この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。
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この記事について
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サマリー
要約
骨髄巨核球は血小板の産生を保障する大きい多倍化細胞である。彼らは、造血幹細胞から巨核代を介して生じる。このプロセスの最終段階は複雑で古典的に二能性の巨核球-赤血球前駆細胞(MEP)と単一の巨大核球前駆細胞(MKp)を含む。これらの集団は、ボナフィデス巨核球の形成に先行し、そのように、その分離と特徴付けは、巨核球形成の堅牢で公平な分析を可能にする可能性がある。このプロトコルは、マウス骨髄から造血細胞を収集する手順、磁気枯渇を介した造血前駆物質の濃縮、そして最後に高度に精製されたMEPおよびMKp集団をもたらす細胞選別戦略を提示する。まず、骨髄細胞は大腿骨、脛骨、および腸骨紋から採取され、また、造血前駆腫の数が多い骨である。腸骨の骨の使用は、マウスごとに得られる総細胞数を大幅に増加させ、したがって、動物のより倫理的な使用に貢献する。450 nmの磁気ビーズを使用して磁気系統の枯渇を最適化し、フローサイトメトリーによる非常に効率的な細胞選別を可能にしました。最後に、このプロトコルは、MEP(Lin - Sca-1-c-Kit + CD16/32-CD150+CD9薄暗い)とMKp(Lin - Sca-1-c-kit + CD16/32 - CD150 + CD99)の選別のためのラベリングと格子戦略を提示します。).この技術は実装が容易で、i)分子特性評価を行うのに十分な細胞材料を提供し、そのアイデンティティと生物学のより深い知識、ii)インビトロ分化アッセイは、巨大核球の成熟のメカニズムのより良い理解を提供する、またはiii)彼らの微小環境との相互作用のインビトロモデルをより良く理解する。
概要
血小板は巨核球によって産生される。これらの大きな多倍細胞は骨髄に位置し、すべての血液細胞については造血幹細胞(HSC)1に由来する。骨髄における巨核球の産生の古典的な経路はHSCに由来し、それらの分化電位を徐々に制限する異なる前駆物質の生成を伴う2。巨核細胞性系統へのコミットメントに署名する最初の前駆子は、巨核球赤血球前駆細胞(MEP)であり、赤血球細胞と巨核球3、4、5の両方を産生することができる二能性前駆細胞である。その後、MEPは血小板を産生できる成熟した巨核球に分化する一能性前駆細胞/前駆体(MKp)を産生する。これらの前駆体の生成に関与するメカニズムは、巨大核球への分化および成熟と同様に複雑であり、部分的にしか理解されていない。また、分化ポテンシャルとこれらの細胞の本質的なコミットメントレベルの観点からMEP集団の不均一性は依然として不明である。これらのプロセスを解読するには、微細な分子および単一細胞解析のために、MEPおよびMKpの精製された集団を得る(またはアクセス権を持つ)必要があります。
いくつかの研究は、マウス6、7、8
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プロトコル
動物に関する議定書は、ストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コミテ・レジオナル・デ・エティック・アン・マティエール・ド・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って実施された。許可番号:E67-482-10)。
1. マウスの骨の収集
- 制度的ガイドラインに従って動物を犠牲にする。
注:この原稿に記載されたデータは、8〜12週齢のC57Bl/ 6マウスから得られた。得られた細胞の数、および引用された集団の頻度は、年齢およびマウス株によって異なる場合がある。 - 70%エタノールでボディをスプレーします。
- はさみを使用して、脊椎に垂直な皮膚の0.5〜1cmの切開を行い、全身の皮膚を引き裂きます。下半身から皮膚を引き下げ、皮膚を取り除きます。
- 動物を解剖パッドの上に置き、下に向けます。露出した背骨に沿って指を上から下にスライドさせて骨盤の骨を見つけます。腸骨の紋章を見つけるには、後肢(骨盤骨の前部の下方領域)の近くの腰部の小さな隆起を特定する。図1A,Bはマウス解剖学の概略表現を示す。
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結果
MEPおよびMKpとして同定された細胞の表現型分析は、フローサイトメトリーによって行った。細胞は、CD41aおよびCD42c、巨核球および血小板系統の古典的マーカーに対する蛍光共役抗体で標識した。両方のマーカーは、これらのマーカーがMEP集団の細胞の表面でまだ検出されていない間にMKp集団の細胞によって発現した(図4Ai,4Aii)。多倍数は巨核球の特徴です。分類された集団のDNA含有量も分析され、細胞がMEP集団に対して主に2Nであり、MKp細胞のごく一部が4Nであることを実証したが、これらの集団では高いプロイドが有意に検出されない(図4Aiii)。
分類された細胞集団の同一性を確認するために、巨核球系およびエリスロイド系統に対するそれらの分化能力を評価するために、いくつかの分化アッセイが行われた。まず、半固体クロノゲンアッセイを行い、巨核細胞性前駆体(CFU-MK)およびエリスロイド前駆体(BFU-E)を定量化した。CFU-M.......
