筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

Summary

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro 培養ニューロンの生細胞イメージングを使用して、シナプス前カルシウム流入およびシナプス小胞膜融合のダイナミクスのリアルタイムモニタリングを可能にする。

Abstract

神経変性の前に、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および/または前頭葉性認知症(FTLD)患者の運動および認知障害の原因は、ニューロンと運動ニューロンおよび筋肉との間のコミュニケーションの機能不全である。シナプス伝達の根底にあるプロセスは、膜脱分極依存性シナプス小胞融合およびシナプスへの神経伝達物質の放出を含む。このプロセスは、シナプス小胞が存在するシナプス前終末への局在的なカルシウム流入によって起こる。ここで、プロトコルは、培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス小胞エキソサイトーシスおよびシナプス前末端カルシウム流入ダイナミクスを確実に報告する蛍光ベースのライブイメージング方法論を記載する。

シナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素を用いて、シナプス小胞放出が解明される。一方、カルシウムの侵入を研究するために、遺伝子コードされた蛍光レポーターであるGcamp6mが使用される。我々は、ニューロン活性を模倣するために、高い塩化カリウム媒介性脱分極を採用している。シナプス小胞エキソサイトーシスを明確に定量するために、我々は、時間の関数として正規化されたスチリル色素蛍光の損失を測定する。同様の刺激条件下では、カルシウム流入の場合、Gcamp6m蛍光が増加する。この蛍光変化の正規化および定量化は、スチリル色素プロトコールと同様の方法で行われる。これらの方法は、蛍光標識された変異タンパク質のトランスフェクションベースの過剰発現と多重化することができる。これらのプロトコルは、初代げっ歯類皮質および運動ニューロンを利用して、 FUS−ALSおよび C9ORF72−ALSのモデルにおけるシナプス機能障害を研究するために広く使用されている。これらのプロトコルは、ニューロン通信を改善し得る化合物の迅速なスクリーニングを容易に可能にする。したがって、これらの方法は、ALSの研究だけでなく、神経変性および発達神経科学研究のすべての分野にとって貴重です。

Introduction

実験室での筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデリングは、症例の80%以上が圧倒的に散発的な性質^{を持っている1}と、疾患の原因であることが知られている膨大な数の遺伝子変異2のために、他に類を見ないほど困難になっています²。それにもかかわらず、ALSのすべての症例は、完全なニューロン変性の前に、シナプス前運動ニューロンとシナプス後筋細胞との間に機能不全のコミュニケーションがあるという統一的な特徴を共有しています^3,4。臨床的には、患者が残りの上部および下部運動ニューロンの接続性を失うにつれて、それらは疾患全体にわたってニューロンの過興奮性および低興奮性の特徴を呈し⁵、⁶、⁷、^8、9、これらのシナプスへの複雑な根底にある分子変化を反映しており^、ALS研究者として理解しようとしている。

複数のトランスジェニックモデルが、SOD110、FUS11,12、C9orf7213、¹⁴、¹⁵、¹⁶、およびTDP4317,18,19を含むALS原因遺伝子変異の発現とともに神経筋接合部の劣化および解体が起こることを実証している。 シナプスブートン、脊椎密度、シナプス前/シナプス後組織の評価を含む形態学的評価を通じて。機構的には、1930年代にコール、ホジキン、ハクスリーの画期的な論文が発表されて以来、in vitro細胞培養または組織スライス調製物のいずれかにおいて、電気生理学的手法を通じてシナプス応答を評価することも可能であった²⁰。これらの戦略を通じて、ALSの多くのモデルはシナプス伝達欠損を実証している。例えば、TDP43の変異変異体は、NSC-34(脊髄x神経芽腫ハイブリッド細胞株34)の運動ニューロン様細胞²¹において発火頻度を増強し、活動電位閾値を低下させる。この同じ変異はまた、マウスモデルにおける行動運動欠損の発症前に神経筋接合部(NMJ)で機能不全のシナプス伝達を引き起こす²²。変異型FUS発現は、自発運動障害前のFUS-ALSのショウジョウバエモデルにおいてNMJにおけるシナプス伝達の減少をもたらすことが以前に示された¹¹。C9orf72増殖キャリアに由来する誘導多能性幹細胞を用いた最近の報告は、シナプス小胞の容易に放出可能なプールの減少を明らかにした²³。全体として、これらの研究や他の研究は、ALSの疾患関連モデルにおけるシナプスシグナル伝達の根底にあるメカニズムのより包括的な理解を構築することの重要性を強調しています。これは、ALSの病態生物学を理解し、患者のための潜在的な治療標的を開発する上で極めて重要である。

