リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いた擬似型H5鳥インフルエンザウイルスの作製と抗体中和活性の測定

1996年以来、A/ガチョウ/広東/1/96系統の高病原性鳥インフルエンザ(HPAI)H5ウイルスは、家禽や野鳥で継続的なインフルエンザの発生を引き起こしており、世界の家禽産業における莫大な社会経済的損失を説明しています。時々、人間もそれに感染し、高い致死率に直面します^1,2。しかし、HPAIウイルスの研究は、バイオセーフティレベル3の研究所以外では取り扱うことができないため、しばしば妨げられています。この問題に対処するために、H5 HPAI研究のいくつかの実験において、野生型ウイルスの代替として偽ウイルスが採用されています。疑似ウイルスは、バイオセーフティレベル2の実験室で実践するのに十分安全です。

H5 HPAI偽ウイルスは、代理ウイルスコア、インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質を含む脂質エンベロープ、およびレポーター遺伝子からなるキメラウイルスに属します。偽ウイルスコアは通常、レンチウイルスヒト免疫不全ウイルス(HIV)、マウス白血病ウイルス(MLV)などのレトロウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV^)に由来します3。具体的には、HIV-1パッケージングシステムは、提供される一次遺伝子がギャグとポールであるインフルエンザ偽ウイルスを産生するために広く使用されています。HIVギャグ遺伝子はコアタンパク質を発現します。pol遺伝子はインテグラーゼおよび逆転写酵素を発現し、これらは両方とも形質導入細胞におけるレポーター遺伝子の発現に必要である。代理ウイルスのゲノムを模倣して、レポーター遺伝子はRNAの形で偽ウイルスコアに包含されます。レポーター遺伝子は宿主細胞でタンパク質を発現します。レポーター遺伝子の遺伝子発現レベルは、偽ウイルス感染効率の測定に用いることができる^3,4。主要なレポーターはホタルルシフェラーゼであり、形質導入細胞における相対発光単位(RLU)または相対ルシフェラーゼ活性(RLA)を測定する。lacZ、Gaussia、Renilla luciferaseなどの他のレポーターも使用されていますが、程度は低いです⁵。

偽ウイルスは、H5 HAPIウイルスに対する中和抗体を研究するための理想的なツールです。中和抗体効力を測定するために、疑似ウイルス中和(PN)アッセイ⁶が使用される。ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)は、A型インフルエンザウイルスの表面にある糖タンパク質です^7,8。HAは、受容体結合のための球状頭部ドメインと膜融合のためのステムドメインで構成されています。NAタンパク質は、ウイルス放出を促進するシアリダーゼ活性を有する^7,8。PNアッセイは、HAタンパク質に対する中和抗体を測定することができます。HAの頭部および幹領域を標的とした中和抗体は、ウイルス付着および侵入アッセイによっても検出することができる。野生型ウイルスと比較して、疑似ウイルス中和実験はより感度の高い検出値を持ち、レベル2のバイオセーフティ研究所で安全に取り扱うことができ、一般的に実際に操作するのが簡単です。

このプロトコルは、H5 HPAI偽ウイルス調製およびPNアッセイの手順および重要なステップを詳細に提示する。また、これらのアッセイのトラブルシューティング、制限、および変更についても説明します。本研究では、H5N1 HPAIウイルス由来のA/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)株を例に挙げた。アッセイに用いた免疫血清を得るために、このプロトコールは、TH株由来のHAタンパク質をマウスを免疫するための免疫原として選択した。

すべての疑似ウイルス関連の実験操作は、上海中国科学院パスツール研究所(IPS、CAS)でABSL2条件下で実行されました。動物実験は、施設動物管理使用委員会が承認したIPS、CASの動物プロトコルに基づいて実施されました。

