方法論記事

組織におけるタンパク質およびRNA発現の空間プロファイリング:仮想マイクロダイセクションの微調整へのアプローチ

DOI：

10.3791/62651

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2022年7月6日

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1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、腫瘍微小環境をより適切に特徴付け、特定の細胞集団を特定するために、空間オミクス技術の関心領域(ROI)を微調整するためのプロトコルについて説明します。プロテオミクスアッセイでは、カスタマイズされたプロトコルを自動化してROIを選択し、トランスクリプトミクスアッセイでは50 μmのROIを利用して微調整することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多重化により、空間コンテキストを提供しながら、同じ組織上の複数のマーカーを評価できます。空間オミクス技術は、光切断可能なオリゴタグ付き抗体とプローブをそれぞれ活用することにより、タンパク質とRNAの両方のマルチプレックスを可能にします。オリゴは、組織全体の特定の領域から切断および定量化され、基礎となる生物学を解明します。ここで、この研究は、自動化されたカスタム抗体視覚化プロトコルを利用して、空間プロテオミクスアッセイと組み合わせてROI選択をガイドできることを示しています。この特定の方法は、空間トランスクリプトミクスアッセイで許容できる性能を示さなかった。このプロトコルでは、チラミドシグナル増幅(TSA)を使用して特定のタンパク質ターゲットからの蛍光シグナルを増幅し、選択する抗体プールを増やす、自動プラットフォームでマーカーを視覚化するための3-plex免疫蛍光(IF)アッセイの開発について説明しています。可視化プロトコルは、品質と再現性を確保するために、徹底的に検証された3プレックスアッセイを使用して自動化されました。さらに、DAPIとSYTO色素の交換を評価して、空間プロファイリングプラットフォームでTSAベースのIFアッセイをイメージングできるようにしました。さらに、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して小さなROIを選択する能力をテストし、高度に特異的な関心領域(特定の細胞タイプに富む領域など)の調査を可能にしました。直径50 μmと300 μmのROIを収集し、これはそれぞれ約15細胞と100細胞に相当します。サンプルをライブラリにして配列決定し、組織の小さなROIおよびプロファイル特異的領域からのシグナルを検出する能力を調査しました。私たちは、空間プロテオミクス技術がROI選択を導くための自動化された標準化されたプロトコルから大きな恩恵を受けることを決定しました。この自動可視化プロトコルは空間トランスクリプトミクスアッセイと互換性がありませんでしたが、標準的な手動可視化プロトコルを使用すると、小さなROIでも特定の細胞集団を正常に検出できることをテストし、確認することができました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マルチプレックス技術の進歩は、腫瘍に存在する標的に対してより優れた特性評価ツールを提供し続けています。腫瘍微小環境(TME)は、腫瘍細胞、浸潤免疫細胞、および間質の複雑なシステムであり、空間情報は、関心のあるバイオマーカー間の相互作用のメカニズムをよりよく理解および解釈するために重要です1。GeoMxデジタル空間プロファイラー(DSP)や10x Visiumなどの新しい技術により、複数のターゲットを空間コンテキスト内で同時に検出および定量化できます。組織の可視化を容易にする免疫蛍光プロトコルを使用すると、これらの技術の空間プロファイリング機能をさらに向上させることができます。

本手法開発で着目した空間オミクス技術は、UV感受性光分解性リンカーを介してオリゴヌクレオチドを抗体やRNAプローブに結合させる空間プロテオミクスやトランスクリプトミクスアッセイです。組織学的スライドは、これらのオリゴ結合抗体またはプローブで標識され、空間プロファイリングプラットフォームで画像化されます。次に、さまざまなサイズと形状のROIを照明用に選択し、光切断されたオリゴヌクレオチドを吸引して96ウェルプレートに収集します。光切断されたオリゴヌクレオチドは、ナノストリングnCounterシステムまたは次世代シーケンシング(NGS)2,3のいずれかで定量できるように調製されます(図1)4,5。

