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方法論記事

イン・シトゥ 透過電子顕微鏡を用いたネズミ巨核生物の探索

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DOI:

10.3791/62494

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2021年9月8日

 ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

この記事について

サマリー

ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。

要約

巨核球の分化および成熟は、骨髄の細胞および細胞外成分と密接に関連して起こる。これらのプロセスは、多倍体および多球状核などの巨核球細胞質の必須構造の徐々に出現することを特徴とし、境界膜系(DMS)と呼ばれる内部膜ネットワークおよび循環血小板に見られる緻密およびアルファ顆粒である。本稿では、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)を用いたマウス巨核球のin situ 超構造研究における標準化プロトコルについて述べ、骨髄における成熟段階および細胞密度を定義する主要な特性を同定することを可能にする。骨髄は、フラッシュ、固定、エタノール中の脱水、プラスチック樹脂に埋め込まれ、そして、断面を生成するために取り付けられる。半薄いセクションと薄いセクションは、それぞれ組織学的およびTEMの観察のために準備されています。この方法は、任意のEM施設で、任意の骨髄細胞に使用することができ、同じマウス上のいくつかのイメージングアプローチの組み合わせを可能にする小さなサンプルサイズを使用する利点を有する。

概要

巨核球は、骨髄に局在する大型多倍数細胞を専門とし、血小板産生を担う1.それらは複雑な成熟プロセスを通して造血幹細胞に由来し、その間に巨核球前駆体は徐々にサイズが増加し、細胞質および核2の広範な付随的形態変化を受ける。成熟の間、巨核球は、多球状核、境界膜系(DMS)を形成する表面膜の内在、アクチン系細胞骨格網に囲まれた小器官の末梢領域、およびα-顆粒、高密度顆粒、リゾソーム、リゾソーム、および多重体を含む多数の顕著な構造要素を開発する。超構造レベルでは、観察される大きな変化は、DMS3で区切られた離散領域への細胞質区画化である。膜のこの広範な供給は、血小板生産の初期段階で長い細胞質プロセスの延長を促進し、その後、循環内の血小板に改造します。巨核球分化および成熟時の欠陥は、血小板数および/または血小板機能の用語で血小板産生に影響を与える可能性があります。

薄層透過型電子顕微鏡(TEM)は、血栓形成4,5の生理学の理解を形作った巨核球の高品質な超構造を提供する何十年もの間、選択のイメージングアプローチであった。本論文は、骨髄細胞の種類を分析する基礎となる可能性のある、天然骨髄微小環境内で起こる血小板生物新生の過程を捉えることができる標準化されたTEM法に焦点を当てる。我々は、細胞質プロセスをサイヌソード6の微小循環に拡張する未熟から完全に成熟までの巨核球の開発の超構造的な例を提供する。また、骨髄の再生能力と血小板生産能力を説明する、異なる巨核球成熟段階を定量化する簡単な手順についても説明する。

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プロトコル

すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。プロトコルは図 1に概略的に示されています。

1. 骨髄の収集と固定 (図 1A)

注意:この手順は、発がん性、変異原性、および/または毒性物質を含み、化学的抽出フードの下で行われます。手袋や保護メガネなどの適切な保護具を着用してください。

  1. カコジレートバッファー内の 2.5% グルタルアルデヒドからなる固定溶液を準備します ( 補足ファイルを参照してください)。
  2. 骨髄コレクション
    1. 成人C57BL/6マウスのいずれかの性別12-18週齢を使用してください。CO2窒息と子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。
    2. 薄いはさみで、太ももの周りの皮膚を切り、ピンセットを使用して皮膚を剥がします。足の四肢を取り除き、股関節と太ももの間を切ります。膝の関節で切断することによって大腿骨から脛骨を取り外し、メスを使用して脛骨および大腿骨の付着組織を除去する。
    3. 鋭いカミソリの刃で骨端を取り除きます。大腿骨をピンセットで保持しながら、21G針のカコジレートバッファーで満たされた5mLシリンジを使用して、骨髄を2mLカコダイレートバッファーで満たされた15 mLチューブに洗い流します。これを行うには、骨髄開口部に針のベベルを挿入し、骨髄が排出されるまでプランジャーをゆっくりと押します。
  3. 固定液への急速な浸漬による骨髄固定。
    1. フラッシュの直後に、プラスチックピペットを使用して、骨髄シリンダーを新鮮なグルタルアルデヒド固定液(以前は1.1で調製)の1 mLに室温で60分間移動します。
      注:組織を保存するには、骨解剖から固定ステップまでのプロセス全体が10分以内に完了していることを確認してください。固定のために、固定液が熱ショックを避けるために室温であることを確認してください。

