真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

Summary

このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。

Abstract

生体試料由来の揮発性有機化合物(VOC)は起源不明です。VOCは、宿主または宿主の微生物群集内からの異なる生物に由来する可能性がある。微生物VOCの起源を解きほぐすために、 黄色ブドウ球菌、緑膿菌 、および アシネトバクター・バウマンニの細菌単培養および共培養物の揮発性ヘッドスペース分析、ならびに糞便、唾液、下水、および痰の生物学的サンプルにおける安定同位体プロービングが行われた。単一培養および共培養物を使用して、個々の細菌種からの揮発性産生を同定するか、または安定同位体プロービングと組み合わせて、生物学的サンプルからの微生物の活性代謝を同定した。

VOCsを抽出するために真空支援吸着剤抽出(VASE)が用いられた。VASEは、半揮発性および揮発性化合物用の使いやすく、商業化された無溶媒ヘッドスペース抽出法です。抽出時に使用される溶媒の不足および真空に近い条件により、 tert-ブチル化および固相マイクロ抽出などの他の抽出オプションと比較して、方法の開発が比較的容易かつ迅速に行われる。ここで説明するワークフローは、単一および共同カルチャからの特定の揮発性シグネチャを識別するために使用されました。さらに、ヒト関連生物試料の安定同位体プロービングの分析により、一般的または一意に産生されたVOCが同定された。本稿では、VASEの一般的なワークフローと実験的考察を、生きた微生物培養物の安定同位体プロービングと併せて提示する。

Introduction

揮発性有機化合物(VOC)は、すべての生物から放出され、異なる微生物が固有のVOCシグネチャを有するため、細菌の検出と同定に大きな期待を寄せています。揮発性分子は、嚢胞性線維症(CF)を有する被験者と健常対照者^5,6を区別することに加えて、慢性閉塞性肺疾患¹、尿中結核^2、人工呼吸器関連肺炎⁴を含む様々な呼吸器感染症を検出するための非侵襲的測定として利用されている。揮発性シグネチャは、CFにおける特定の病原体感染(黄色ブドウ球菌⁷、緑膿菌⁸、⁹、および黄色ブドウ球菌対緑膿菌¹⁰)を区別するためにも使用されている。 しかし、このような生物学的サンプルの複雑さにより、特定のVOCの発生源を特定することはしばしば困難である。

複数の感染微生物から揮発性プロファイルを解きほぐすための1つの戦略は、単一培養および共培養¹¹の両方において微生物のヘッドスペース分析を行うことである。ヘッドスペース分析は、サンプル自体に埋め込まれた分析物ではなく、サンプルの上の「ヘッドスペース」に放出される分析種を調べます。微生物代謝産物は、複雑な臨床サンプル中の微生物代謝産物の起源を決定することが困難であるため、単一培養においてしばしば特徴付けられてきた。細菌単一培養物から揮発性物質をプロファイリングすることにより、微生物が インビトロで 産生する揮発性物質の種類は、その揮発性レパトアのベースラインを表し得る。細菌培養物を組み合わせること、 例えば、共培養物を作成し、産生される揮発性分子をプロファイリングすることは、細菌¹²間の相互作用または交配を明らかにし得る。

揮発性分子の微生物起源を同定するための別の戦略は、安定同位体で標識された栄養源を提供することである。安定同位体は、中性子の数が異なる天然に存在する非放射性の原子です。動物¹³の活性代謝を追跡するために1930年代初頭から利用されてきた戦略では、微生物は標識された栄養源から摂食し、安定同位体を代謝経路に組み込んでいる。より最近では、重水(_D2O)の形態の安定同位体が、臨床CF喀痰試料¹⁴において代謝的に活性な黄色ブドウ球菌を同定するために使用されている。別の例では、^13C標識グルコースが、緑膿菌のCF臨床分離株とRothia mucilaginosaとの間の代謝産物の交差摂食を実証するために用いられている¹²。