1. リン酸カルシウムトランスフェクションによる偽ウイルスパッケージング

1. HEK293FT細胞の単一細胞懸濁液(9 x 10⁵ / mL)を完全DMEM培地で作製します(表1)。10 mLの単一細胞懸濁液をT75フラスコに加え、トランスフェクションの前に細胞を37°C、5%二酸化炭素(_CO2)インキュベーター内で20時間インキュベートします。
   注:HEK293FT低い通路(<20通路)をお勧めします。セル単層が80〜90%コンフルエントであることを確認してください。
2. トランスフェクションの2時間前に、培地をクロロキン(100 μM)を含む10 mLの新鮮な完全培地と交換します。
3. 試薬とプラスミドDNAを表2および図1に示すように混合します:ddH 2 O、pCMV/R-HA、pCMV/R-NA、pHR-Luc、pCMV Δ 8.9、2.5 M CaCl₂、および2x HEPESバッファー。ピペットで5回穏やかに上下させ、混合物を室温(RT)で20分間インキュベートします。
4. 混合物を細胞の上の培地に移し、フラスコを穏やかに揺り動かします。細胞インキュベーター内で細胞を15時間インキュベートする。
5. 培地を15 mLの新鮮な完全DMEM培地と交換します。細胞を37°C、5%_CO2 インキュベーター内で65時間インキュベートします。
   注:培地の色は淡いオレンジ色またはわずかに黄色になり、細胞の少なくとも80%が倒立光学顕微鏡下で細胞変性効果(CPE)を示すはずです。
6. 上清を採取し、2095 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清を回収し、分注し、-80°Cで保存します。

2. インフルエンザ偽ウイルスのHA、NA、HIV-1 p24タンパク質発現の検出

1. ヘマグルチニン(HA)アッセイによりHAタンパク質発現を検出します。
   1. 50 μL の PBS を 96 ウェル丸底プレートのカラム 2-12、行 A、B、および C に加えます。
      注: 行 A、B、および C は 3 つの独立した複製テストに属し、列 12 は陰性対照として使用されます。
   2. 100 μLの偽ウイルスをカラム1のウェルに加えます。カラム1からカラム2に50 μLを移し、上下に5回ピペッティングしてよく混合し、最後のカラム11まで2倍希釈を行い、カラム11から余分な50 μLを廃棄します。
   3. 50 μLの0.5%赤血球を各ウェルに加え、2回静かに上下にピペットで入れます。プレートをRTで30〜60分間、または陰性対照の赤血球がウェルの底に規則的なスポットを形成するまでインキュベートします。
   4. 偽ウイルスのHA力価を観察し、記録します。
      注:偽ウイルスのHAユニットは、赤血球の100%赤血球凝集を引き起こす可能性のあるウイルスの最高の希釈係数です。
2. ウェスタンブロットアッセイによりHAおよびNAタンパク質発現を検出します。
   注:すべてのウェスタンブロットステップは、分子クローニング(第^4版) のマニュアルに従って実行されます。
3. HIV-1 p24 ELISAキット(材料表)によりHIV-1 p24タンパク質発現を検出します。
   1. 50 μLの溶解バッファーを450 μLの偽ウイルスサンプルに加えます。よく混ぜます。
   2. 300 μLの洗浄バッファーをマイクロプレートの各ウェルに加えます。プレートを逆に叩いて、洗浄バッファーを完全に取り外します。洗浄を5回繰り返します。
   3. 200 μLの標準物質とサンプルを各ウェルに別々に添加します。37°Cで一晩または2時間インキュベートします。
   4. プレートの内容物を吸引し、手順2.3.2の説明に従ってプレートを洗浄します。
      注:アッセイプレートの1つのウェルを空のままにして、基質ブランクとして使用します。
   5. 200 μLのp24検出器抗体を各ウェルに追加します。それらを37°Cで1時間インキュベートします。手順2.3.2の説明に従ってプレートを吸引して洗浄します。
   6. ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ作業溶液100 μLを各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。手順2.3.2の説明に従ってプレートを吸引して洗浄します。
   7. 基質ブランクウェルを含む各ウェルに100 μLのサブステート作業溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
      注:ウェル内で青色が発生します。
   8. 100 μLのストップバッファーを各ウェルに加えます。
      注意: 青色はすぐに黄色に変わります。
   9. 15分以内に450nmでの光学濃度を読み取ります。偽ウイルスのp24力価を記録する

