方法論記事

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

DOI：

10.3791/62667

⸱

2022年3月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原発性繊毛(PC)は、ほとんどの哺乳動物細胞の表面から突出する非運動性の動的微小管ベースの細胞小器官である。それらは、細胞周期のG1/G0期に古いセントリオールから出現するが、細胞がG2/M期境界で細胞周期に再び入るにつれて分解する。それらは、多くの細胞プロセスに不可欠な細胞外シグナルを検出して伝達することによって、シグナルハブとして機能します。ほとんどの細胞型と同様に、すべての新皮質神経幹および前駆細胞(NSPC)は、正常な脳皮質の発達に必要な特定のシグナルを感知および伝達することを可能にするPCを保有していることが示されている。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)から2次元(2D)および3次元(3D)細胞ベースのモデルを生成して特徴付け、新皮質発生中のPCの関与をさらに解剖するための詳細なプロトコルを提供します。特に、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路の形質導入を含む2D神経ロゼット由来NSPCにおけるPCの生合成と機能を研究するためのプロトコルを提示する。脳オルガノイドの三次元(3D)組織を利用するために、我々は、 ヒトト 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単な方法を説明する。光学的クリアリングの後、オルガノイド全体の迅速な取得は、オルガノイド全体の新皮質前駆細胞およびニューロン上のセントロソームおよびPCの両方の検出を可能にする。最後に、かなりの程度の3D空間情報を保持し、PCの生合成と機能の詳細な定性的および定量的分析に必要な高解像度取得を可能にする、厚い自由浮遊オルガノイド切片の免疫染色および除去の手順を詳述します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原発性繊毛(PC)は微小管ベースの細胞小器官であり、細胞外環境からの多数の化学的および機械的手がかりを感知し、伝達する。特に、PCは脊椎動物におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の形質導入のための中心的な細胞小器官である1,2。ほとんどの神経細胞がPCを保有することが長い間示されてきましたが、中枢神経系の形成におけるこのオルガネラの貢献は長い間過小評価されてきました。新皮質の発達に関する研究は、複数の神経幹および前駆細胞(NSPC)の発見につながり、そのすべてがPCを保有しており、その場所は前駆者の運命決定に不可欠であることが提案されている3,4,5,6,7。PCは、NSPCの拡張とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロンの遊走をサポートする放射状グリア足場のアピコ基底極性を含む、正常な脳皮質の発達に必要な細胞メカニズムにとって重要であることが示されています13。加えて、PCは皮質プレートへの接線移動の間に介在ニューロン14、15必要とされる。最後に、大脳皮質におけるニューロンのシナプス結合の確立におけるPCの役割が提案されている16,17。全体として、これらの知見は、脳皮質発達の主要な段階におけるPCの重要な役割を主張し18,19、脳皮質発達の異常の根底にある病理学的メカニズムへのPCの関与を調査する必要性を提起する。

最近の研究は、ヒトモデルと動物モデルにおける皮質発生の間の重要な細胞および分子の違いについての理解を大幅に改善し、ヒトモデルシステムを開発する必要性を強調している。この見解では、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)は、関連する遺伝的および細胞的文脈における疾患病因を研究するための有望なアプローチを表す。付着した2次元(2D)細胞ベースのモデルまたは神経ロゼットは、発達中の大脳皮質に見られるものと同様のNSPCを含み、正しいアピコ基底極性を示すロゼット状の構造に組織化される20,21,22。さらに、三次元(3D)培養システムは、ヒト脳皮質発達の多くの特徴を再現する背側前脳オルガノイドの生成を可能にする23、24、25、26。これら2つの相補的な細胞ベースのモデリングアプローチは、大脳皮質の正常および病理学的発達中のPCの関与を解剖するためのエキサイティングな視点を提供する。