質量分析技術の進歩に伴い、揮発性の手がかりを検出する方法は、定性的な観察からより定量的な測定に移行しました。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用することにより、生物学的サンプルの処理は、ほとんどの実験室または臨床現場で手の届くところにあります。揮発性分子を調査する多くの方法は、汚染を検出するために、食品、細菌培養物、およびその他の生物学的サンプル、および空気および水などのサンプルをプロファイルするために使用されてきた。しかし、ハイスループットで揮発性サンプリングを行ういくつかの一般的な方法は、溶媒を必要とし、真空抽出によって提供される利点では実行されません。さらに^{、分析には}、より大きな量または量(0.5mLを超える)のサンプリングされた材料がしばしば必要とされますが、これは基質固有^{であり、サンプル}タイプおよび方法ごとに最適化する必要があります。

ここでは、真空支援吸着剤抽出(VASE)とそれに続くGC-MSでの熱脱着を用いて、細菌の単一培養物および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した(図1)。限られたサンプル量で、VOCはわずか15μLの喀痰から抽出されました。ヒト試料を用いた同位体プロービング実験では、微生物群集の増殖を培養するために、^13Cグルコースなどの安定同位体源と培地を添加する必要があった。揮発分の活性産生は、GC−MSによってより重い分子として同定された。静的真空下での揮発性分子の抽出により、揮発性分子の検出が感度が向上しました^20,21,22。

Protocol

1. ヘッドスペース吸着ペン(HSP)とサンプル分析の考慮事項

注:吸着剤テナックスTAを含むHSPは、広範囲の揮発性物質を捕捉するために選択された。テナックスは、他の吸着剤と比較して水に対する親和性が低いため、水分の高いサンプルからより多くのVOCを捕捉することができます。テナックスはまた、不純物のレベルが低く、再利用のために調整することができます。吸着剤の選択もGC-MSに設置したカラムを考慮して行われました( 材料表参照)。

1. サンプル抽出に使用したのと同じ条件でメディアおよび/またはサンプルブランクを抽出することによって、ネガティブコントロールを生成します。
2. 抽出されたサンプルを分析する前に、GC-MS上のブランクHSP(以前にクリーンで有意なバックグラウンドがないことが以前に確認された)を分析します。サンプルタイプ間でブランクを実行します(例えば、細菌の単一培養の3回の反復、ブランク、細菌の共培養の3回の反復、ブランクなど)。
3. サンプルの抽出と分析の前に、香りのよいパーソナルケアアイテムの使用や臭いのする食品の消費を制限してください。理想的には、アルコールまたは他の揮発性クリーナーによって少なくとも30分間洗浄されていないバイオセーフティフードにサンプルを調製する。サンプル調製の前に、バイオセーフティフード内の空気の流れを30〜60分間オンにします。
4. サンプル調製中の揮発性放出を制限するために、サンプルを氷上に保管してください。

2. 単一および共培養の調製

1. バイオセーフティフード内で、 A. baumannii、黄色ブドウ球菌、 および 緑膿菌 の培養物をトッド・ヒューイット増殖培地に接種する。200rpmの攪拌で37°Cで一晩インキュベートする。
2. 一晩のインキュベーションの後、バイオセーフティフード内で培養ハンドリングを行う。各培養物を500nmで光学密度0.05に希釈する。
3. 共培養物を等分に混合し、200 μLのコントロール培地、モノ、または共培養を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで混合し、37°Cのインキュベーターに24時間置いた。48時間インキュベーション用の第2プレートを準備する。
4. インキュベーション期間の終わりに、セクション4で抽出用のサンプルを準備します。ピペット液体培養物を微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存した。
   注: この時点で、サンプルは -80 °C で保存して、必要に応じて後で抽出できます。

3. 生体試料調製における安定同位体プロービング

注:糞便および唾液サンプルは、カリフォルニア大学アーバイン治験審査委員会(HS#2017-3867)の承認を得て、匿名のドナーから寄付されました。下水はカリフォルニア州サンディエゴから来ました。喀痰サンプルは、ミシガン大学医学部治験審査委員会(HUM00037056)によって承認されたより大きな研究の一環として、嚢胞性線維症の被験者から収集された。

