ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

Summary

本稿では,ラットの大腿骨顆軟骨損傷を20N以上60回周期的に圧迫することにより生じたラット膝の周期的荷重誘発関節内軟骨病変モデルを提示する.

Abstract

原発性変形性関節症(OA)の病態生理は不明のままである。しかし、比較的若い年齢層におけるOAの特定の下位分類は、関節軟骨損傷および靭帯剥離の病歴と相関している可能性が高い。膝のOAの外科動物モデルは、心的外傷後OAの発症と進行を理解する上で重要な役割を果たし、この病気の新しい治療法の開発に役立ちます。しかし、非外科的モデルは、介入の評価に影響を与える可能性のある外傷性炎症を回避するために最近検討されている。

この研究では、 in vivo 周期圧縮負荷によって誘発される関節内軟骨病変ラットモデルが開発され、研究者は(1)局所軟骨損傷を引き起こす可能性のある負荷の最適な大きさ、速度、および持続時間を決定することができました。(2)軟骨細胞の活力における心的外傷後時空間病理学的変化を評価する。(3)関節圧縮荷重に対する適応および修復メカニズムに関与する破壊的または保護的分子の組織学的発現を評価する。この報告では、ラットモデルにおけるこの新しい軟骨病変の実験プロトコルについて説明します。

Introduction

伝統的に、前十字靭帯(ACL)の切断または内側半月板の不安定化は、小動物の心的外傷後変形性関節症(PTOA)の調査に最適であると考えられてきました。近年、非侵襲的な周期的圧縮モデルがPTOAの研究に使用されています。このモデルはもともと機械的負荷に対する海綿骨の反応を調査するために設計され¹、その後、PTOA^研究2,3,4,5,6の非外科的動物モデルとして変更されました。理論的根拠は、一連の炎症反応を引き起こす周期的な外力を加えることによって関節軟骨を衝突させることです。しかし、このモデルはマウスにのみ適用されており、より大きな動物への負荷の適切な大きさは議論されていませんでした。

以前のモデルの別の問題は、大量のプロトコルに含まれるサイクルが多すぎるため、いくつかのサンプルで軟骨下骨の過度の肥厚、望ましくない副作用を引き起こした^{ことです7}。そこで、大型動物に適した大きさで負荷の副作用が低い新しい周期圧縮法が開発されました⁸。現在の記事の全体的な目標は、ラットの非侵襲的周期的圧迫モデルのプロトコルを説明し、軟骨変性の代表的な結果を観察することです。現在のプロトコルは、ラットへの非侵襲的周期的圧縮モデルの適用に関心のある読者を助けるでしょう。