ここでは、神経ロゼットおよび由来NSPCならびに背側前脳オルガノイドの生成および特性評価のための詳細なプロトコルを提供する。また、ソニックヘッジホッグ経路の形質導入を試験し、この経路に関与する重要な分子のダイナミクスを分析することにより、NSPCに存在するPCの生合成と機能を解析するための詳細なプロトコルも提供しています。また、大脳オルガノイドの3D組織を活用するため、 in toto 免疫染色された大脳オルガノイドの3Dイメージングのための簡単で費用対効果の高い方法を設定し、オルガノイド全体の高分解能で、ライトシート顕微鏡により、オルガノイド全体のあらゆる種類の新皮質前駆細胞およびニューロン上のPCを視覚化することができます。最後に、150μmの自由浮遊切片に免疫組織化学を適応させ、その後、共鳴走査型共焦点顕微鏡を用いた透明化と取得により、PCの生合成と機能の詳細な解析に必要な高解像度の画像取得を可能にしました。具体的には、3Dイメージングソフトウェアは、PCの長さ、数、向きなどの形態学的パラメータのその後の分析、ならびに軸索に沿った毛様体成分の信号強度測定によるPCの3D再構成を可能にする。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 新皮質発生の2D hIPS細胞ベースのモデルの生成

  1. 神経ロゼット形成
    1. 大きな規則的なコロニーを保有するhIPSC培養物から始めて、10%未満の分化を示し、80%以下のコンフルエントを示す。
    2. hIPSCを2mLのPBSですすいでください。
    3. Rock阻害剤を添加した2 mLのNSPC誘導培地(NIM+10 μMのY-27632)を加える。
    4. 針を使用して1つの35mm皿から各hIPSCコロニーを手動で解剖し、各コロニーを水平方向および垂直方向に正確に切断し、各コロニーを等しいクラスターに分割するチェッカーボードパターンを作成する。
    5. セルスクレーパーを使用してコロニーを切り離し、超低付着35mmディッシュに移す。
    6. 37°Cと5%CO2の加湿インキュベーターに一晩(ON)浮かべて、胚様体(EB)を形成できるようにします。
      注: 胚様体 (EB) は、浮遊性回転楕円体クラスターまたは hIPSC の集合体として定義されます。
    7. EBをポリL-オルニチン/ラミニン(PO/lam)コーティングされた35 mmディッシュに2 mL NIM + 10 μMのY-27632で移します。
    8. NSPC誘導培地(Y−27632を含まないNIM)を神経ロゼットの形成まで毎日リフレッシュし、約12〜14日を要する。顕微鏡で確認してください。
      注:このステップの後、神経ロゼットを拡張、分化、免疫染色分析のために処理するか、解離させて単離された神経幹および前駆細胞(NSPC)を得ることができます。
  2. 神経ロゼットの拡大と早期分化
    1. 神経ロゼットを針で格子状のパターンに切断し、細胞スクレーパーを使用してクラスターを外す。
    2. ロゼットを、0.5mLのNSPC維持培地(NMM)中のPO/lamコーティングガラスカバースリップ(4〜5ロゼット/ウェル)を含む4ウェルプレートに移す。
    3. プレートを37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
    4. NMM は 20 日目まで 1 日おきに更新します。
    5. 20日目から、0.5mLのサイトカイン中の培養神経ロゼットはNMMを枯渇させ、分化を可能にした。2〜3日ごとに培地をリフレッシュする。
    6. 30日目および40日目(分化の10日目または20日目)に、0.5mLの4%PFA、20分、RTでロゼットを固定する。
  3. 単離されたNSPCのPC生合成と機能解析
    1. NSPC解離
      1. ステップ1.1.8の神経ロゼットを針で格子状のパターンに切断し、セルスクレーパーを使用してクラスターをはがします。細胞を2 mLのNMM中のPO/lamコーティングされた35 mmディッシュに移し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