1. バイオセーフティフード内のすべての生物学的サンプル調製を行う。
   1. 糞便サンプルを調製するには、1.5mL微量遠心管内の100mgの糞便に1mLの脱イオン水を加え、3分間渦巻き込む。使用していないときは氷の上に置きます。
      1. 15 μL の糞便と水の混合物に、20 mM ¹³C グルコースを含む 485 μL のブレインハート注入 (BHI) 培地、または BHI と 30% 重水素 (D₂O) を加えます。サンプルの最終容量が 500 μL であることを確認します。サンプルを技術的な 3 連で準備します。
   2. 下水サンプルを調製するには、500 μL の下水を 20 mM 13 C グルコースを含む BHI 500 μL に、または ^BHIを 30% D₂O と共に 1 mL の総量で加えます。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。
   3. 唾液サンプルを調製するには、20 mM ¹³Cグルコースを含む500 μLのBHIに50 μLの唾液を加え、30%_{D2 Oを含むBHI}を350 μLの総容量で加えます。使用していないときは氷の上に置きます。
   4. 培養前後の試料中に存在する揮発分を比較するために喀痰試料を調製するには、15μLの喀痰で最初の抽出を行う。サンプルを3連で準備する。使用していないときは氷の上に置きます。試料抽出用のセクション4に進み、200rpmの攪拌で37°Cで18時間抽出する。
   5. 未培養の喀痰サンプルの最初の抽出の終了後、バイアルを喀痰と共に保存する。3.5.1からの痰でバイアルに20mM 13Cグルコースを含む500μLの ^BHIを加える。使用していないときは氷の上に置きます。
2. サンプル抽出のセクション 4 に進みます。

4. サンプル抽出

1. 空の揮発性有機分析(VOA)バイアル(20mL)をコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。
2. 5600吸着ペン抽出ユニット(SPEU)の電源を入れ、各方法の必要に応じて所望の温度に調整します。
   注:37°Cでの安定同位体プロービング実験の場合、設定値に達するには最大15分かかることがあります。70 °C での単一および共培養実験の場合、設定値に達するまでに最大 60 分かかることがあります。
3. メディアまたはサンプル コントロールの HSP を含め、準備されたサンプルの数に等しいクリーンな HSP を収集します。
4. 20 mL VOA バイアルを、必要に応じてサンプル、複製、および HSP ID に従ってラベル付けします。氷の上にいる間にバイアルの外側に結露が形成された場合に備えて、水に抵抗するマーカーを使用してください。
5. バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップのネジを外し、サンプルをバイアルに素早くピペッティングし、黒いキャップ、蓋ライナー、HSPを組み立てます。
   注:サンプルはHSPと接触してはならず、サンプル量はサンプルの種類によって異なります。
6. サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。
7. サンプルごとに手順 4.5 と 4.6 を繰り返します。これらの手順を一度にすべて実行するのではなく、サンプルごとに実行して、サンプルの温暖化を防ぎ、したがって、揮発性の早期放出を防ぎます。
8. すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、ベンチのバイオセーフティフードの外で次の手順を実行します。真空ポンプの電源を入れ、バイアルを30mmHgの真空下に置き、真空源を取り外します。
   注:バイアルは、真空の適用が完了した後、コールドトレイ上にある必要はありません。
9. 圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルに漏れがある場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく所定の位置にあることを確認してください。
   注:シールが損なわれると、真空下のバイアルと比較して揮発性検出が低下する可能性があります。
10. バイアルをSPEUに入れ、200rpmでの攪拌で時間と温度を最適化します。培養物を70°Cで1時間抽出する。 糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルで安定同位体プロービング実験を37°Cで18時間抽出する。
11. 抽出期間が完了した後に使用するために-80°Cにコールドプレートを置く。
12. 抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置き、HSPとバイアルヘッドスペースから水蒸気を引き出します。
13. HSPをスリーブに移します。
    注:実験は、HSPからより揮発性の高い化合物を失う前に、室温で最大1週間ここで一時停止することができます。

5. ガスクロマトグラフィーでサンプルを分析する - 質量分析計(GC-MS)