3. 偽ウイルス滴定

1. MDCK細胞の単一細胞懸濁液(5 x 10⁴ / mL)を完全DMEM培地で作製し、1250、2500、5000、10000、20000、および40000細胞を96ウェル平底プレートの異なるウェルに加えます。細胞を37°C、5%_CO2 インキュベーター内で20時間インキュベートします。
2. -80°Cの冷蔵庫から偽ウイルスを取り出し、氷上で解凍し、偽ウイルスをボルテックスします。
3. 6 HAU(6x HA ユニット)シュードウイルスを 96 ウェル丸底プレートの各ウェルに添加し、各ウェルに最大 120 μL の完全な DMEM を補充します。
4. 混合物を5回上下にピペットで入れて、完全に混合します。混合プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーター内で1時間インキュベートします。
5. 100 μLの混合物を96ウェルプレート内の細胞に移します。ウイルス感染後48時間、60時間、および72時間、細胞培養プレートをインキュベーターに戻します。
6. プレートをインキュベーターから取り出し、ルシフェラーゼアッセイを実行します(材料表)。
7. プレートのウェルから培地を慎重に取り出します。細胞を200 μLのPBSで洗い流し、PBSを可能な限り除去します。
   注意: プレートを裏返し、吸収紙に逆叩いて上清を捨てます。試験細胞株が底部にしっかりと付着できない場合は、培地吸引を慎重に取り外します。
8. 50 μLの溶解バッファーを各ウェルに加え、培養プレートを数回揺り動かします。プレートを-80°Cで一晩保管します。
   注:1容量の5x溶解バッファーを4容量の水と混合して、1x溶解バッファーを作ります。使用前に1x溶解バッファーをRTに平衡化してください。プレートを揺り動かして、細胞が溶解バッファーで完全に覆われていることを確認します。単一の凍結融解プロセスは、細胞を完全に溶解するのを助けることができます。
9. プレートを取り出し、RTで2時間平衡化します。
   注:細胞は完全に溶解する必要があります。
10. プレートを数回穏やかに揺り動かし、すべての細胞ライセートを不透明な96ウェルプレートに移します。
11. 50 μLの基質を各ウェルに加え、プレートを数回穏やかに揺り動かし、基質と溶解バッファーを完全に混合します。
12. ルミノメーターを使用して5分以内に生成された光を測定します。偽ウイルスのルシフェラーゼ力価を記録します。
    注:適切な基質が添加されると、ルシフェリンがルシフェラーゼ酵素によってオキシルシフェリンに変換される化学反応を介して副産物として光が放出されます。生成される光の量は、ルシフェラーゼ酵素の量に比例します。

4.免疫血清の調製

注:免疫血清は細胞関連の実験に使用され、実験操作は無菌条件下で実行する必要があります。

1. 12匹の8週齢の雌のBALB/cマウスを準備します。マウスを2つのグループに均等に分けます。
   注:1つのグループはDDVグループで、もう1つはネガティブコントロールグループでした。
2. DDV群免疫:0週目と3週目にA/Thailand/(KAN-1)/2004(TH)HAタンパク質をコードするコドン最適化DNAプラスミド100μgを筋肉内に2回プライミングし、6週目に512 HAU THウイルス様粒子(VLP)を腹腔内に1回ブーストします。
3. 対照群の免疫:0週目と3週目に100μgの空のベクタープラスミドDNAを筋肉内に2回プライミングし、6週目にHIV-1 gag VLPで腹腔内に1回ブーストします。
4. 最後の免疫の2週間後にマウスの血液を採取する。
   注:ここでは、採血時にマウスにペントバルビタールナトリウム(65 mg / kg)を麻酔しました。顎下静脈からの採血後、マウスを直ちに_CO2で安楽死させた。
5. 血液をRTで2時間、その後4°Cで一晩保持します。900 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。血清を56°Cで30分間放置して失活させます。
6. 免疫血清は-80°Cの冷蔵庫に保管してご使用ください。
   注:マウス免疫の主な手順を説明するフローチャートについては、 補足図1 を参照してください。

5.疑似ウイルス中和(PN)アッセイ

1. 完全DMEM培地でMDCK細胞の単一細胞懸濁液(5 x 10⁴ / mL)を作製し、96ウェル平底プレートの各ウェルに100 μLの細胞懸濁液を加えます。細胞を37°C、5%_CO2 インキュベーター内で20時間インキュベートします。
2. -80°Cの冷蔵庫から偽ウイルスと血清を取り出し、氷上で解凍し、十分にボルテックスします。
3. 完全培地で血清を20倍に希釈し、カラム2-10の96ウェル丸底プレートのウェルに100 μLの完全DMEM培地を加えます。
4. 希釈血清200 μLをカラム2のウェルに加え、100 μLをカラム2からカラム3に移し、血清を1:20、1:40、1:80などに希釈してカラム2からカラム10に連続して1:10240にし、カラム10から100 μLを廃棄します。
5. 100 μLのDMEM完全培地をネガティブコントロールとしてカラム11のウェルに加えます。
6. 100 μLの偽ウイルスを各ウェルに加え、混合物を5回完全に上下にピペットで移動し、混合プレートを37°C、5%_CO2 中で1時間インキュベートします。
7. 100 μLの混合物を96ウェル丸底プレートから96ウェル細胞培養プレートの対応するウェルに移します。プレートをインキュベーター(37°C、5%_CO2)に60時間戻します。
8. インキュベーターからプレートを取り出します。ステップ3.7〜3.12に記載されているようにルシフェラーゼアッセイを実行します。