細胞分布は組織内で異なり、選択されたマーカーと異なるROIサイズを使用して細胞の特定の位置を特徴付ける能力は、組織環境を完全に理解し、特定の特徴を特定するために非常に重要です。ここで言及した空間オミクス技術では、標準的な可視化プロトコルは直接結合抗体を使用し、手動プロトコルです。腫瘍と間質を区別するための標準マーカーは、パンサイトケラチン(panCK)およびCD45 6,7ですが、目的の特定の細胞集団を標的とするには、追加のマーカーが必要です。さらに、直接結合した蛍光抗体の使用は増幅を欠いており、抗体の選択が豊富なマーカーに限定されています。さらに、手動アッセイは、自動化されたワークフローよりもばらつきが大きくなります8。したがって、ROI選択のために、カスタマイズ可能で、自動化され、増幅された視覚化プロトコルを有することが望ましい。

ここで、この研究は、空間プロテオミクスアッセイの場合、TSAテクノロジーを自動化されたプラットフォームでの視覚化プロトコルに使用でき、よりターゲットを絞った標準化されたアッセイを実現できることを示しています。さらに、TSAベースのアッセイでは、低発現マーカーの使用が可能になり、可視化のために選択できるターゲットの範囲が広がります。panCK、FAP、および抗体Xの3プレックスアッセイは、panCKおよびFAPを使用して腫瘍と間質をそれぞれ区別する自動化されたプラットフォームを使用して開発されました。抗体Xは腫瘍で頻繁に遭遇する間質タンパク質ですが、その生物学と抗腫瘍免疫への影響は完全には理解されていません。抗体Xが豊富な領域における免疫コンテクスチャーの特性評価は、抗腫瘍免疫および治療反応におけるその役割、ならびに創薬標的としてのその可能性を解明することができる。

カスタマイズされた自動TSA可視化パネルは、空間プロテオミクスアッセイで成功することが証明されましたが、空間トランスクリプトミクスアッセイへのこれらのアッセイの適用は確認できませんでした。これは、RNAの完全性を損なうと思われる自動可視化プロトコルに使用される試薬とプロトコルが原因である可能性が最も高いです。可視化マーカーの自動標識プロトコルは、空間プロテオミクスアッセイには使用できるが、空間トランスクリプトミクスアッセイには使用できないことを認識することで、空間オミクス技術のアッセイ設計に関する重要なガイダンスを提供します。

さらに、この研究は、空間トランスクリプトミクスアッセイを使用して、直径50μmの領域(約15細胞)のターゲットをプロファイリングできることを実証しています。小さなROIの転写物も検出するアッセイの能力をテストするために、2つの異なるサイズのROIを選択しました。各関心領域について、1,800 mRNAターゲットに対応するオリゴを収集し、空間プロファイリングプラットフォームプロトコルに従ってライブラリにしました。ライブラリは個別に索引付けされ、その後プールされ、順序付けられました。これにより、プーリング効率と、小さなROIで特定の細胞集団を特定する能力の両方を評価することができました。

この論文は、空間プロテオミクスアッセイの場合、関心のある特定のマーカーのROI選択をガイドする自動プロトコルを使用して、関連する組織領域の調査を選択的に標的化し、組織の空間環境を特徴付けることができることを示しています。さらに、より小さなROIを空間トランスクリプトームアッセイに使用して、特定の細胞集団を検出および特性評価できることを実証します。

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プロトコル

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すべてのヒト組織は、適切な治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントが得られたという保証の下で、商業バイオバンクまたは認定組織バンクから取得されました。

注: このプロトコルは、ディスカバリー ウルトラと GeoMx デジタル空間プロファイラーを使用して実行されます。このプロトコルで使用される試薬、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. 空間プロテオミクスアッセイのための自動可視化プロトコル