Protocol

京都大学動物研究委員会(承認番号:医学教17616)により承認されました。

1.ラットの膝に in vivo 周期的圧迫を実行します

1. 実験動物の麻酔を誘発する
   1. 麻酔ボックス内の5%イソフルラン溶液を吸入することにより、12週齢のWistarラット(256.8 ± 8.7 g)に麻酔を誘発します。.
   2. メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノールを含む3種類の麻酔薬⁹の混合物をラット体重2 mg / kgで腹腔内注射し、右膝関節周辺を剃ります。.つま先ピンチへのペダル反射の欠如による十分な麻酔を確認します。
2. 麻酔をかけたラットを固定装置に取り付けます。
   1. 麻酔をかけたラットを腹の上に置き(図1)、右膝を凹状の溝のある樹脂片に取り付けます。右後肢を股関節伸展、膝屈曲、足首伸展の位置に置き、膝を約140°曲げます。可動器具のくさび形の溝にラットのかかとを収容します。
   2. 固定装置を応力/引張試験装置に移動します( 材料の表を参照)。ロードセルとの接触がないことを確認したら、応力/引張試験機制御ソフトウェア(材料表)を開き、[ キャリブレーション ]ボタンをクリックします。キャリブレーション後、フレームの上部をロードセルに慎重に取り付けます。膝関節をフレームにしっかりと取り付けたままにするには、可動式のメイン操作パネルの回転ノブを、予圧が5Nに達するまでゆっくりとオンにします。
3. 荷重方法を構築し、圧縮試験を設定します。
   1. メインメニューで、[新しいメソッドの作成]をクリックします|システムラベル。[テスト モード] を [サイクル] に設定し、[テスト タイプ] を [圧縮] に設定します。[センサー] ラベルをクリックし、[テスト] タブを選択して、制限が 60 N 以内であることを確認します。さらに、[ストローク]タブを選択し、制限が500mm以内であることを確認します。
      注意: 上記の手順では、応力点に大きな変位がある場合、操作がすぐに停止します。
   2. テストコントロールラベルの下で、成長の起源を選択して、0.3%/フルスケールでメインプログラムを開始します。荷重サイクルの4つのセクションのうち、第1および第^{3セクション}の制御ストローク速度を1mm/sに設定します。2番目のセクションの最大試験力を20Nに設定し、4^番目のセクションの最小試験力を5Nに設定します。 「保持期間」をピーク負荷の場合は0.5秒、最小負荷の場合は10秒に設定します(図2)。
      注意: この手順ではすべてのサイクルを定義するため、ジョイントサーフェスが互いに接触し、妥当な速度で移動していること、およびモーションが維持されていることを確認してください。
   3. ページの下部にある[ プリロード ]タブで、[オン]が オン になっていること、[ たわみ除去速度 ]が100 mm/minに設定され、 最大力 が5 Nであることを確認します。[ 試験片] ラベルで、[ 材料 ]を [金属]に設定します。
      注: これらの詳細設定は、製造元ごとに異なる場合があります。
   4. [メイン] メニューの [メソッドとテストの選択] セクションで、ビルドしたメソッドを選択し、[開始] をクリックしてテストを開始します。
      注意: 下部の表は、ピーク荷重と変位の実際の測定値を示しています。
   5. サイクル数を60に設定します。
      注意: ロードセッション全体には60サイクルが含まれ、約12分続きます。対照群では、ラットは同じ条件下で12分間プレロードのために5Nプレロードを受けた。
4. ロード後、ラットをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。十分なスペースと食物の自由でケージ内で12〜12時間の明暗スケジュールを維持します 。 必要な実験期間の後、分析のために腹腔内または二酸化炭素吸入(1時間〜8週間)に注射された3つの麻酔薬の混合物の過剰摂取でラットを屠殺する。

Results

20 Nの周期負荷を受けたサンプルの軟骨細胞の生存率の短期的変化(1時間および12時間)の代表的な結果が得られました。 図3に示すように、死骸軟骨細胞数(赤色蛍光)は外傷後12時間で増加した。逆に、生きた軟骨細胞の数(緑色蛍光)は減少し続け、患部に生きた軟骨細胞を含まないサンプルもありました。

組織学的には、20N動的荷重を受けたラット膝の関節軟骨が損傷しており、すべてのサンプルで外側大腿骨顆に1つの限局性病変ゾーンが確認されました(図4)。しかし、病変の大きさは8週間の観察期間中に徐々に増加しなかった。病変と影響を受けていない軟骨の界面に対応する境界が患部に観察された。

Discussion

現在のプロトコルは初めて^{、マウス2}などの小さなげっ歯類の関節内損傷モデルと同様に、ラットの外側大腿骨顆に負荷誘発軟骨病変のモデルを確立する方法を示しています。しかし、マウスの負荷プロトコルは重度の骨棘形成と十字靭帯病変を引き起こし、周期的圧迫の効果を評価するのに理想的ではありませんでした。現在のプロトコルは、はるかに低い負荷力でラットに限局性軟骨病変を作成しました。適切な大きさ、速度、および持続時間のストレスのみが骨組織に損傷を与えることなく軟骨を破壊できるため、正しい負荷方法の設定はプロトコルにとって重要です。

変位限界の設定(プロトコルステップ1.3.1)は、靭帯が破裂した場合、またはラットが負荷セッション中に麻酔から目覚めた場合に機器を直ちに停止するため、非常に重要です。最適な最大負荷およびラットの年齢はまだ決定されていない。しかし、予備実験では、50Nを超える荷重により、ラットの膝にACL破裂の可能性が高い。さらに、現在のモデルは、おそらく成長が起こるにつれて軟骨の硬さのために、高齢(>36週齢)ラットで再現するのが困難です。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小動物用麻酔器	信濃製作所	SN-487-0T
オートグラフ AG-X	島津製作	N.A.	プレシジョンユニバーサル/引張試験機
Fluoview FV10i顕微鏡	Olympus Corp	N.A.	全自動共焦点レーザー走査型顕微鏡
イソフルラン吸入液	ファイザージャパン株式会社	(01)14987114133400
LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit	サーモフィッシャー・サイエンティフィック・ジャパン	L3224	細胞の生存率を素早く簡単に判断できる2色アッセイ
TRAPEZIUM X Software	島津製作	所	Autograph AG-X用データ処理ソフトウェア