      2. NMM は、コンフルエントになるまで 1 日おきに更新します (約 5 ~ 7 日)。
      3. 神経ロゼットを取り囲む大きくて透明な細胞を削り取った後、それらを手動で拾い上げ、新鮮なPO / lamコーティングされた35 mm皿に移して、NSPCを豊かにし、非神経細胞タイプを枯渇させる。
      4. すべての汚染細胞タイプを除去するために必要な1つまたは2つの手動継代(必要に応じてステップ1.3.1.3を繰り返す)の後、培地を取り出し、PBSですすいでください。
      5. 300 μLの0.05%トリプシンを加え、ほとんどの細胞が剥離するまで37°Cで5分間インキュベートする。
      6. 10%FBSを含む培地2mL(DMEM+10%FBS)を加えてトリプシンを不活性化した。細胞懸濁液を15mL円錐管に集める。細胞懸濁液を3回上下に軽くピペットでピペットし、細胞凝集塊を分解する。
      7. 300 x g で5分間遠心分離する。
      8. 上清を注意深く吸引し、細胞をNMNに再懸濁する。
      9. 解離したNSPCをNMM中の単一細胞(1 x 105細胞/cm2)としてPO/lamコーティングされたディッシュに播種し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
      10. NMM の NSPC を展開するには、1 日おきに培地を変更します。
        注:NSPCは、分化を避けるために高密度で播種される。
    2. PC生合成解析
      1. 種子はNSPCを100,000細胞/ cm2で解離させ、37°Cの加湿インキュベーターでNMMで5%CO2で2日間インキュベートする。
      2. 培地および飢餓NSPCsをサイトカイン枯渇培地(NSPC飢餓培地、 補足表1)中で48時間吸引する。
      3. RT で 20 分間 4% PFA で NSPC を修正します。
      4. 免疫染色の前にPBSで5分間2回洗浄する。
    3. PC機能解析:SHHシグナル伝達経路
      1. 種子をPO/lamコーティングされた8ウェルチャンバースライド(300 μL)またはT25 ディッシュ(5mL)上で100,000細胞/ cm2でNSPCを解離させ、37°Cの加湿インキュベーター内でNMM中の5%CO2 で2日間インキュベートする。
      2. NSPCをNSPC飢餓培地(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり300μL、T25フラスコに5mL)中で48時間飢えさせる。
      3. SHH経路を誘導するために、組換えSHH(100ng/mL)またはSAG(500nM)を添加した飢餓培地でNSPCをインキュベートする。(8ウェルチャンバースライドのウェルあたり150 μL、T25フラスコに2 mL)を24時間保存した。
      4. 8ウェルチャンバースライドで培養したNSPCを、1ウェルあたり4%PFAの250 μLでRTで20分間固定し、免疫染色分析の前に250 μLのPBSでRTで5分間2回洗浄します。
      5. 培地を取り出し、T25ディッシュで培養したNSPCsをPBSで洗浄した。
      6. 500 μLの0.05%トリプシンを加え、細胞が剥離するまで37°Cで5分間インキュベートする。
      7. 10%FBS(DMEM+10%FBS)を含む培地2mLを加えてトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を15mL円錐管に集めた。
      8. 300 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く吸引して、RNA抽出およびRT-PCR分析の前に-80°Cで凍結保存できるNSPCペレットを得た。