2. アガロースに骨髄を埋め込む

注:骨髄組織は、異なる洗浄ステップの間にその完全性を維持するために十分に凝集していないし、材料は容易に失われる可能性があります。この問題を克服するために、骨髄は脱水前に寒天のゲルで覆われています。

  1. 補助ファイルに記載されているアガロース溶液を準備します。
  2. カコジレートバッファーでセクション1.3から固定骨髄を洗浄し、プラスチックピペットを使用してガラススライドに慎重に転送します。暖かいピペットを使用して、すぐに骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を適用します。
    注: 寒天は冷却中にすばやく固めます。骨髄の均質な覆いを確実にするために、寒天溶液はスライドに堆積するまで暖かく保たれる必要があります。
  3. 寒天が固まるまで、スライドを素早く氷の上に置きます(1-2分)。
  4. 顕微鏡下では、これらの領域で組織圧縮が可能なため、鋭利なカミソリの刃を使用して骨髄シリンダーの四肢を切断し、廃棄します。カコジレートバッファーの 1 mL を含む 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブ内の骨髄ブロックを移動します。

3. 樹脂に骨髄を埋め込む

注意:樹脂成分は有毒です。いくつかは発がん性があり、化学抽出フードの下で注意して処理する必要があります。手袋や保護眼鏡などの適切な保護具を使用してください。四酸化オスミウムは室温で揮発性が高く、蒸気は目、鼻、喉に非常に有害です。廃棄される前に、2%オスミウム四酸化は、植物油の2倍の量を加えることによって中和されなければならない。

  1. 補足ファイルに記載されているエポキシ樹脂を準備します。
  2. 樹脂埋め込み
    注:オスミウム、酢酸ウラニル、エタノールの連続した浴中のインキュベーション中に同じマイクロ遠心分離管にサンプルを保管してください。パスツールピペットで上清を吸引します。各浴槽に使用される溶液の容積は、サンプルの少なくとも10倍の体積と等しくなければならない。
    1. 4°Cで1時間カコジレート緩衝液に1%オスミウムを入れたブロックを後固定し、カコジレート緩衝液で1回洗浄し、次に蒸留水で1回洗浄します。
    2. 4%の酢酸ウラニルを蒸留水に1時間染色し、蒸留水で2回洗浄する。
    3. 蒸留水中の一連のエタノールを脱水する:75%エタノール中に5分間4回、95%エタノールで20分間3回、20分間100%エタノールで3回乾燥する。このステップでは、エポキシ樹脂の注射器を冷凍庫から取り出します。
      注:プロトコルは100%エタノールで1時間一時停止することができます。
    4. 骨髄内部のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、まず15分間のプロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックをインキュベートする。
    5. 100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1:1混合物を加え、1時間インキュベートします。サンプルを室温でゆっくりとした回転式シェーカーに置きます。
    6. 100%エポキシ樹脂を加えて、攪拌下で一晩インキュベーションのためにサンプルを残します。
    7. 100%エポキシ樹脂を2時間インキュベーションに加え、撹拌下に置いてください。
    8. 顕微鏡下で、骨髄ブロックを平らなシリコーン型に入れます。骨髄全体のその後の横断的な断面を可能にするサンプルを配向する。金型にエポキシ樹脂を充填し、60°Cで48時間置きます。
      注:すべての溶液(エタノールおよびプロピレンオキシドを除く)は、0.22 μmのフィルターを通して濾過され、サンプル汚染を回避します。樹脂の適切な重合を確保するために、金型を充填しながら気泡を避けてください。

4. 超薄切除 (図1B)

注:トランスミッションEMは、電子が細胞の内部、構造、および内部小器官(顆粒、小胞体、ゴルジ)の配置の投影画像を生成し、細胞内細胞膜の配置を通過することができる薄い組織切片を必要とします。