電流および電圧クランプ細胞の方法は、コンダクタンス、静止膜電位、および個々のシナプスの量子的含有量などの膜特性を決定する上で非常に貴重であった^20,24。しかし、電気生理学の重大な限界の1つは、それが技術的に困難であり、一度に単一のニューロンからの洞察しか提供しないことです。生細胞共焦点顕微鏡は、特異的蛍光プローブと相まって、ニューロンのシナプス伝達を時空間的に調査する機会を提供する^25,26,27。ニューロン興奮性の直接的な尺度ではないが、この蛍光アプローチは、シナプス機能の2つの分子相関、すなわちシナプス小胞放出およびシナプス末端におけるカルシウム過渡現象の相対的測定を提供することができる。

活動電位がニューロンのシナプス前終末領域に到達すると、カルシウム一過性が誘発され、電気信号から神経伝達物質放出の過程への移行が容易になる²⁸。これらの領域に局在する電位依存性カルシウムチャネルは、カルシウムシグナル伝達を厳密に調節して、神経伝達物質放出の動態を調節する²⁹。カルシウム過渡現象の最初に報告された蛍光ベースの記録は、二波長指示薬Fura-2 AMまたは単一波長色素Fluo-3 AM30^、31、32のいずれかを使用して実施された。これらの色素は当時、大きな新しい洞察を提供していましたが、細胞内の非特異的な区画化、標識細胞からの能動的または受動的な色素損失、フォトブリーチング、長期間にわたって画像化された場合の毒性など、いくつかの制限に苦しんでいます³³。過去10年間で、遺伝的にコードされたカルシウム指標は、様々な形態のニューロン活動を画像化するための主力製品となっている。これらの指標は、修飾蛍光タンパク質と、^Ca2+イオンの結合後に蛍光強度を急速に切り替えるカルシウムキレートタンパク質とを組み合わせる³⁴。これらの新しい指標の適用は広範であり、in vitroおよびin vivo設定の両方で細胞内カルシウム過渡現象の視覚化をはるかに容易にすることを可能にする。GCaMPとして知られるこれらの遺伝的にコードされたレポーターの1つのファミリーは、現在広く利用されている。これらの指標は、C末端カルモジュリンドメインを含み、続いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を含み、N末端カルモジュリン結合領域によってキャップされている^35、36。カルモジュリンドメインへのカルシウム結合は、カルモジュリン結合領域との相互作用を誘発し、タンパク質全体の構造における立体構造変化およびGFP部分の蛍光の実質的な増加をもたらす^35,36。長年にわたり、このレポーターファミリーは、それぞれがわずかに異なる特性を有する特定の動態(低速、中速、および高速)を有する特定のカルシウム過渡現象について、異なる読み出しを可能にするために、いくつかの進化を遂げてきた^37,38。ここで、レポーターGcaMP6の使用が強調されており、これは、インビボおよびインビトロの両方のニューロンにおける単一活動電位および樹状カルシウム一過性を検出することが以前に示されている³⁷。

シナプス前領域のカルシウム一過性はシナプス小胞融合事象を誘発し、シナプスへの神経伝達物質放出を引き起こし、シナプス後細胞におけるシグナル伝達事象の開始を引き起こす^28,39。シナプス小胞は、細胞が恒常的に安定した細胞膜表面積および容易に放出可能な融合可能な膜結合小胞のプールを維持するので、急速に放出され、リサイクルされる⁴⁰。ここで使用されるスチリル色素は、脂質膜に対して親和性を有し、周囲の脂質環境の秩序に基づいてその発光特性を特異的に変化させる^41、42。したがって、これは、シナプス小胞のリサイクルを標識し、ニューロン刺激後に後に放出されるこれらの小胞のその後の追跡のための理想的なツールである^41,42。生成および最適化されたプロトコルは、Gaffieldらによって最初に記述された概念の適応であり、スチリル色素標識シナプス小胞穿刺を経時的に連続的に視覚化することを可能にする⁴¹。