1. 次のGC-MS( 材料表を参照)設定を使用します:5分保持で35°C、170°Cまで10°C/分のランプ、20:1の分割比で38分の合計実行時間で230°Cまで15°C/分のランプ。
2. 脱着方法を次のように設定します:2分間、70°C予熱;2分間260°C脱着;34分、260°Cベークアウト;2分間、70°Cポストベークした。
3. サンプルのシーケンスを設定し、インストルメンテーションに従って実行を開始します。
   1. Entechソフトウェアでシーケンスを設定するには、プログラムを開きます。計測器ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで、[ 5800 |シーケンス。
   2. Entechソフトウェアのシーケンステーブルは、GC-MSソフトウェアの場合と同様に観察します。[サンプル ID] 列に、現在のdate_vial番号に従って名前を付けます。Name は GC-MS シーケンステーブルの Name に類似しており、5800 Method は温度ランプの速度、保持時間などを決定します (メニューが開き、ステップ 5.2 で生成されたメソッドが選択されます)。
   3. [トレイ] 列と [位置] 列は、サンプル調製レール (SPR) が HSP を拾う場所を決定することに注意してください。
      1. すぐ左にそれぞれ30個のスポットがある2つのトレイを観察し、それぞれ5つのスポットを持つ6つの列としてレイアウトします。最も左側でユーザー(手前)に最も近いトレイ位置は位置1であり、右端、最も遠いトレイ位置は位置30です。
      2. これらのトレイは HSP A または B であり、HSP B は SPR に近いトレイ(最も内側のトレイ)であり、HSP B のすぐ後ろは HSP ブランクであることに注意してください。抽出したサンプルをトレイに置き、それに応じてシーケンス上のスポットを選択します。
   4. シーケンステーブルを保存し、左側の「 実行 」を選択してから、ブランクの HSP がデ ソーバーにある場合は、デソーバー でブランクから開始します (黄色のラベルでマークされた HSP で示されます)。
4. HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPRをウォームアップさせると、空白がデソーバにあるかどうかを確認するメッセージが画面の上部に表示されます。[ スキップ ]をクリックして、ペンがあることを確認します。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにすると、GC-MS 側のシーケンスによってデータが自動的に別々のファイルに記録されます。

6. データ解析

1. GC-MSソフトウェアの品質フィルタデータ(材料表)。
   1. クロマトグラム上の各ピークを確認し、米国国立標準技術研究所(NIST)ライブラリ(または利用可能な別のライブラリ)と一致するピークに注釈を付けます。
   2. アノテーション付きクロマトグラムピークを処理方法に追加します。75% を超える確率を持つ化合物を含むようにピークを選択するための基準を設定し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。
      1. 処理方法にピークを追加するには、[ |のキャリブレーション] を選択します。複合|の編集名前の| 外部標準コンパウン ドの下にコンパウンドを挿入します。化合物の名前、保持時間、量子シグナル ターゲットイオンを追加します。3 つの最大のピークを追加します。保存するには、[OK] | を選択します。 メソッド|保存します。
   3. プロセス方法を設定したら、 定量化に進み||の計算と 表示QEdit Quant Result.
   4. 各コンパウンドを調べて、ピークが予想される保持時間と一致し、バックグラウンドノイズを超えていることを確認します。
   5. QEdit が完了したら、[ |の終了] を選択します。はい、 QEditsを保存してメインのクロマトグラムに戻ります。左側のファイルを開いて、領域統合をエクスポートします。 定量|の選択レポートの生成。
   6. DExSI で使用するためにファイルをエクスポートするには、[ファイル|] を選択します。 データを AIA 形式にエクスポートする |[新しいディレクトリを作成] を選択し、ファイルの場所を選択するか、[既存のディレクトリを使用] を選択します。
   7. エクスポートするファイルを選択するための新しいウィンドウが開きます。ファイルをウィンドウの右側に移動し、[ プロセス]をクリックします。変換されるファイルの数に応じて数秒から数分待ちます。
2. DExSIソフトウェア(https://github.com/DExSI/DExSI)の指示に従ってDExSIの同位体存在量を補正し、好きなソフトウェアやプログラム(Rなど)で解析を行います。図の生成に使用されるスクリプトは、https://github.com/joannlp/ VOC_SIPにあります。