  1. サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付ける。サンプルホルダーに置きます。回転ダイヤモンドまたはタングステンフライスカッターで組織の周りの樹脂の過剰を除去するために45°でサンプルをトリミングします。
  2. 水タンクを装備したダイヤモンドナイフブレードでウルトラミクロトームにサンプルを取り付けます。組織学的分析とTEM分析のために、500 nmと100 nmの厚さの横断断面をそれぞれカットします。ループで水面上の浮遊セクションを収集します。
  3. ガラススライドに厚さ500 nmのセクションを、下に紙フィルターを付けて200メッシュの薄い棒銅グリッドに100 nmの厚いセクションを堆積させます。1 つの条件に対して 5 つのグリッドを準備します: 最初に 2 つのグリッドを染色し、必要に応じて残りの 3 つのグリッドをバックアップとして保持します。

5. トールイジンブルー染色

注:組織学のためのセクションを染色することは、3つの理由で重要です:1)組織が実際に切断され、樹脂ではないことを確認するために、2)包含の品質を確認し、3)迅速に骨髄サンプルを評価します。これが正しくない場合は、ブロックの深いところで切り取ります。

  1. ヒートプレート(60°C)で半薄切片スライドを乾燥させます。
  2. 濾過1%トルイジンブルー/1%ホウ酸ナトリウムをスライド上の蒸留水に加え、ホットプレート(60°C)で1〜2分間加熱します。蒸留水でスライドを洗い、ヒートプレートで乾かします。
  3. Poly(ブチルメタクリレート-コメチルメタクリレート)実装媒体を滴下してカバースリップにセクションを取り付け、軽顕微鏡で検査します。

6. TEM観察用の重金属染色 (図1C)

注:コントラストのために、グリッドの上側はループを持つ各連続したバスの100 μLの滴で反転されます。使用前に、各溶液は0.22 μmのフィルタ処理を行います。濾紙のグリッド側にそっと接触して、各浴槽間の余分な液体を取り除きます。

  1. 4%のウラニル酢酸を蒸留水に5分間染色する。
  2. 蒸留水で3回5分間洗います。
  3. クエン酸鉛で3分間染色します。
  4. 蒸留水で3回5分間洗います。
  5. 下側のグリッドを濾紙に接触させて乾かします。
    注:重金属は二酸化炭素の存在下で反応します。沈殿物を最小限に抑えるには、コントラスト中の空気の変位を避け、話さない、環境を穏やかに保ち、エアコンをオフにします。

7. TEM (図 1E)

注:セクションはTEM顕微鏡で導入され、120 kVで調べらされます。

  1. まず、低倍率(<500x)でセクションを調べて、調製の一般的な側面(樹脂に穴があかないこと、セクション内の折り目/圧縮、染色による沈殿)を理解してください。
  2. 次に、より高い倍率(〜2000x)でセクションを調べ、成熟の段階を区別することができます。全体の横断的なセクションの成熟の各段階から手動で巨核球を数える(各段階を視覚的に識別する方法については、代表的な結果を参照してください)。
    注: グリッドの各正方形は、検査用の領域として定義されます(200 メッシュの銅格子では 16000 μm2 に相当します)。
  3. 巨核球の数を評価するには、セクションで覆われた四角形のみを定量化します。そのためには、範囲のスクリーニングに基づくモデルを使用します。断面の四肢から別の範囲に、次に別の範囲の正方形の最初の範囲を観察します。この手順を使用して、全体の骨髄横断の四角形を正方形で完全かつ体系的に画面化します。
  4. 各四角形について、ステージI、IIまたはIII巨核球の数をスコアします。
    注:顆粒、DMS組織、細胞質領域の大きさ、ポリロブレン核を分析するには、より高い倍率が必要です。

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結果

骨髄の神学
軽顕微鏡下での骨髄トルイジンブルー組織学の観察は、例えば組織のコンパクトさ、微小血管の連続性、および巨核球の大きさと形状の点で組織体系全体を迅速に分析する鍵である(図1D)。それは、骨髄ブロック内の深い切断の必要性を決定するために、超薄いセクションの前に行われます。巨大な大きさと核の凝縮のために、より成熟した巨核球は40倍の目的で容易に視覚化されるかもしれない。これは、組織中の成熟した巨核球の密度とマイクロ血管への相対的な局在の優れた、迅速な概要を提供します。このような半薄い部分では、巨核球増殖と成熟の異常はすでに検出できた。

骨髄超構造
特徴的な超構造特性に基づいて、マウス巨核球は、熟成における順次段階を表す4段階に分けられる(図2A)。ステージI巨核球は、大きな核が細胞の大部分を占め、豊富なリボソームと...