ここでは、2つの関連する蛍光ベースの方法論が記載されており、シナプス伝達に関与する特定の細胞事象を確実に報告する。培養ニューロンにおける脱分極媒介シナプス前終末カルシウム流入およびシナプス小胞エキソサイトーシスのダイナミクスをプローブするためのプロトコルが定義されている。ここで、方法および代表的な結果は、これらの細胞型を用いた公表された研究があるように、インビトロモデル系として原発性げっ歯類皮質または運動ニューロンを使用することに焦点を当てている^43,44。しかし、これらの方法は、分化したヒトⁱ³皮質様ニューロン⁴⁵にも適用可能であり、現在、当研究室で進行中の実験では、両方のプロトコルでも成功しています。一般的なプロトコルは、図1に示すステップワイズ線形形式で概説されています。要するに、神経突起におけるカルシウム動態を研究するために、成熟ニューロンをプラスミドDNAでトランスフェクトし、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下で蛍光レポーターGCaMP6mを発現させる^37、46。トランスフェクトされた細胞は、低レベルの基底緑色蛍光を有し、カルシウムの存在下で増加する。関心領域は、我々の操作全体を通して蛍光変化を監視するために指定される。これにより、カルシウムの高度に空間的および時間的に局在する変動を測定することができます^37,46。シナプス小胞の融合と放出を評価するために、成熟ニューロンはシナプス前細胞で神経伝達物質でリサイクルされ、改質され、リロードされるにつれてシナプス小胞膜に取り込まれたスチリル色素をロードされる^{41,42,43,47,48}。この目的のために使用されている現在の色素は、神経突起に沿ってシナプス小胞を標識し、Kraszewskiらによるスチリル色素とシナプトタグミンの共染色によって示されたように、ライブイメージング実験においてこれらの領域の代理として使用されている⁴⁹。ここにも実施された同様の染色の代表的な画像が含まれる(図2A)。これまでの研究者らは、神経筋接合部および海馬ニューロンにおけるシナプス小胞ダイナミクスを報告するために、このような色素を広範囲に使用してきた48,49,50,51,52,53,54,55,56.色素を負荷した小胞の点状領域を選択し、小胞放出後の蛍光強度の低下をモニタリングすることにより、刺激後の機能的シナプス伝達能力および放出の時間的ダイナミクスを研究することができる⁴³。両方の方法において、高濃度の塩化カリウムを含む培地が使用され、細胞を脱分極させてニューロン活性を模倣する。イメージングパラメータは、ベースライン正規化とそれに続く刺激キャプチャ期間にまたがる1秒未満の間隔をキャプチャするように指定されます。各時点での蛍光測定値が決定され、バックグラウンドに正規化され、実験期間にわたって定量化されます。カルシウム流入媒介性GCaMP6m蛍光増加または効果的なシナプス小胞エキソサイトーシスチリル色素放出蛍光減少は、この戦略を通して検出することができる。これら2つのプロトコルの詳細な方法論的セットアップとパラメータ、およびそれらの利点と制限事項に関する議論については、以下で説明します。

図 1: 一般的なプロトコル プロセス全体の視覚的レンダリング。 (1)初代げっ歯類ニューロンを単離し、選択した成熟時点まで インビトロで 培養する。(2)シナプス活性のレポーターとしてGCaMP DNAまたはスチリル色素を導入する。(3)ライブイメージング搭載共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを用いたイメージングパラダイムの設定ベースライン記録期間を開始します。(4)細胞がまだライブ画像キャプチャを受けている間、高いKCl浴灌流を介してニューロンを刺激する。(5)蛍光強度測定値を経時的に評価し、カルシウム過渡現象またはシナプス小胞融合を測定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

この研究で実施されたすべての動物処置は、ジェファーソン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。

1. 胚性ラット皮質由来のニューロンの初代培養

注:初代皮質ニューロンは、前述のようにE17.5ラット胚から単離される^57,58。この培養プロトコルの成功により、株の偏りは存在しないようです。このメソッドについては、以下で簡単に説明します。詳細については、前述の記事を参照してください。

1. 妊娠中の雌ラットを_CO2 吸入によって安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼による二次確認を行う。
2. 胚を採取し、氷冷した20 mM HEPS緩衝ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で脳を単離する。外側の皮質の殻から、線条体と海馬を分離して捨てます。皮質を集める。
3. 皮質から髄膜を除去するために細かい鉗子を使用してください。これを行うには、穏やかな圧力を使用して、閉じた鉗子の1組で皮質を所定の位置に保持します。
   注:2番目の鉗子のペアを秒針にして、髄膜をつまみます。つまんだペアで転がるような動きで髄膜を剥がします。閉じた鉗子で再配置し、髄膜が完全に除去されるまで必要に応じて繰り返す。
4. 皮質をHBSS中の10μg/mLのパパインと共に37°Cで4分間インキュベートする。
5. HBSSで3回洗浄し、次いで、火で磨かれたガラスパスツールピペットで穏やかに5〜10回粉砕し、均一な細胞懸濁液を得た。
   注:泡を避けてください。ピペットを細胞懸濁液内に保持する。
6. B27サプリメント(2%)およびペニシリン - ストレプトマイシンを含む神経基礎培地中の75,000細胞/皿の密度でコーティングされた100μg/mLのポリD-リジンコーティングされた35mmガラス底ディッシュ上のプレートニューロン。

2. 胚性ラット脊髄由来の運動ニューロンの初代培養

注:初代運動ニューロンは、前述のようにE13.5ラット胚から調製され、ほとんど改変されていない^59,60。この培養プロトコルの成功により、株の偏りは存在しないようです。このメソッドについては、以下で簡単に説明します。詳細については、上記の記事を参照してください。

