インビトロで心臓虚血/再灌流を模倣する細胞共培養モデルの開発

虚血性心疾患は、世界中の死因および障害の主要な原因である^1,2。しかし、再灌流の治療プロセスは、それ自体が心筋虚血/再灌流(IR)傷害として知られる心筋細胞死を引き起こす可能性があり、有効な治療法はまだない³。内皮細胞(EC)は、パラクリンシグナルの分泌、ならびに細胞間相互作用を通じて心筋細胞(CM)を保護することが示唆されている⁴。

細胞共培養モデルは、細胞機能および分化に対するオートクリンおよび/またはパラクリン細胞間相互作用の役割を調査するために広く使用されてきた。共培養モデルの中で、混合共培養が最も単純であり、2つの異なるタイプの細胞が所望の^細胞比5で単一の培養区画内で直接接触している。しかし、細胞型間の別々の処理と単一の細胞型の下流分析は、混合集団を考えると容易には実現不可能である。

以前の研究では、低酸素および虚血性の侮辱が、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出によって測定される細胞膜の完全性に重大な損傷を引き起こすことが示された。この傷害は、再酸素化時に悪化し、再灌流傷害を模倣^する6、^7、8。現在のプロトコルの目的は、ECの存在が低酸素および再酸素化(HR)によって引き起こされるCMの細胞膜漏出を用量依存的に減弱させることができ、ECの保護効果は2つの細胞株間の接触距離を変えることによって最適化できるという仮説を検証することであった。そこで、マウス初代冠動脈内皮細胞と成体マウス心筋細胞の3種類の細胞培養インサートを採用した。コーニング、メルクミリポア、グライナーバイオワンによってブランド化されたインサートは、細胞間ライン間距離がそれぞれ0.5、1.0、および2.0mmの3つの異なる細胞培養クロストーク条件を作成することができました。各ケースでインサートあたり100,000個のECがメッキされました。

さらに、このモデルにおいて、共培養中のECの密度がHR傷害減弱に寄与するかどうかを決定するために、我々は、EC濃度とCMによるLDH放出との間の用量反応関係を研究した。

このレポートは、研究者がこの重要なモデルを有利に利用するための段階的なアプローチを提供します。

1. 実験準備・めっき

1. CM および EC は、製造元の指示に従って保守してください。
   1. 両方の細胞株がベンダーから到着したら解凍します。新鮮な培地で洗浄した後にT25フラスコにプレートする。各細胞培養培地は、細胞が購入したのと同じベンダーから購入することをお勧めします。翌日、培地で細胞をリフレッシュし、コンフルエントなときに使用します。
   2. 細胞培養インキュベーターを21%O2、5%CO2、74%_N2で37°Cに_維持し、加湿しておく。
      注:このプロトコルで使用されるマウス初代冠状動脈内皮細胞はC57BL/6マウスの冠状動脈から単離され、成体マウス心筋細胞は成体C57BL/6Jマウス心臓から単離され、商業的に入手可能である( 材料表を参照)。
2. CMを滅菌条件下で24ウェルプレートの底部(下層)にプレートする。24時間後、ECを共培養ウェルのインサート(または上位部分)にプレートする。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMプレートベース上に置き、共培養期間を開始した。使用前に細胞を少なくとも12〜24時間共培養させる。これらの手順については、以下で詳しく説明します。
   1. CM細胞株コンフルエント性を光学顕微鏡下で推定する。細胞が培養フラスコ内で90%〜100%コンフルエントであるように見える場合、実験的なプレーティングを続行する。
   2. コンフルエントな細胞培養物を含むフラスコから培地を取り出し、T25フラスコ用に3〜5mLのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)でトリプシン処理する。フラスコを穏やかに攪拌し、37°Cで2〜5分間インキュベートし、次いで光学顕微鏡下で酵素進行を評価した。セルが切り上げられ始めたら、セルスクレーパーを使用してセルを表面から取り外します。
   3. 剥離後、T25フラスコ用の培地10mLを含む50mLチューブにトリプシン/細胞溶液を加えてトリプシン溶液を不活性化する。細胞懸濁液を120 x g で2分間遠心分離し、軟質細胞ペレットを得た。上清を除去し、ペレットを5mLの培地に再懸濁する。
   4. 細胞計数を行い、細胞生存率を確認するには、10 μLの再懸濁細胞と10 μLのトリパンブルー色素のアリコートを混合します。細胞カウンターを用いて生細胞を計数する。所望の播種密度を達成するために、新鮮な規則的な培地で細胞を希釈する。体積は、所望の種子密度およびストック溶液の細胞濃度に応じて計算される。すべてのめっきは無菌条件下で行う必要があります。
   5. 細胞外マトリックスで予めコーティングされた24ウェルプレートの底部に、1ウェルあたり300,000の密度のプレートCMを播種する。細胞を21%O2および5%_CO2 で一晩37°C_に 維持する。
   6. 24時間後、ECをインサートあたり100,000の最適なプレーティング密度でインサートにプレートします(培養面積は33.6mm2です)(図1)。ECめっきの24時間後、ECインサートをCMウェル内に置き、共培養を開始する。実験を行う前に、細胞を12〜24時間共培養する。
   7. 実験が実行されるまでに、CM と EC の両方が 80% ~ 90% のコンフルエントに達していることを確認します。

