ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。
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この記事について
サマリー
要約
巨核球の分化および成熟は、骨髄の細胞および細胞外成分と密接に関連して起こる。これらのプロセスは、多倍体および多球状核などの巨核球細胞質の必須構造の徐々に出現することを特徴とし、境界膜系(DMS)と呼ばれる内部膜ネットワークおよび循環血小板に見られる緻密およびアルファ顆粒である。本稿では、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)を用いたマウス巨核球のin situ 超構造研究における標準化プロトコルについて述べ、骨髄における成熟段階および細胞密度を定義する主要な特性を同定することを可能にする。骨髄は、フラッシュ、固定、エタノール中の脱水、プラスチック樹脂に埋め込まれ、そして、断面を生成するために取り付けられる。半薄いセクションと薄いセクションは、それぞれ組織学的およびTEMの観察のために準備されています。この方法は、任意のEM施設で、任意の骨髄細胞に使用することができ、同じマウス上のいくつかのイメージングアプローチの組み合わせを可能にする小さなサンプルサイズを使用する利点を有する。
概要
巨核球は、骨髄に局在する大型多倍数細胞を専門とし、血小板産生を担う1.それらは複雑な成熟プロセスを通して造血幹細胞に由来し、その間に巨核球前駆体は徐々にサイズが増加し、細胞質および核2の広範な付随的形態変化を受ける。成熟の間、巨核球は、多球状核、境界膜系(DMS)を形成する表面膜の内在、アクチン系細胞骨格網に囲まれた小器官の末梢領域、およびα-顆粒、高密度顆粒、リゾソーム、リゾソーム、および多重体を含む多数の顕著な構造要素を開発する。超構造レベルでは、観察される大きな変化は、DMS3で区切られた離散領域への細胞質区画化である。膜のこの広範な供給は、血小板生産の初期段階で長い細胞質プロセスの延長を促進し、その後、循環内の血小板に改造します。巨核球分化および成熟時の欠陥は、血小板数および/または血小板機能の用語で血小板産生に影響を与える可能性があります。
薄層透過型電子顕微鏡(TEM)は、血栓形成4,5の生理学の理解を形作った巨核球の高品質な超構造を提供する何十年もの間、選択のイメージングアプローチであった。本論文は、骨髄細胞の種類を分析する基礎となる可能性のある、天然骨髄微小環境内で起こる血小板生物新....
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プロトコル
すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。プロトコルは図 1に概略的に示されています。
1. 骨髄の収集と固定 (図 1A)
注意:この手順は、発がん性、変異原性、および/または毒性物質を含み、化学的抽出フードの下で行われます。手袋や保護メガネなどの適切な保護具を着用してください。
- カコジレートバッファー内の 2.5% グルタルアルデヒドからなる固定溶液を準備します ( 補足ファイルを参照してください)。
- 骨髄コレクション
- 成人C57BL/6マウスのいずれかの性別12-18週齢を使用してください。CO2窒息と子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。
- 薄いはさみで、太ももの周りの皮膚を切り、ピンセットを使用して皮膚を剥がします。足の四肢を取り除き、股関節と太ももの間を切ります。膝の関節で切断することによって大腿骨から脛骨を取り外し、メスを使用して脛骨および大腿骨の付着組織....
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結果
骨髄の神学
軽顕微鏡下での骨髄トルイジンブルー組織学の観察は、例えば組織のコンパクトさ、微小血管の連続性、および巨核球の大きさと形状の点で組織体系全体を迅速に分析する鍵である(図1D)。それは、骨髄ブロック内の深い切断の必要性を決定するために、超薄いセクションの前に行われます。巨大な大きさと核の凝縮のために、より成熟した巨核球は40倍の目的で容易に視覚化されるかもしれない。これは、組織中の成熟した巨核球の密度とマイクロ血管への相対的な局在の優れた、迅速な概要を提供します。このような半薄い部分では、巨核球増殖と成熟の異常はすでに検出できた。
骨髄超構造
特徴的な超構造特性に基づいて、マウス巨核球は、熟成における順次段階を表す4段階に分けられる(図2A)。ステージI巨核球は、大きな核が細胞の大部分を占め、豊富なリボソームと.......
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ディスカッション
巨核代の直接検査は、巨核球の形成や血小板形成を理解するために不可欠です。本稿では、骨髄紅潮と浸漬による固定を組み合わせた透過電子顕微鏡法を提供し、骨髄中で起こっている巨核球形態形成の全過程の形態特性を その場で 解剖することを可能にする。
骨髄の洗い流しは、高品質のフラッシングの成功はオペレータの練習とトレーニングに依存するので、この方法の重要なステップです。繊細ではあるが、骨髄を洗い流すは、通常、巨核球形態に重要なアーチファクトに関連する完全な脱灰のための2週間のEDTA治療を必要とする、ミネラル化された骨の除去を避けるための最良の方法である。さらに、脛骨および大腿骨から固定されていない骨髄全体を採取する主な利点は、同じマウスに対していくつかのイメージングアプローチを組み合わせる能力である。実際には、単一の骨髄のみが、超構造研究のために必要とされ、他の3つの標本は相補的な分析のために利用できる。第2骨髄は、次に、新鮮な骨髄の外植物の調製に使用することができ、天然巨核球6のプロ血小板形成のダイナミクスをリアルタイムで.......
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開示事項
著者は宣言する利益相反はありません。
謝辞
著者らは、ファビエンヌ・プロアマー、ジャン=イヴ・リンケル、デビッド・ホフマン、モニーク・フロイントに技術支援を感謝したいと考えている。この研究は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)、欧州地域開発基金(ERDF)を通じた欧州連合(EU)、グラントANR-17-CE14-0001-01からH.d.S.に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-トリ(ジメチルアミノメチル)フェノール (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| ジメチルアルシン酸ナトリウム塩三水和物 | メルク、ドイツ | 8.20670.0250 | |
| ドデセニル無水コハク酸 (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| ダブルエッジ ステンレスカミソリ刃 | 電子顕微鏡科学-EMS, 米国 EM-72000 | ||
| エタノール絶対 | VWR International, France | 20821296 | |
| フィルター紙、直径90 mm | Whatman、イングランド | 512-0326 | |
| フラット埋め込みシリコーン型 | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| グルタルアルデヒド 25% | 電子顕微鏡 Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| ヒートプレート Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | 珪藻、スイス | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM 顕微鏡 | EM-21001BU | ||
| クエン酸鉛 - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 樹脂 | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 塩化マグネシウム六水和物 | Sigma, France | M2393-100g | |
| 封入剤 - ポリ(メタクリレートブチル-コメチルメタクリレート) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| 四酸化オスミウム 2% | Merck, ドイツ | 19172 | |
| プロピレンオキシド (1.2-エポキシプロパン) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| 生理食塩水注射液0.9% NaCl | CDM Lavoisier、フランス | MA 575 420 6 | |
| メス外科用鋼刃 | スワン・モートン、 | England.0508 | |
| 四ホウ酸ナトリウム - ホウ砂 | シグマ、フランス | B-9876 | |
| ショ糖 | メルク、ドイツ | 84100-1KG | |
| シリンジ フィルター 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
参考文献
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C.
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