1. ステップ1.1のように妊娠中の雌ラットを安楽死させる。
2. 胚から10〜20個の脊髄を解剖し、2対の鉗子を使用して機械的に小さな断片に分割し、それぞれつまんで引っ張る。
3. 0.025%トリプシン中で8分間インキュベートし、続いてDNaseを1mg/mLで添加した。
4. 470 x g の4% w/v BSAクッションを4°Cで5分間、休憩なしで遠心分離します。
5. 遠心分離機は、10.4%(v/v)密度勾配培地(材料表を参照)クッションを通してブレーキなしで4°Cで830 x gで55分間細胞をペレット化しました。視覚インターフェースで運動ニューロンバンドを前方に持ち越す。
   メモ: すべての細胞を確実に捕捉するには、密度勾配ステップにはフェノールフリー培地を使用し、他のすべてのステップにはフェノール含有培地を使用します。密度勾配と解離媒体の界面は、色差に基づいて容易に識別可能である。
6. スピンは、別の4% w/v BSAクッションを470 x g で4°Cで5分間、ブレークなしでバンドを収集しました。
7. B27サプリメント(2%)、グルタミン(0.25%)、2-メルカプトエタノール(0.1%)、ウマ血清(2%)、およびペニシリン - ストレプトマイシンを含む完全な神経基礎培地中に精製運動ニューロンを再懸濁する。
8. 50,000細胞/35mmのガラス底ディッシュの密度で、100μg/mLのポリリジンおよび3μg/mLのラミニンコーティングされたカバースリップ上のプレートニューロン。

3. ニューロントランスフェクション

注:このステップは、GCaMPカルシウムイメージングを受けるニューロンおよび/またはシナプス評価の前に目的の外因性DNAプラスミドまたはRNAが導入されるニューロンに対して行われる。対照的に、スチリル染料は、イメージングセッションの直前にロードされ、セクション6で扱われる。以下の要約は、提示された例の一次げっ歯類ニューロンに使用されるトランスフェクションプロトコルであるが、ユーザーのニーズに容易に適合および最適化することができる。

1. 培養された初代皮質ニューロンのトランスフェクションは 、インビトロで 12日目(DIV 12)に行われ、運動ニューロンは インビトロで 7日目(DIV 7)にトランスフェクションされます。
   注:次の手順はすべて、無菌バイオセーフティキャビネット内で行われます。
2. トランスフェクション試薬を用いて500ngのGCaMP6mを体積比1:2の割合でトランスフェクションする。コトランスフェクションの場合は、合計 1.25 μg の総 DNA/ディッシュを追加し、この DNA 対試薬比を維持します。
   注:図示の実験例では、C9orf72-ALS結合ジペプチド、変異型FUSタンパク質などを発現させるために、目的のALS/FTD関連プラスミド750ngをトランスフェクトしています。同時トランスフェクトプラスミドの蛍光タグがGCaMPイメージングのFITCチャネルと競合しないことを確認します。同様に、スチリル色素イメージングを行う場合は、同時トランスフェクトプラスミドがイメージングの TRITC チャネルと競合しないようにします。シナプトフィジン-GCaMP3の使用は、このプロトコルにおいても同様に有効である。したがって、このプラスミドを同量トランスフェクトし、セクション7で通常どおりすべての手順に従います。
3. DNAトランスフェクション試薬複合体を室温で10分間インキュベートする。
4. インキュベートした複合体を、渦巻きながらニューロンに静かに加える。皿を37°Cの_CO2 インキュベーターに45〜60分間戻します。
5. DNAトランスフェクション試薬複合体を含む培養培地全体を除去し、それを予め馴化および新鮮なニューロン培地の50〜50体積単位の調製物と交換する。その後、イメージングまで48時間、細胞を_CO2 インキュベーターに戻します。

4. 緩衝液およびスチリル色素原液の調製

1. 表1にリストされている成分を使用して、イメージング前に低および高aCSF溶液を新鮮にします。使用前に両方のバッファー溶液をろ過してください。
   注:_CaCl2二水和物は、貯蔵時にCa(OH)₂を形成する可能性がある。最大限の効果を得るには、常に最近開いた容器を使用してください。これが不可能な場合は、Ca(OH)₂を外部表面から除去し、最大の溶解性を確保するために、CaCl2添加前に溶液をガス状の_CO2で5分間炭酸化することができます。このステップを踏む場合は、過度の炭酸化によってCa(_HCO3)₂が形成されるため、得られた溶液のpHを7.4のpH値に維持するように調整します。

低 KCL aCSF バッファー (pH 7.40 ~ 7.45)
試薬	濃度
ヘーペス	10ミリオンメートル
ナクル	140ミリオンメートル
ティッカー	5ミリオン
グルコース	10ミリオンメートル
CaCl2 2H2O	2ミリオンユーロ
マグネシウムCl2 4H2O	1 ミリオン
高KCL aCSF緩衝液(pH 7.40~7.45)
試薬	濃度
ヘーペス	10ミリオンメートル
ナクル	95ミリオンメートル
ティッカー	50ミリオンメートル
グルコース	10ミリオンメートル
CaCl2 2H2O	2ミリオンユーロ
マグネシウムCl2 4H2O	1 ミリオン