2. 背側前脳オルガノイドの生成

  1. hIPSCの単一細胞培養
    1. まず、分化率が10%未満で、ほぼ1回継代された大きな規則的なコロニーを保有するhIPSC培養物から始めます。セルが 80% 以下のコンフルエントであることを確認します。
    2. コロニーを2mLのPBSで洗浄する。
    3. 500 μL の Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) を加え、37 °C で 5 ~ 7 分間インキュベートします。
    4. GCDRを吸引し、5μMのY-27632を添加したmTeRS1培地を2mL加える。
    5. 細胞を10回穏やかに上下にピペットでピペットし、すべてのコロニーを単一細胞に解離させた。
    6. 細胞をビトロネクチンコーティングされたディッシュ上に移し、37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内でインキュベートする。
      注: 分化実験の前に GCDR を使用して hIPSC を少なくとも 1 回継代し、hIPSC を単一細胞培養条件に適合させます。
  2. 0日目に、hIPSCが低濃度のFGF2およびhIPSCの生存に必要な高濃度の岩石阻害剤を含むEB培地中で胚体を形成できるようにする。これを行うには、次の手順に従います。
    1. コロニーを2mLのPBSで洗浄する。
    2. 500 μL の Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) を加え、37 °C で 5 ~ 7 分間インキュベートします。
    3. GCDRを吸引し、50μMのY-27632を添加したEB培地を1mL加える。1 mL ピペットを使用して細胞を静かに剥離し、15 mL の円錐形チューブに移します。
    4. 50 μMのY-27632を添加した2 mLのEB培地でもう一度すすぎ、残りの細胞を15 mLの円錐形チューブに移す。50 μMのY-27632を添加したEB培地3 mLを円錐管に直ちに加え、5 mLピペットを用いて溶液を穏やかにホモジナイズする。
    5. 解離した細胞を100 x g で5分間遠心分離する。
    6. 上清を穏やかに吸引し、50 μMのY-27632を添加した6 mLのEB培地に細胞を再懸濁する。
    7. 細胞を100 x g で5分間遠心分離する。
    8. 上清を吸引し、50 μMのY-27632を添加した1 mLのEB培地に細胞を再懸濁する。1 mL ピペットを使用して、細胞を単一細胞懸濁液に穏やかに解離させます。
    9. 細胞を再懸濁した直後に、それらを希釈してカウントする。
    10. 適切な量の細胞懸濁液(900,000個の細胞を含む)を、50μMのY-27632および4ng/mLのbFGFを添加した30mLのEB培地に希釈し、溶液を穏やかに混合する。
    11. 9,000細胞/ウェルを超低接着96Uプレート(300 μL/ウェル)にプレートします。EB形成を妨げないようにするには、プレートを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2 で3日目まで培地交換なしでインキュベートします。
  3. 神経誘導(二重SMAD阻害)
    1. 3日目に、EBが300〜400μmを測定し、規則的な境界線を表示するようにします。両方の基準に達した場合、培地の半分(150μL)を二重SMAD阻害剤を含む誘導培地-1と交換し、神経外胚葉分化を示す6日目から7日目までにEBの輪郭を明るくする(補足表2)。
    2. 4日目に、培地の3/4(225μL)を誘導培地-1と交換する。
    3. 6日目および8日目に:誘導培地-1の半分(150μL)をリフレッシュする。
  4. 基底膜マトリックスへのオルガノイド包埋(Day 10)
    1. 10日目に、EBsを成長因子減少基底膜マトリックス(BMM)に埋め込んだ。
      注:このステップでは、ピペッティングを繰り返してオルガノイドの損傷を避けるために、常に滅菌ハサミを使用してピペットチップの開口部を切断してください。
    2. 最初に円錐形のチューブで約15-17個のオルガノイドを移す。EBを落ち着かせて、媒体を取り除きます。50 μLの誘導培地-2を加え、100 μLのBMMを含む微量遠心チューブに移す。
    3. マトリックス-EB混合物を超低アタッチメントプレートのウェルの中央に広げ、EBを分離して融合を防ぎます。
    4. BMMをインキュベーター内で37°Cで45分間固化させます。
    5. 各ウェルに3mLの誘導培地-2を加え、プレートを37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーターに入れた。
      メモ: BMM が室温で固化するので、この手順をできるだけ早く実行してください。
  5. 基底膜マトリックスに埋め込まれたオルガノイドの静置培養
    1. 12日目、14日目:リフレッシュ誘導培地-2。
    2. 16日目:誘導培地-2をリフレッシュし、神経上皮ループの拡大を顕微鏡下で確認する。
  6. 基底膜マトリックスの解離とオービタルシェーカーでの培養
    1. 17日目に、5mLピペットで上下に10回ピペッティングしてBMMからオルガノイドを解離させ、分化培地-1(ビタミンAなし)に移します。栄養吸収を改善するために、37°Cおよび5%CO2 の加湿インキュベーター内で80rpmでオービタルシェーカー上にインキュベートする。
      注:固定培養には別のインキュベーターを使用し、オービタルシェーカー上で培養して、付着性hIPS細胞増殖に有害な振動を避けてください。
    2. 19日目:リフレッシュ分化培地-1。
    3. 21日目:分化培地-1を分化培地-2(ビタミンAを使用)に変更する。
    4. 23日目から35日目まで:2~3日ごとに分化培地-2で培地をリフレッシュする。
    5. 35日目から70日目まで:1%BMMで分化ミディアム2をリフレッシュし、2〜3日ごとにリフレッシュします。
    6. 分化の28、42、および70 +/- 2日後にオルガノイドを収集し、15 mL円錐管上の5 mL 4%PFA中で、4°Cで一晩固定する。
    7. さらに イントト またはフリーフローティング免疫染色分析のために、オルガノイドをPBS中で2回すすぎ、PBS+0.05%アジ化ナトリウム中で4°Cで保存する。
    8. 凍結切片の免疫染色分析のために、4%PFA固定オルガノイドを+4°Cオンで(またはオルガノイドが沈むまで)10mLおよび30%スクロースに浸漬する。凍結包埋マトリックスに埋め込み、凍結切除するまで-80°Cで保存します。