6. 偽ウイルス付着アッセイ

1. 完全DMEM培地でMDCK細胞の単一細胞懸濁液(4 x 10⁴ / mL)を作製し、96ウェル平底プレートで各ウェルに100 μLの細胞懸濁液を加えます。細胞を37°C、5%_CO2 で20時間インキュベートします。
2. 偽ウイルスを血清とともに1%BSAを含むDMEM中で4°Cで一晩インキュベートします。
   注:混合物の容量は100μLです。
3. MDCK細胞を1%BSAを含むDMEMのウェルあたり100 μLで4°Cで1時間ブロックします。
4. 偽ウイルスと血清の混合物(100 μL)をMDCK単層に接種し、4°Cで2時間インキュベートします。
5. 細胞プレートを1%BSAを含むPBSで4回洗浄し、未結合ウイルスを除去します。
6. 細胞を100 μLのルシフェラーゼ溶解バッファーでRTで30分間溶解します。
7. 上記のように、HIV-1 p24 ELISAキットを使用して細胞に結合したウイルスの量を定量します(セクション2.3)。

7.ウイルス侵入の評価

1. 完全DMEM培地でMDCK細胞の単一細胞懸濁液(5 x 10⁴ / mL)を作製し、96ウェル平底プレートの各ウェルに100 μLの細胞懸濁液を加えます。アッセイの前に、細胞を37°C、5%_CO2 で20時間インキュベートします。
2. 偽ウイルス(100 μL)を96ウェルプレートのMDCK単層に4°Cで6時間接種します。
3. 細胞プレートを1%BSAを含むPBSで4回洗浄し、未結合の偽ウイルスを除去した。
4. 1%BSAを含むDMEM中で段階希釈した免疫血清または偽ワクチン接種マウス由来の血清を単層に100 μL加え、細胞を4°Cで2時間インキュベートします。
5. 細胞上清を除去し、細胞培養プレートを1%BSAを含むPBSで4回洗浄した。
6. 新鮮なDMEMを細胞に加え、37°C、5%_CO2 インキュベーター内で60時間インキュベートします。
7. ステップ3.7〜3.12で説明したように、細胞の相対ルシフェラーゼ活性(RLA)を測定します。
   注:RLAによって示されるように、ウイルス侵入は、血清の非存在下で得られた測定値のパーセンテージとして表され、100%として設定された。

インフルエンザ偽ウイルスのHA、NAおよびHIV-1 p24タンパク質発現
ウイルスパッケージング効率を同定するために、インフルエンザ偽ウイルスストックをHAアッセイによって最初に検出した(図2A)。インフルエンザ偽ウイルスのミリリットル当たりのHA単位は643である(表3)。ウェスタンブロットアッセイおよびサンドイッチELISAアッセイを使用して、HA、NA、およびHIV-1 p24タンパク質発現を試験しました。次に、HAユニットの比率と偽ウイルスのギャグp24の量を計算しました。ウェスタンブロットアッセイの結果は、HA0、HA1、HA2、およびNAタンパク質の4つのタンパク質タイプがあることを示しました(補足図2)。これは、インフルエンザ偽ウイルスのエンベロープタンパク質が野生型ウイルスのエンベロープタンパク質と類似していることを示しています。HAとGag p24の比率は、報告されているように正常範囲内でした(表3)9。

表3:H5偽ウイルスの定量。

偽ウイルス滴定
機能性ウイルス粒子の濃度を測定するために、偽ウイルスの相対ルシフェラーゼ活性(RLA)が検出された。RLAの読み取り値は、多くの変数に依存しています。RLA測定値に対する形質導入細胞量の影響を特定するために、96ウェルプレートのウェルあたり1250、2500、5000、10000、20000、および40000の細胞を播種しました(図2)。結果は、偽ウイルスのRLA測定値が最も高く、平均の標準誤差は、5000個の細胞を96ウェルプレートのウェルに播種したときに最も低いことを示しました(図4A)。インキュベーション時間の影響を特定するために、ウイルス感染後48時間、60時間、および72時間にRLA測定値が検出されます。結果は、60時間インキュベートした場合、疑似ウイルスのRLA測定値は値が高く、再現性が高く、平均の標準誤差が低いことを示しました(図4B)。結果は、96ウェルプレートのウェルに5000個の細胞を播種し、ウイルス感染の60時間後にRLA測定値を検出するのに適していることを示しています。