表1:人工脳脊髄液(aCSF)緩衝液の組成。 この表には、ニューロンをイメージングおよび刺激しながら使用される低および高KCl人工脳脊髄液緩衝液を調製するための成分が含まれています。準備手順については、セクション 4 を参照してください。

2. 100μgの色素バイアルを採取し、蒸留水または神経基礎培地で10mMの原液濃度に再構成することにより、スチリル色素ストック溶液を調製する。

5. 顕微鏡と灌流システムのセットアップ

注:ガラス底のシャーレをイメージングするには、灌流の柔軟性と高開口数の油浸漬対物レンズの使用のために、倒立共焦点蛍光顕微鏡が好ましい。代表的な結果の項で詳述した例の撮像に用いる共焦点顕微鏡、カメラ、対物レンズについては、材料表を参照されたい。

1. インキュベーターシステム結合ステージマウントを使用して、一定の5%_CO2 レベルで37°Cですべての実験を実行します。
2. 共焦点ソフトウェアを使用して画像取得を制御します。イメージングセッションの開始時に集録設定を最適化して励起電力とゲインを選択し、フォトブリーチングなしで信号を最適に視覚化します。
   1. 励起パワー、露光時間、検出器ゲイン、フレームレートをすべてのサンプルで一定に保ちます。アスペクト比512 x 512、フレームレート2 images/sを使用してタイムラプスイメージングを実行し、染料の漂白を最小限に抑えます。
      注:プンクタははっきりと見えるはずですが、レーザー強度は漂白や光毒性を避けるために可能な限り最小限に設定する必要があります。共焦点開口を最も狭い設定に設定して、神経突起内の蛍光穿刺の最適な分解能を達成する。露光時間は200ms以下に設定され、サンプル間で一貫しています。使用したカメラの最大撮影速度は2画像/秒でした。より高速なカメラを使用すると、より多くの画像が撮影できます。可能であれば、時間的なイメージング設定を選択する必要があります。
3. 共焦点ソフトウェアを使用したイメージングには、FITCを使用したGcamp6m/Gcamp3およびTRITCを使用したスチリル色素の蛍光励起/ダイクロイック/発光フィルターの組み合わせをそれぞれ選択します。
4. タイムラプスイメージング中に共焦点イメージング取得ソフトウェアの完璧なフォーカス機能を使用して、 zドリフトを回避します。
   メモ: イメージングの速度が速いため、1 つの平面がイメージ化されます。実験中にzドリフトがないことを確認することは非常に重要です。
5. 画像取得パネルの 「時間 」タブを選択して、記録期間と間隔を設定します。
   1. フェーズ #1 を間隔 500 ミリ秒、期間 3 ~ 5 分に設定します。
   2. フェーズ #2 を間隔 500 ミリ秒、期間 5 分に設定します。
      注:フェーズ#1はベースライン記録に、フェーズ#2は刺激期間にそれぞれ対応します。
6. バルブ制御システムとチャネルマニホールドを用いてaCSF用の重力灌流装置を組み立てる。
   1. 装置の上部にある 50 mL シリンジに高 KCl ( 表 1 を参照) をロードし、チューブがシステム内を通します。流量を1mL/minに設定します。
7. ニューロンを含む35mmのガラス皿を共焦点イメージングステージにロードし、灌流チューブの端を皿の端に置きます。イメージングするフィールドを選択します。