  1. 蛍光可視化抗体を適用するためのプログラムオートステナー
    1. オートステイナーソフトウェアで、ホームボタンをクリックし、 プロトコルを選択します。次に、[ プロトコルの作成/編集 ]をクリックし、手順として RUOディスカバリーユニバーサル を選択します。
    2. Depar v2>脱パラフィン化>最初のシーケンスをクリックします。中温の場合は、72°Cを選択し、前処理をクリックして、セルコンディショニングとCC1リザーバーを選択します。[非常に高い温度]の場合は、[100°C]を選択し、[CC1 8分]をクリックして、[CC1 64分]が選択されるまでクリックを続けます。
    3. ディス カバリー阻害剤>阻害剤をクリックし、[ インキュベーション時間]で [8分]を選択します。次に、抗体 >高温アブインキュベーションをクリックします。 低温の場合は、 37°Cを選択します。[ 抗体] で、ディスペンサーラベルから抗体番号を選択します (この例では抗体 6 )。 [プラスインキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
      注:このプロトコルには3つの異なる抗体番号があります。最初の抗体はFAP、2番目はパンサイトケラチン、3番目は抗体Xです。
    4. マルチマーHRP>マルチマーHRPブロッカーをクリックし、抗体ブロッキングでGt Igブロックを選択し、インキュベーション時間で4分を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、Cy5をクリックし、長いインキュベーション時間で0時間8分を選択します。
    5. デュアルシーケンスをクリックして抗体変性を選択し、次に抗体変性CC2-1を選択し、超高温の場合は100°Cを選択します。インキュベーション時間が8分であることを確認してください。次に、DS阻害剤をクリックし、中和を選択します。
    6. DS抗体をクリックし、超低温の場合は37°Cを選択します。次に、[抗体] でディスペンサーラベルから抗体番号 (この例では抗体 3) を選択し、[Plus インキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
    7. DS Multimer HRP をクリックし、DS Multimer HRP ブロッカーを選択します。次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で [4 分] を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗MSHRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、DSローダミン6Gをクリックし、長いインキュベーション時間の場合は0時間8分を選択します。
    8. トリプルステインをクリックしてTS抗体変性を選択し、次に抗体変性CC2-2を選択し、超高温の場合は100°Cを選択します。インキュベーション時間が8分であることを確認してください。次に、TS阻害剤をクリックし、TS中和を選択します。
    9. TS抗体をクリックし、超低温の場合は37°Cを選択します。次に、[抗体] でディスペンサーラベルから抗体番号 (この例では [抗体 7]) を選択し、[Plus インキュベーション時間] で [32 分] を選択します。
    10. TS マルチマー HRP をクリックし、TS マルチマー HRP ブロッカーを選択します。 次に、[抗体ブロッキング] で [Gt Ig ブロック] を選択し、[インキュベーション時間] で [4 分] を選択します。次に、マルチマーHRP試薬でOMap抗RB HRPを選択し、インキュベーション時間で16分を選択します。次に、TS FAMをクリックし、長いインキュベーション時間の場合は、0時間8分を選択します。