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ディスカッション
本論文では、マウスMEPやMKpの抽出と精製が可能です。プロトコルの最適化における重要なパラメータは、ほとんどの分子および細胞ベースのアッセイと互換性のある十分な数の細胞を得ることだった。造血細胞抽出のためのマウス骨採取の一般的な実践は、通常、各マウスの大腿骨および脛骨の両方を収穫することにある。造血材料のもう一つの供給源である骨盤骨は、見落とされがちである。腸骨の紋章を収集しない理由は、マウス骨格の内部解剖学の知識が乏しく、ユーザーが大腿骨頭を横切ったり、または大腿骨の頭のすぐ上に切断して後肢を古典的に収集しているという事実です。また、脛骨や大腿骨の中央部に存在しないトラベキュラの存在により、骨髄細胞が腸骨骨から効率的に洗い流されないと考えられる場合が多い。このプロトコルでは、これら2つの懸念に対処し、骨盤骨を含む各後肢骨の適切な洗い流しを可能にする標準化された、信頼性の高い、時間効果の高い方法が提示される。特に、腸骨を使用するとマウスあたり105±7 x106 細胞が得られ、古典的な方法では通常42±5 x 106細胞が得られる 。この方法の大きな利点は、特定の数の標的細胞を得るために必要.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
謝辞
著者らは、モニーク・フロイント、キャサリン・ジーゼル、ケティの技術支援に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とグラントANR-17-CE14-0001-01によって Henri.de ラによって支えられました。サル。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 21ゲージ針 | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| 抗体 Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | 磁気破壊 |
| 抗体 B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | 磁気破壊 |
| 抗体 Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | 磁気Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| AntibodyTER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | 磁性破壊 |
| 抗体 CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | 磁性破壊 |
| 抗体 CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | セルソーティング |
| 抗体 CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | セルソーティング |
| 抗体 TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | セルソーティング |
| 抗体 CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | セルソーティング |
| 抗体 CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | セルソーティング |
| 抗体 CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | セルソーティング |
| 抗体 c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | セルソーティング |
| 抗体 Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell |
| sorting 抗体 CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| 解剖パッド | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| エタノール | vWR化学薬品 | 83813.360 | |
| 鉗子 | ユーロネクシア | P-120-AS | |
| ガラスパスツールピペット | ダッ | チャー42011 | |
| 磁石: DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| 磁気ビーズ: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysisソリューション | BD Bioscience | 555899 | |
| メス | フィッシャーサイエンティフィック | 12308009 | |
| ハサミ | Euronexia | C-165-ASB | |
| 滅菌済み 1 mL シリンジ | BD Bioscience | 303172 | |
| 滅菌済み 15mL チューブ | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 滅菌済み 5mL ポリプロピレンチューブ | ファルコン | 352063 | |
| 滅菌5mLポリスチレンチューブ | ファルコン | 352054 | |
| 70µの滅菌チューブ;m細胞ストレーナーキャップ | ファルコン | 352235 | |
| 滅菌ペトリ皿 | ファルコン | 353003 | |
| ストレプトアビジン-APC-Cy7 | BD バイオサイエンス | 554063 | 細胞選別 |
| チューブローラー | ベンチマークサイエンティフィック | R3005 |
参考文献
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