6. シナプス小胞放出のスチリル色素イメージング

1. 細胞を低KCl aCSF( 表1参照)中で37°Cで10分間、トランスフェクション後48時間インキュベートする。
2. 一次皮質または運動ニューロンをスチリル染料でガラス底のペトリ皿に負荷する。
   1. 吸引により低KCl aCSFを除去する。
   2. ピペットを使用して、50 mM KClを含むaCSF中の10 μMのスチリル色素で暗所でニューロンを5分間ロードします。
   3. ローディング溶液を除去し、ニューロンを低KCl aCSFに10分間浴びせて、非特異的色素ローディングを排除します。
3. 35 mm のガラス底ディッシュをイメージングステージに置き、倒立共焦点顕微鏡の 20 倍の空気対物レンズまたは 40 倍の油浸対物レンズの下で観察します。
   注: GFP タグ付きプラスミドを同時トランスフェクトした細胞の場合、GFP 蛍光を使用してトランスフェクトされた細胞の位置を特定します。
4. 546nmレーザーを用いてスチリル色素を励起し、630-730nm(TRITC)バンドパスフィルターを用いて発光を収集する。
5. イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせます。次に、明視野、TRITC、および蛍光マーカーチャネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。
6. 集録ソフトウェアで 今すぐ実行 を開始します。基礎記録を3〜5分間実行して、色素強度の変動がある場合は除外します(フェーズ#1)。
   注:色素強度の低下がシナプス小胞の放出によるものであり、受動的な色素拡散またはフォトブリーチングによるものではないことを確認することが不可欠です。この3〜5分の予備刺激期間は、安定した維持された色素強度レベルをもたらすはずである。この記録の最後の30秒は、各ROIの平均ベースライン蛍光値を決定するために使用される。実験条件を評価する前に、意図した取得設定を使用して約10分間の連続記録の追加非刺激条件も実行して、レーザー設定を使用して安定した蛍光値を長期間確保することもできます。
7. フェーズ #2 への切り替えで、灌流システムのボタンの On をトリガーします。次に、50mM KClをニューロンに絶えず灌流して、色素のアンロードを容易にします(フェーズ#2)。
   1. KCl添加後300秒間録音を行います。この後、取得は停止します。灌流システムの オフ スイッチをトリガーします。
8. 実験を保存し、以下のセクション8で説明するように共焦点ソフトウェアを使用してデータを分析します。
   注:実験はこの時点で停止され、分析は後で実行できます。細胞が目的のタンパク質の発現のためにトランスフェクションを必要としない場合において、このプロトコールは、シナプスアンロードの機能性を調べようとするときに 、インビトロで 任意の時点で実施され得る。適切なシナプスアンロードを確実にするために対照細胞の試験に続いて、実験者はバイアスを最小限に抑えるために試験された各皿の遺伝的または薬理学的条件に盲検化されるべきである。

7. Gcamp6mカルシウム過渡現象の蛍光イメージング

1. セクション3に示すように、35mmのガラス底ディッシュで培養した初代げっ歯類皮質ニューロンを500ngのGcamp6mでトランスフェクトする。
   注:必要に応じて、赤色または遠赤色の範囲の蛍光タグを含む目的のプラスミドでニューロンを同時トランスフェクトします。
2. トランスフェクション後15分間48時間、低KCl aCSFでニューロンをインキュベートし、次いでディッシュをイメージングプラットフォーム上にマウントする。
3. FITCフィルター(488nm)と20倍または40倍の対物レンズを使用してGCaMP6m蛍光を視覚化します。
4. イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせます。次に、明視野、FITCおよび蛍光マーカーチャンネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。
5. 集録ソフトウェアで 今すぐ実行 を開始します。ベースライン記録を5分間行い、次いで、スチリル色素実験のためのセクション6に記載したのと同じ方法で50mM KCLを含むaCSFで灌流する。
   注:このイメージングの目的は、誘発されたカルシウム過渡現象を測定することです。ニューロンが刺激前期間中に基礎発火活性およびカルシウムフラックスを有する場合、それはデータ分析において使用されない。代わりに、安定したバックグラウンド蛍光を有する細胞のみが使用される。刺激後の期間は、追加の連続的な高KCl灌流の有無にかかわらず、カルシウム過渡現象のために60分に延長することもできる。
6. 実験を保存し、以下のセクション8で説明するように共焦点ソフトウェアを使用してデータを分析します。実験はこの時点で停止し、分析は後で実行することができます。
   注:細胞が目的のタンパク質の発現のためにトランスフェクションを必要としない場合、このプロトコールは、カルシウム過渡現象を調べるために インビトロで 任意の時点で実施され得る。カルシウム一過性の測定を確実にするために対照細胞を試験した後、実験者は、バイアスを最小限に抑えるために試験された各皿の遺伝的または薬理学的条件に盲検化されるべきである。