3. 背側前脳オルガノイドの toto 免疫標識、クリアリング、ライトシート取得

  1. 固定
    1. オルガノイドを6ウェルプレートに集め、培地を除去し、2mLの4%PFAで4°Cで一晩固定した。
    2. 室温で2mLのPBS中で3回の洗浄を行う。
    3. オルガノイドを2 mLチューブに移し、2 mLのPBS+0.05%アジ化ナトリウム中で4°Cで保存する。
  2. 透過処理
    1. オルガノイドを0.2%Triton X100を含むPBS1mL中でRTで1時間インキュベートする。これを 2 回実行します。
    2. 0.2% Triton X100および20% DMSOを含む1 mLのPBS中で、37°Cで一晩インキュベートする。
    3. 0.1% Tween20、0.1% Triton X100、0.1% デオキシコール酸、0.1% NP40 および 20% DMSO を含む PBS 1 mL 中、37°Cで一晩インキュベートします。
    4. 0.2%Triton-X100を含む1mLのPBS中で、RTで1時間インキュベートする。これを 2 回実行します。
  3. ブロッキングと免疫標識
    1. 1 mLのブロッキング溶液(PBS、0.2%トリトンX100、6%ロバセラム、10%DMSO)を37°Cでブロックし、オンにします。
    2. 250 μL の PBS、0.2% Tween20、0.1 μg/mL のヘパリン、5% DMSO および 3% ロバ血清で希釈した一次抗体と共に、37°Cで 2 日間インキュベートします。
    3. 0.2% Tween20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で 37 °Cで 1 時間洗浄します。 これを 4 回実行します。
    4. 0.2% Tween20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、37 °C で一晩洗浄します。
    5. 0.2% Tween 20、0.1 μg/mL のヘパリンおよび 3% ロバ血清を含む PBS 250 μL で希釈した二次抗体と共に、37°Cで 2 日間インキュベートします。
    6. 0.2% Tween 20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、ホイール上で RT で 1 時間洗浄します。これを 4 回実行します。
    7. 0.2% Tween 20 および 0.1 μg/mL のヘパリンを含む PBS 1 mL で、一晩、ホイール上で RT で洗浄します。
    8. 1 mL の PBS で RT で 24 時間洗浄します。
    9. 透明になるまで1mLのPBSおよび0.05%アジ化ナトリウム中で+4°Cでストックする。
  4. TDEでのクリアリング(2,2'-チオジエタノール)
    1. オルガノイドを1mLの30%TDE(3mLのTDE+7mLのPBS)中でRTで24時間インキュベートする。
    2. 1 mL の 60% TDE (6 mL の TDE + 4 mL の PBS) を RT で 24 時間インキュベートします。
    3. 1 mL の 80% TDE (8 mL の TDE + 2 mL の PBS) を RT で 24 時間インキュベートします。
  5. ライトシート取得前のオルガノイド埋め込み
    メモ: カスタムメイドのシステムを使用してください。メスで先端を切った1mLの注射器で作られました。
    1. 60%TDE溶液中に100mLの4%低融点アガロースを調製し、2mLチューブにアリコートを調製する。+4°Cで保存します。
    2. オルガノイド包埋の前に、60%TDE中の4%低融点アガロース1.5mLを含む1本のチューブを、液化するまで37°Cの水浴中で予熱する。
    3. 一方、メスを用いて切り落とされた1mLシリンジからなるカスタムメイドの成形システムを用意する。
    4. プランジャーを使用してゲル溶液600μLをシリンジにポンプで送る。
    5. 滅菌ハサミを用いて切断された開口部を拡大したピペットチップを用いて試料を位置決めする。
    6. サンプルがシリンジの下3分の1以内に配置されるように、400μLのゲル溶液をシリンジに充填する。
    7. ゲルを重合させ、取得まで光から保護した4°Cの80%TDE溶液に保存します。
    8. ライトシートの取得には、サンプルチャンバーに添加された80%TDE溶液に20倍の対物レンズを浸漬して、クリアリング法の屈折率を正確に調整できるようにします。
    9. アガロース包埋オルガノイドを含むシリンジを、オルガノイドを対物レンズの前に配置するために操作できる1mLシリンジを収容するように設計された最大のサンプルホルダーに挿入する。
      注:オルガノイド全体のライトシート取得には約5〜10分かかります。

