用 |
| 銀線 | NaCl電極の製造に使用 | ||
| プラスチック蓋付き | NA | NA | NaCl電極の |
| 実体顕微鏡 | Zeiss | Stemi 305 | 実体顕微鏡では奥行きを見ることができるので、組織をより簡単に解剖することができます |
| トリス(Trizmaベース) | シグマ | T1503-1KG | HEPES緩衝液のpHを調整するための1M溶液を作る |
| Ussing チャンバー 三 | 機化学工業 | これらのチャンバーは、カスタムメイドの連続灌流 窓径5mmのUssingチャンバーです | |
| ウォーターポンプと暖房システム | 東京六垣会株式会社。 | NTT-110(エヌティー110 |
参考文献
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M.
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