8. 画像解析

1. 共焦点ソフトウェアでタイムラプス画像を開きます。
2. コマンドシリーズによるタイムラプス系列の画像を整列させる: 画像|処理|現在のドキュメントを整列させます。 「最初のフレームに揃える」を選択します。
3. ROI選択ツールを使用して神経突起に沿った関心領域(ROI)を選択し、画像フレームの右側に豆形のアイコンを表示する(図3B)。また、バックグラウンド蛍光強度を表すROIをマークする。
   注:ROIは、明視野静止画によって示されるニューロントラックに沿って明確に分離された穿刺の領域を選択することによって選択される。ニューロンごとに少なくとも5つのROIが分析のために選択される。背景ROIは、神経突起を含まない視野の領域において選択される。
4. 次のコマンドシリーズを使用して、選択したROIの生蛍光を経時的に 測定します:|測定時間測定。
   1. 時間測定パネルの上部で測定機能を開始します。経時的な生蛍光のグラフ表示(図3C)と定量データの両方が生成されます。
      注:各データポイントは、その特定の測定時点に関連付けられたフレームのそのROIの生蛍光を表します。
5. 生の蛍光強度を表計算ソフトにエクスポートします。
6. 各ROIを個別に分析します。まず、各時点における対象のROI強度からバックグラウンドROI強度を差し引くことによってデータを正規化する。
   1. 各特定の時点におけるバックグラウンドROIから生蛍光値を取り、その時点における目的生強度値のROIからこれを差し引く。
      注:これは、基礎段階と刺激段階の両方の記録期間全体に対して行われます。
7. ベースラインの最後の30秒間の関心強度の平均ROIを決定します。
   1. ステップ8.6で生成された正規化された生の基礎値を、3〜5分の基礎記録期間の最後の30秒から平均します。
      注: 基本記録の全期間を使用して、この値を生成できます。ただし、この値が安定して維持されるため、最後の 30 秒の 60 時点は、全体を表すのに十分なサンプリング サイズになります。
8. このベースライン値を各時点での正規化された強度値と比較し、蛍光の変化(ΔF)値を発生させる。
   1. ステップ8.7から値を取り、ベースライン蛍光の平均値を差し引く。このステップとその後のステップは、記録期間全体、基礎フェーズと刺激フェーズの両方に対して実行します。
9. ベースライン蛍光値に関するこの変化を計算し、蛍光/ベースライン蛍光(ΔF/F)の変化を生成します。これを行うには、ステップ8.8の値を取得し、それを平均ベースライン蛍光値で除算します。
10. 最後に、開始点の値を 1 に設定して、時間の経過と共に増減を簡単にグラフィカルに視覚化できるようにします。
    1. ステップ 8.9 で生成された値を取得し、1 を加算します。
       メモ: これが正しく行われると、ベースライン期間値の 30 秒が値 1 の近くにホバリングされます。シナプス含量を効果的に放出する細胞では、この値は刺激の開始後に1から0にトレンドするはずである。ステップ6〜9の例を 図3Eに示す。

9. データ解析

注:実験者は、分析のためにデータを適切にプールするために、実験条件に盲検化されていない可能性があります。3つの独立した実験のそれぞれから、条件ごとに少なくとも10個のニューロンのサンプルサイズを使用する。少なくとも5つのROI領域を指定できる場合にのみ、ニューロンの包含を検討してください。このレベルの実験的複製は、ALS関連ポリGA含有細胞対GFP対照におけるシナプスアンロードの深刻な損失を実証するために、公表された研究において十分であった( 代表的な結果を参照)。しかしながら、より微妙な表現型が観察される場合、生物学的および/または技術的複製の数は、ユーザによる最適化を必要とするかもしれない。

1. 所与の実験条件のROIから経時的に計算されたすべてのΔF/F値を使用して、SEMとともに各時点の平均ΔF/F値を決定する。
2. グラフ作成および統計ソフトウェアプログラムを使用して、xy形式でデータをプロットします(xは経過時間、yはステップ9.1で計算されたΔF/F値)。SEMですべての値を平均値として提示±ます。
3. 統計的有意性を判断するには、2つのグループを比較するためのスチューデン トのt検定と一元配置分散分析(ANOVA)を使用し、続いて3つ以上のグループを比較するためのTukeyのポストホック分析を使用します。

Results

上記のプロトコールの成功した実施に続いて、典型的なスチリル色素シナプス小胞放出実験について代表的な結果が示されている。培養ラット初代皮質ニューロンは、セクション6に記載の方法を用いて色素を負荷した。色素負荷の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンとの共標識によって決定した。陽性の点状穿刺のスチリル色素の大部分は、このマーカーに対して共陽性である(図2A)。スチリル色素イメージングに使用される設定がフォトブリーチングを引き起こすかどうかを判断するために、通常、未処理のウェルに色素をロードし、蛍光値が一定であることを確認するために刺激なしで長時間10分間画像化します。

さらに、 図2Aのようにシナプトフィジンとスチリル色素の共標識を用いた結果が再び示される。これらの蛍光色素は、TRITCスチリル色素イメージングのセクション6に示されたパラダイムを使用して共イメージングされ、さらにDAPIチャネル上の高強度レーザーパワーを使用してシナプトフィジン蛍光の二重捕捉が...