    11. プロトコルにタイトルを追加します。プロトコル番号を選択し、コメントを追加して、[ アクティブ ]、[ 保存]の順にクリックします。
  2. スライドの準備、ラベルの印刷、オートステインの実行の開始
    1. ベークベンダーは、FFPE(ホルマリン固定、パラフィン包埋)ヒト組織切片を70°Cに設定されたオーブンで20〜60分間調達しました。スライドのベイク処理中に、オートステインソフトウェアで 「ラベルを作成 」をクリックしてラベルを印刷します。次に、[プロトコル]をクリックし、 プロトコル番号を選択して、[ 閉じる/印刷]をクリックします。スライドラベルに関連情報を追加し、[ 印刷]をクリックします。
    2. オーブンからスライドを取り出し、室温(RT)まで冷まします。以前に印刷したプロトコル・ラベルを対応するスライドに適用します。
    3. 詰め替え可能な抗体ディスペンサーに、ステップ1.1で割り当てられた抗体ラベル番号に従って抗体をロードします。このプロトコルでは、FAP用の抗体6を1 μg/mL、パンサイトケラチン用の抗体3を0.1 μg/mL、抗体X用の抗体7を2.5 μg/mLで使用します。各抗体を指定された希釈液で希釈し、詰め替え可能な抗体ディスペンサーをプライミングします。
    4. 上記のブロッキング、検出、および増幅の事前に充填された試薬ディスペンサーを収集し、試薬トレイに置きます。スライドトレイにスライドをロードし(実行ごとに最大30枚のスライド)、[ 実行 ]、[ はい]の順にクリックします。DAPIは核対比染色には使用されないことに注意してください。
    5. オートステイナーソフトウェアで実行時間を確認して、実行の開始を確認します。プロトコルは完了するまでに~11時間かかり、一晩実行できます。
    6. 翌日、スライドトレイスロットの緑色のライトが点滅するのを確認して、実行が完了していることを確認します。次に、スライドを装置から取り出し、液体カバーガラス溶液が完全に除去されるまで、1x反応バッファーでスライドを激しくすすぎます。
  3. プロテオミクスアッセイのための空間プロファイリングプラットフォームプロトコル
    1. 以下の注に示されている空間プロテオミクスプロトコルに従ってください。プロトコルに次の変更を含めて、3-plex 自動ラベル付け手順を有効にします。
    2. 空間プロテオミクスプロトコルを開始する前日に手順1.2.1-1.2.6を実行し、手順1.2.6を実行した後、空間プロテオミクスプロトコルの抗原検索手順に直接移動します。空間プロファイリングプロテオミクスプロトコルで概説されている視覚化手順は省略します。
    3. SYTO 13を5000 nMのSYTO 64に置き換えて、蛍光色素の統合を可能にします。SYTO 64を1x TBSで希釈し、湿度チャンバーで15分間インキュベートします。
    4. 空間プロファイリングプラットフォームでスキャンパラメータを設定する際、可視化パネルで使用する蛍光色素に応じてフィルターとフォーカシングチャンネルを選択し、3-plex統合を可能にします。ディスカバ リーFAM にFITCを使用して露出を200ミリ秒に設定し、 ディスカバリーローダミン6G にCy3を使用して露出を200ミリ秒に設定し、 SYTO 64 にテキサスレッドを使用して露出を50ミリ秒に設定し(これをフォーカスチャネルとして指定)、最後にディス カバリーCy5にCy5を使用して露出を200ミリ秒に設定します。 変更を保存します。
      注:空間プロファイリングプロテオミクスプロトコルの詳細な手順は、公式Webサイトの[サポート]タブの [ドキュメント]>[ユーザーマニュアル]の順に選択して見つけることができます。ここでは、ボンドRXを使用してnCounterのタンパク質プロトコルを探します。