PNアッセイ
対照群およびDDV群からの免疫血清の中和力価をPNアッセイにより測定した(図5)。 図5Aに示すように、DDV群の免疫血清は、偽ウイルスA/Thailand/1(KAN)-1/04株に対して高い中和力価を示した。対照的に、対照群由来の血清は、いかなる中和活性も示さなかった(図5B)。従来の血清学的アッセイ(HIおよびMNアッセイ)と比較して、PNアッセイはより感度が高い(データは示されていない)。

付着中和アッセイ
一部の中和抗体は、シアル酸受容体へのウイルスの付着を妨げる可能性があります。これらの抗体はHAヘッドに向けられ、市販ワクチンによる免疫またはインフルエンザウイルスの感染後に優勢です。これらの抗体の中和活性を同定するために、付着中和アッセイが実施される(図3)。対照血清と比較して、免疫血清の中和活性は強力であり、免疫血清中のHAヘッドに向けられた抗体が多いことを示しています(図6A)。

ウイルス侵入の評価
このアッセイは、インフルエンザウイルス感染時にウイルスエンベロープとエンドソーム膜の融合を妨げる抗体を同定するために使用されます。これらの抗体はHAストークドメインに向けられており、一般的に効力は低くなります。これらの抗体の中和力価を測定するために、接着後アッセイが実施されます(図3)。免疫血清と対照血清の間には有意差があり、これは免疫血清中のHAステム領域を指向する抗体が存在することを示している(図6B)。

図1:カルシウム媒介トランスフェクションのフローチャート。 このフローチャートは、カルシウム媒介トランスフェクションの主な手順を説明するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:偽ウイルスの定量と滴定 。 (a)偽ウイルスHAアッセイの主要なステップを説明する偽ウイルスHAアッセイのフローチャート。(b)偽ウイルスP24アッセイの主要なステップを説明する偽ウイルスP24アッセイのフローチャート。(c)擬似ウイルス滴定アッセイの主要なステップを説明する擬似ウイルス滴定アッセイのフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:疑似ウイルスベースの中和アッセイ。 (a)PNアッセイの主要なステップを説明するPNアッセイのフローチャート。(b)付着アッセイの主要なステップを説明する偽ウイルス付着アッセイのフローチャート。(C)ウイルス侵入アッセイの主要なステップを記載したウイルス侵入アッセイの評価のフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:偽ウイルス滴定。 (A)96ウェルプレートのウェルあたりの細胞量の違いは、RLAの読み取り値に影響します。1250、2500、5000、10000、20000、および40000細胞を96ウェルプレートに播種した。(B)収穫時期が異なると、RLAの読み取り値に影響します。RLA測定値は、ウイルス感染後48時間、60時間、および72時間で検出されます。3つの独立した実験から収集されたデータは、SEM±平均として提示されます。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表します。テューキー検定による一元配置分散分析が実施されました。P < 0.0001;ns、重要ではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:偽ウイルスで検出されたH5中和抗体応答。 (a)DDV群由来の免疫血清の中和抗体応答の滴定。(b)対照群由来の免疫血清の中和抗体応答の滴定。IC50は、偽ウイルスの50 %を阻害することができる中和抗体の相互希釈として定義される。3つの独立した実験から収集されたデータは、SEM±平均として提示されます。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表します。VSVG偽ウイルスを陰性対照として用いた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:結合およびウイルス侵入アッセイによる中和抗体効力の検出 。 (a)DDV群由来の免疫血清は、対照群由来のものではなく、細胞へのウイルス付着を阻害する。(B)DDV群由来の免疫血清は、対照群由来のものではなく、ウイルス付着後感染を部分的に阻害する。3つの独立した実験から収集されたデータは、SEM±平均として提示されます。エラーバーは平均の標準誤差(SEM)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:完全なDMEM培地組成。

表2:疑似ウイルスパッケージングシステム。

補足図1:マウス免疫のフローチャート。 このフローチャートは、マウス免疫の主な手順を説明する。免疫血清を試料とした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:インフルエンザ偽ウイルスのHA、NAおよびHIV-1 p24タンパク質発現。 偽ウイルスタンパク質のウェスタンブロット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は開示するものは何もありません。