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ディスカッション

巨核代の直接検査は、巨核球の形成や血小板形成を理解するために不可欠です。本稿では、骨髄紅潮と浸漬による固定を組み合わせた透過電子顕微鏡法を提供し、骨髄中で起こっている巨核球形態形成の全過程の形態特性を その場で 解剖することを可能にする。

骨髄の洗い流しは、高品質のフラッシングの成功はオペレータの練習とトレーニングに依存するので、この方法の重要なステップです。繊細ではあるが、骨髄を洗い流すは、通常、巨核球形態に重要なアーチファクトに関連する完全な脱灰のための2週間のEDTA治療を必要とする、ミネラル化された骨の除去を避けるための最良の方法である。さらに、脛骨および大腿骨から固定されていない骨髄全体を採取する主な利点は、同じマウスに対していくつかのイメージングアプローチを組み合わせる能力である。実際には、単一の骨髄のみが、超構造研究のために必要とされ、他の3つの標本は相補的な分析のために利用できる。第2骨髄は、次に、新鮮な骨髄の外植物の調製に使用することができ、天然巨核球6のプロ血小板形成のダイナミクスをリアルタイムで...

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開示事項

著者は宣言する利益相反はありません。

謝辞

著者らは、ファビエンヌ・プロアマー、ジャン=イヴ・リンケル、デビッド・ホフマン、モニーク・フロイントに技術支援を感謝したいと考えている。この研究は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)、欧州地域開発基金(ERDF)を通じた欧州連合(EU)、グラントANR-17-CE14-0001-01からH.d.S.に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,4,6-トリ(ジメチルアミノメチル)フェノール (DMP-30)Ladd Research Industries, USA21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point AgarElectron Microscopy Sciences, USA1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrateMerck, Germany2083
Copper grids 200 mesh thin-barOxford Instrument, Agar Scientifics, EnglandT200-CU
ジメチルアルシン酸ナトリウム塩三水和物メルク、ドイツ8.20670.0250
ドデセニル無水コハク酸 (DDSA)Ladd Research Industries, USA21340
ダブルエッジ ステンレスカミソリ刃電子顕微鏡科学-EMS, 米国 EM-72000
エタノール絶対VWR International, France20821296
フィルター紙、直径90 mmWhatman、イングランド512-0326
フラット埋め込みシリコーン型Oxford Instrument, Agar Scientific, EnglandG3533
グルタルアルデヒド 25%電子顕微鏡 Sciences-EMS, USA16210
ヒートプレート Leica EMMPLeica Microsystems GmbH, Austria705402
Histo Diamond Knife 45°珪藻、スイス1044797
JEOL 2100 Plus TEM 顕微鏡EM-21001BU
クエン酸鉛 - Ultrostain 2Leica Microsystems GmbH, Austria70 55 30 22
LX-112 樹脂Ladd Research Industries, USA21310
MgCl2 塩化マグネシウム六水和物Sigma, FranceM2393-100g
封入剤 - ポリ(メタクリレートブチル-コメチルメタクリレート)Electron Microscopy Sciences-EMS, USA15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)Ladd Research Industries, USA21350
四酸化オスミウム 2%Merck, ドイツ19172
プロピレンオキシド (1.2-エポキシプロパン)Sigma, France82320-250ML
生理食塩水注射液0.9% NaClCDM Lavoisier、フランスMA 575 420 6
メス外科用鋼刃スワン・モートン、England.0508
四ホウ酸ナトリウム - ホウ砂シグマ、フランスB-9876
ショ糖メルク、ドイツ84100-1KG
シリンジ フィルター 0.2µmPall Corporation, USA514-4126
Toluidine blueLadd Research Industries, USAN10-70975
Trimmer EM TRIM2Leica Microsystems GmbH, Austria702801
Ultramicrotome Ultracut UCTLeica Microsystems GmbH, Austria656201
Uranyl acetateLadd Research Industries, USA23620
日本

参考文献

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