Discussion

記載されている両方の方法に共通する3つのステップは、実験の成功と定量化可能な結果にとって非常に重要です。まず、各実験ラウンドの前に新鮮なaCSFの調製が不可欠であり、添付の指示に従ってください。そうしないと、適切なニューロン脱分極を妨げる可能性があります。未処理の対照ニューロンのサンプルは、適切な細胞脱分極を確実にし、そのイメージングセッションで得られた肯定的な結果のベンチマークを提供するために、任意の実験群の刺激の前に絶えず試験されるべきである。第二に、特定のシナプス領域の蛍光を経時的に追跡することに成功するためには、モニタリングのために画像化パラメータおよびROIの領域を設定する際にも特別な注意が必要である。ベースライン期間記録は、直ちに刺激記録期間に移行するべきである。スチリル色素放出の単一崩壊ダイナミクスを捕捉するには、十分に速いフレームレート(2画像/秒)が必要です。最後に、実験の分析における重要なステップは、蛍光測定を最初にイメージングバックグラウンドに正規化し、次に事前刺激ベースラインに正規化することです。他の画像化プロトコルと同様に、ブランク画像化領域の減算は、KCl培地の添加によって導入され得るバックグラウンド自己蛍光...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20倍空気対物レンズ	ニコン		イメージング用
40倍油浸対物レンズ	ニコン		用
B27サプリメント	Thermo Scientific	17504044	神経成長サプリメント
BD注射器(針なし)、50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	重力灌流アセンブリの一部
バイオセーフティ 細胞培養フード	Baker	SterilGARD III SG403A	無敗症細胞の培養、トランスフェクション、および色素ローディング
b-メルカプトエタノール	ミリポアシグマ	M3148	神経細胞培養の培養と維持用
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A9418	神経細胞培養物の調製用
塩化カルシウム二水和物	ミリポアシグマ	223506	aCSF溶液の成分
細胞培養 CO2 インキュベーター	Thermo Scientific	13-998-123	ニューロンの培養と維持用
遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	神経細胞培養準備用
共焦点顕微鏡	ニコン	エクリプス Ti +A1R コア	蛍光イメージング用
CoolSNAP ES2 CCDカメラ	フォトメトリクス		画像取得用
D-グルコース	ミリポアシグマ	G8270	aCSF溶液の成分
DNase	ミリポアシグマ	D5025	神経細胞培養用
調製用 女性、時限妊娠 スプレイグ・ドーリーラット	チャールズ川	400SASSD	胚性皮質および脊髄運動ニューロン培養の準備用
FITCフィルターキューブ	ニコン	77032509	イメージング用 Gcamp カルシウム過渡現象
FM4-64 スチリル色素	Invitrogen	T13320	イメージング用 シナプス小胞放出
ガラス底シャーレ (厚さ #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	イメージング対応培養皿上のニューロンの成長用
ガラスパスツールピペット	グレインジャー	52NK56	ニューロン培養物の準備用
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)	ミリポアシグマ	H6648	神経培養の準備用
HEPES	ミリポアシグマ	H3375	aCSF溶液の成分
高KCl人工脳脊髄液(aCSF)			イメージング用。レシピをご覧ください*
馬の血清	ミリポアシグマ	H1138	ニューロンの培養と維持用
層流解剖フード	NUAIRE	NU-301-630	神経細胞培養物の調製用
ラミニン	Thermo Scientific	23017015	神経細胞培養物の調製用
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	神経細胞培養物の調製
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	神経細胞培養物の調製用
L-グルタミン (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	神経培養サプリメント
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬	Thermo Scientific	11668019	神経細胞トランスフェクション用
低KCl人工脳脊髄流体(aCSF)			イメージング用。レシピをご覧ください*
塩化マグネシウム	ポアシグマ	208337	aCSFソリューションのコンポーネント
Excel	/正規化用	Microsoft
Nalgene フィルターユニット、0.2 & マイクロ;m PES	Thermo Scientific	565-0020	aCSF溶液用フィルターユニット
神経基礎培地	Thermo Scientific	21103049	神経細胞培養の培養と維持に
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		画像キャプチャと分析用ソフトウェア
Nunc 15 mL コニカルチューブ	Thermo Scientific	339650	神経細胞の培養とバッファーの調製に溶液
Nunc 50 mL コニカルチューブ	Thermo Scientific	339652	神経細胞培養および緩衝液の調製用
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	神経細胞培養物の調製用
Papain	Millipore Sigma	P4762	神経細胞培養の調製用
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	神経培養物の細菌汚染を防ぐために
灌流システム	ワーナー・インスツルメンツ	SF-77B	aCSF
交換用 灌流チューブ	コール・パーマー	UX-30526-14	重力灌流アセンブリの一部
pGP-CMV-Gcamp6m プラスミド	Addgene	40754	イメージング用 カルシウム過渡現象
ポリ-D-リジン臭化水素酸	ミリポアシグマ	P7886	ガラス底シャーレ用コーティング剤
塩化カリウム	ミリポアシグマ	P3911	aCSF液成分
重炭酸ナトリウム	ミリポアシグマ	S5761	aCSF液成分
塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S9888	aCSF液成分
ステージトップインキュベータ	東海ヒット		イメージング期間中の生きたニューロンのインキュベーション用
TRITC フィルターキューブ	ニコン	77032809	イメージング用 FM4-64
トリプシン阻害剤	ミリポアシグマ	T6414	神経細胞培養物調製用
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	サーモサイエンティフィック	25200056	神経細胞培養物調製用
防振テーブル	新港	VIP320X2430-135520	顕微鏡用テーブル・スタンド