4. 背部前脳オルガノイドの遊離浮遊部の免疫染色および透明化

  1. オルガノイドの固定、アガロースの埋め込み、および切片化
    1. 分化の28、42、および70 +/- 2日後にオルガノイドを6ウェルプレートに集め、2mLの4%PFA中で4°Cで一晩固定する。
    2. 2 mL の PBS で 2 回すすぎ、2 mL の PBS + 0.05% アジ化ナトリウムで 4 °C で保存します。
    3. 固定したオルガノイドをプラスチック埋め込み型(7 x 7 mm)の4%低融点アガロースに埋め込む。プラスチック金型からアガロースブロックを慎重に取り外し、ビブラートーム段階に接着します。
    4. ビブラトームを用いて包埋オルガノイドを切片化し、切片の損傷を避けるためにペイントブラシを用いて500μLのPBSを含む24ウェルプレートのウェルに移して150μmの自由浮遊切片を得た。
      注:低融点アガロースは、その融解温度が約60°Cしかないため、推奨されます。 PBS溶液中に4%低融点アガロースを調製し、オルガノイド包埋前にウォーターバス中で37°Cのすぐ上に冷却したままにする。
  2. 透過処理、ブロッキング、免疫染色
    1. 切片を0.3% Triton X100を含む500 μLのPBS中で、RTで、攪拌下で、20分間インキュベートする。これを3回行います。
    2. 切片を、0.3% Triton X100および5% 無脂乳を含む 500 μL の PBS に RT で、攪拌下、2 時間インキュベートします。
    3. 切片を250 μLの一次抗体溶液(PBS + 0.3% Triton X100 + 1% 無脂乳)中、攪拌下、+4°Cで一晩インキュベートする。
    4. 切片を500 μLのPBSでRTにて、攪拌下で20分間洗浄する。これを 4 回実行します。
    5. 切片を250 μLの二次抗体溶液(PBS + 0.3% Triton X100 + 1%無脂乳)中でRTで、攪拌下、2時間インキュベートする。
    6. 切片を500 μLのPBSでRTにて、攪拌下で20分間洗浄する。これを 4 回実行します。
    7. 切片を500 μLのPBSに入れ、透明になるまで+4°Cで保存します。
  3. TDEでのクリアリング(2,2'-チオジエタノール)
    1. 切片を 500 μL の 30% および 60% TDE でそれぞれ 1 時間インキュベートし、次いで RT で一晩 80% TDE の 500 μL でインキュベートします。
    2. クリアした切片を +4 °C で取得するまで 500 μL の 80% TDE に保存します。
  4. 共振走査共焦点による取得前の自由浮遊セクションの取り付け
    1. 密閉チャンバにフリーフローティングセクションを取り付け、サンプルを80%TDE溶液に維持し、共焦点顕微鏡の電動XYステージに適応するように設計されています。
    2. チャンバーシステムに1つの丸いカバースリップを入れます。
    3. クリアした免疫染色部を絵筆で慎重に移します。
    4. チャンバーを80%TDE溶液で満たします。
    5. 2つの標準カバースリップに加えて、1つのセカンドラウンドカバースリップとシリコンシールを追加します。
    6. チャンバーのねじ込みリングをねじ込み、システムを完全に密閉します。