Results

黄色ブドウ球菌、緑膿菌、A.バウマンニの単一および共培養
単一および共培養は、細菌種 S. aureus、P. aeruginosa、 および A. baumanniiで構成されていた。これらは、ヒトの創傷および慢性感染症に見られる一般的な日和見病原体である。モノカルチャーおよび共培養物中に存在する揮発性分子を同定するために、200rpmの攪拌で70°Cで短い1時間の抽出を行った。24時間および48時間の時点における単一および共培養から、43個の注釈付き揮発性分子が検出され(図2)、その中にはアルデヒド、ケトン、アルコール、硫酸化合物、炭化水素、カルボン酸またはエステル、および芳香族化合物が含まれていた。特定の時点で特定の単一または共培養でのみ検出された少数の揮発性分子があった。例...

Discussion

インビトロ培養物およびヒト関連サンプルにおける揮発性産生を同定するために、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、およびA.バウマニイの単一および共培養物の揮発性分析、ならびに異なる生物学的サンプルの安定同位体プロービングが行われた。モノ培養および共培養についての分析において、揮発分は、70°Cで1時間の短い抽出を行うことにより検出された。 単一および共培養の揮発性分析により、個々の種によって、および他の種との相互作用中に産生される化合物の調査が可能になった。異なる文化タイプと時間ポイント間で相対的な豊富さに違いがありました。安定同位体プロービング実験では、生体試料には健常者由来の糞便や唾液、嚢胞性線維症の被験者由来の下水や痰が含まれていた。安定同位体プロファイリングにより、37°Cで18時間抽出することにより、活発に生成した揮発性分子の同定が可能となりました。 より低い温度での長い抽出時間は、生物学的サンプル中に存在する微生物の増殖および代謝を可能にした。13Cグルコースおよび_D2O富化物を比較すると、標識された^13Cを有するより広範な同位体富化が存在す...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13C グルコース	Sigma-Aldrich	389374-1G
2-Stg Diaph Pump	Entech Instruments	01-10-20030
20 mL VOA バイアル	フィッシャーサイエンティフィック	5719110
24 mm ブラックキャップ 穴付き、セプタムなし	Entech Instruments	01-39-76044B	は、バイアルの蓋ライナーを所定の位置に保持
剤ペン用 24 mm バイアルライナー	Entech Instruments	SP-L024S	は、バイアル
5600 吸着剤ペン抽出ユニット(SPEU)	Entech Instruments	5600-SPES	5600 吸着剤ペン抽出ユニット-120 VAC
96ウェルアッセイプレート	Genesee	25-224
Brain Heart Infusion(BHI)メディア	Sigma-Aldrich	53286-500G
ChemStation Stofware	Agilent
DB-624 カラム	Agilent	122-1364E	60 m、内径 0.25 mm、膜厚 1.40 ミクロン、GC-MS
酸化重水素	Sigma-Aldrich	151882-1L
Dexsi ソフトウェア	Dexsi (オープンソース)
GC-MS (7890A GC および 5975C 不活性 XL MSD with Triple-Axis Detector)	Agilent		7890A GC および 5975C inert XL MSD with Triple-axis検出器
ヘッドスペースバンドル HS-B01, 120VA	エンテックインスツルメンツ	SP-HS-B01	ヘッドスペース抽出を実行するためのアイテム バンドルに含まれる
ヘッドスペース吸着剤ペン (HSP) - ブランク	エンテックインスツルメンツ	SP-HS-0
ヘッドスペース吸着剤ペン (HSP) テナックス TA (35/60 メッシュ)	エンテックインスツルメンツ	SP-HS-T3560
マイクロ遠心チューブ (2mL)	VWR	53550-792
Oリング	エンテックインスツルメンツ	SP-OR-L024
サンプル調製レール	エンテックインスツルメンツ
吸着剤ペンサーマルコンディショナー	エンテックインスツルメンツ	3801-SPTC
トッド・ヒューイット (TH) メディア	シグマ	T1438-500G