2. 空間トランスクリプトミクスアッセイのROI選択

  1. FFPEセルペレット切片を70°Cに設定したオーブンで20〜60分間焼きます。以下の注に示されている空間プロファイリングプラットフォームのNGSプロトコルに従い、空間プロファイリングプラットフォームでスライドをスキャンし、50 μmと300 μmのサイズを選択します。空間トランスクリプトミクスアッセイでは、以下の推奨事項が強調されています。
    1. ライブラリを準備するときに、さまざまなサイズのROIを選択した場合は、同様のサイズのROIをプールして、サイズごとに1つのライブラリを作成します。これは、サイズによる偏りなしに、すべてのROIに対して十分なシーケンスの深さが達成されるようにするためです。
      注:空間プロファイリングプラットフォームの詳細な手順は、公式Webサイトの[サポート]タブの [ドキュメント]>[ユーザーマニュアル]の順に選択します。ここでは、ボンドRXを使用したNGSアプリケーション用のRNAプロトコルを探してください。

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結果

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ROI選択をガイドする自動視覚化プロトコル
このホワイトペーパーでは、自動化されたカスタムTSAベースのIFプロトコルを使用して組織を視覚化し、特定のROIを選択する方法を示します。メラノーマとヒト正常皮膚を対照組織として使用した可視化パネルの開発は、エピトープ安定性試験、マーカー強度の微調整、および1つのアウトコントロールによるブリードスルー評価で構成されていました。抗体のエピトープ安定性が反復溶出ステップによって影響を受けるかどうかを試験するために、FAPおよび抗体Xシグナルを、3-plexの各位置で標識した後に定性的に評価した。抗体Xシグナルはすべての位置で一貫していましたが、FAPシグナル強度は1回の溶出後に減少しました(図2)。以前の内部研究では、panCKエピトープが3プレックスアッセイ全体で安定していることが示されました。したがって、FAPは3-plexの1番目の位置に配置され、panCKは2番目の位置に配置され、抗体Xは3番目の位置に配置されました。FAPシ...

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ディスカッション

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今日まで、手動プロトコルにおける直接結合蛍光抗体は、空間プロテオミクスまたは空間トランスクリプトミクスアッセイの可視化パネルとして最も一般的に使用されている9、10。しかし、直接結合した蛍光抗体の使用は、マーカーの数が少ない場合には困難であり、適切な抗体の選択が制限されます。このプロトコルは、可視化マーカーの標識が、空間プロテオミクスアッセイをサポートするTSA技術を使用して自動染色プラットフォーム上で自動化できることを示しています。これにより、視覚化パネルのカスタマイズの柔軟性が高まり、よりターゲットを絞ったROIの選択と、組織の特定の領域からの関連する生物学的データの取得が可能になります。TSA技術はまた、低存在量マーカーの可視化を可能にし、それによって潜在的な適切な抗体の数を増加させる。さらに、可視化プロトコルの自動化により、ラベリング手順の再現性と品質が保証されます。

3-plex IFアッセイを開発するには、適切なコントロール組織上のマーカー/蛍光色素シ...

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開示事項

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ベロニカ・イバラ・ロペス、サンギータ・ジャヤカール、イェチン・アンジェラ・ヤン、ゾラ・モドルサン、サンドラ・ロストは、ロシュ・グループのメンバーであるジェネンテックの従業員および株主です。ロシュの一部である他の企業は、この原稿で使用される試薬と機器を製造しています。Ciara Martinは、この原稿で使用される試薬と機器を製造するNanoString Technologies Inc.の正社員です。

謝辞

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著者らは、NGSファイルを処理したトーマス・ウーを認めています。結果の議論と原稿のレビューをしてくれたJames Ziaiと、内部原稿の改訂をしてくれたMeredith TriplelとRachel Taylorに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x Tris buffered saline (TBS)Cell Signaling Technologies12498SDEPC 処理水で 1x TBS に希釈
抗体 X (非公開)抗体 機密性のため盲検化
DEPC 処理水ThermoFisherAM9922Another can be used
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1 )Ventana950-500
ディスカバリー Cy5 キットベンタナ760-238Cy5
ディスカバリー FAM キットベンタナ760-243FAM
ディスカバリー ヤギ IG ブロックベンタナ760-6008Gt Ig ブロック
ディスカバリー OmniMap アンチ MS HRPベンタナ760-4310OMap アンチ MS HRP
ディスカバリー オムニマップ反 RB HRPベンタナ760-4311OMapアンチRb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6GキットVentana760-244Rhodamine 6G
Discovery Ultra Automated Slide Preparation SystemVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FS原稿ではautostainerと表記
FAP [EPR20021] 抗体Abcam Ab207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1Y原稿の空間プロファイリングプラットフォームとして参照
湿度チャンバーSimportM920-2その他、
Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] 抗体AbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonStatisticalanalysis
Reaction Buffer (10x)Ventana950-300
統計解析ソフトウェアGraphPadPrism 7統計解析
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana 抗体希釈液 with カゼインVentana760-219原稿
では指定希釈剤と表記Ventana 一次抗体ディスペンサーVentanaカタログ番号はディスペンサー番号によって異なります

参考文献

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