5. ライトシートと共鳴走査共焦点解析

  1. 免疫染色されたサンプル全体の3D可視化と分析を可能にするソフトウェアを使用して、光シートおよび共鳴スキャン取得を処理します。
    注:このようなソフトウェアを使用すると、巨大なデータをすばやく開き、スナップショットやアニメーションを簡単に作成できます。これにより、サンプルを異なる向きで移動し、XYとYZなどの異なる向きの2Dスライサーツールのおかげで2Dビューを生成できます。
  2. セントロソームと原発性繊毛の両方を自動的に検出するには、スポットウィザードを使用して、病理学的状態と対照状態の両方でそれらの数を定量化できます。
  3. PCを3D再構成して長さを正確に測定するには、フィラメントウィザードを使用してPCの始点を手動で固定し、ソフトウェアは蛍光信号を使用してPCを正確に再構築します。

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結果

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一次繊毛の生合成と機能を研究するための2D hIPS細胞ベースのモデル
ここで詳述したプロトコールは、以前に発表された研究から適応されています20,21,22。このプロトコルは、発達中の新皮質に見られるものと同様の新皮質前駆細胞およびニューロンを含む神経ロゼット構造の生成を可能にする。詳細な検証は、特定のメーカーを用いた従来の免疫染色分析によって行うことができます3。例えば、頂端前駆細胞(AP)はSOX2およびPAX6で二重染色されるべきであり、中間前駆細胞(IP)はTBR2/EOMES染色によって明らかにされ、そして早期新皮質ニューロンはCTIP2染色によって明らかにされるべきである(図1A-C)。このような神経ロゼット様構造モデルは、有...

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ディスカッション

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PCは現在、NSPCの拡大とコミットメント8,9,10,11,12、ならびにニューロン移動13,14およびシナプト形成16,17を含む、正常な脳皮質発達中の重要なステップを調節する重要な細胞小器官と見なされています16,17。.動物モデルまたはヒト胎児大脳組織における分析に加えて、新皮質発達の非常...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Agence Nationale de la Recherche(ANR)からS.T.(ANR-17-CE16-0003-01)およびN..B.B.(ANR-16-CE16-0011およびANR-19-CE16-0002-01)への助成金によって支援されました。LBは、Investissements d'avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01)とFondation Bettencourt Schueller(MD-PhDプログラム)の下でANRによってサポートされています。イマジン・インスティテュートは、Investissements d'avenirプログラム(ANR-10-IAHU-01、CrossLabプロジェクト)の下で、また第2次Investissements d'Avenirプログラム(ANR-17-RHUS-0002)の一環として、ANRからの国家資金によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトéタノール (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAttach 希釈バッファーStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック15575020
EGF、25µgサーモフィッシャーPHG0315
FGF2 , 25µgサーモフィッシャーPHG0264
ジェントル セル解離試薬StemCell Technologies7174
インスリンサーモフィッシャー サイエンティフィック12585014
ノックアウト セラムサーモフィッシャー サイエンティフィ10828028
ラミニン (1mg)サーモフィッシャー23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
マトリゲル成長因子還元コーニング354230
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
神経基礎中型サーモフィッシャー21103049
オービタルシェーカーDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
組換えヒトBDNF 10 & micro;g幹細胞技術78005
組換えヒトFGF-基本的なPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSC-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
スクロースSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
SuppléメントN2-(100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック17502048
TDE 2,2'-チオジエタノールSigmaAldrich 166782-500G
ビトロネクチンStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BアブカムAb1366481/200e
ARL13Bプロテインテック17711-1-AP1/500e
CTIP2アブカムAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-カドヘリンBD トランスダクションラボ 6109211/500e
P-ビメンチンMBLD076-31/500e
PAX6バイオレジェンドPRB-278P1/200e
PCNTアブカムAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary 抗体
ロバ 抗ウサギ AF488サーモフィッシャーサイエンティフィックA212061/500e
ヤギ抗マウス AF555サーモフィッシャーサイエンティフィックA214221/500e
ヤギ抗マウス AF647サーモフィッシャーサイエンティフィックA212361/500E
ヤギの抗ラットAF555モフィッシャーサイエンティフィックA214341/500e
ック サー

参考文献

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タグ

Dual SMADSonic Hedgehog

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