2. 虚血/再灌流傷害をインビトロでシミュレートするための低酸素/再酸素化

メモ: 次の手順は説明どおりに実行する必要があります。その間に一時停止しないでください。

1. 50 mLの円錐管に約25 mLの培地を注ぐことによって低酸素培地を調製する。上部をシリコーン膜でエアシールし、滅菌ピペットを使用して穴を開けます。別の穴を作り、今度はピペットをメディアに約2/3沈めたままにします。
2. 培地を低酸素ガス(0.0125% O2、5%_CO2、94.99% N₂)で30 L/minの流量で5分間洗い流します。これにより、低酸素状態の開始時に媒体中に溶解する_O2が最小限に抑えられます(ステップ2.5)。
3. 付着細胞を含む24穴プレートまたは培養インサートの培地を捨て、100 μL/ウェルの10%リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で非常に穏やかに洗浄する。その後、新たに調製した低酸素培地500μLをプレートまたはインサートの各ウェルに加える。
   注: このステップでは、培地中の低酸素症ができるだけ短時間中断され、その後、ステップ 2.5 で細胞およびメディアの真の低酸素状態が開始されます。
   1. 正常酸素対照群では、元の培地をグルコースおよび血清を含む新鮮な正常培地と交換する。
4. チャンバー内に滅菌水で満たされたペトリ皿を置くことによって低酸素チャンバーを加湿する。次に、低酸素基を含むプレートをチャンバー内に配置します。
5. 低酸素チャンバーを低酸素ガス(0.0125%O2、5%CO2、94.99%_N2)で30L/minの流量で5分間フラッシュします。チャンバーを37°Cのインキュベーター内に24時間置く。
6. 低酸素状態の後、通常の条件下でCMおよびECを栽培する。これを行うには、プレート/インサートの古い培地を捨て、通常の培地(グルコースと血清を含む;各ウェル/インサートの500μLを含む)と交換し、通常の培養条件(21%O2、5%_CO2、74%_N2、37°C)下でインキュベーターに2時間保存して再灌流を模倣する。
7. 培地置換の任意の効果について制御するために、低酸素培地が変化すると同時に正常酸素細胞の培地を変更する。
   メモ: 図 2 に、このプロトコルの概略概要を示します。

3. エンドポイント評価

1. 細胞培養培地を24ウェルプレートから96ウェルプレートに移す。24ウェルプレートの各ウェルから200μLの培地を使用し、それに応じて96ウェルプレートの4ウェルに均等に分配する。正常酸素症対低酸素症対HRのためにそれぞれ1つのプレートを使用してください。
2. 細胞傷害の程度は、例えば、製造業者の指示に従って細胞傷害性アッセイキットを用いてLDHの吸光度を測定することによって決定する。アッセイプロトコールで指示されたように96ウェルプレートでアッセイを行う。

4. 統計

1. パラメトリック データを平均/標準偏差として表示し、ノンパラメトリック データを中央値/四分位範囲を持つ箱ひげ図として表示します。タイプ1エラーの可能性を減らすために、許容可能なポストホック検定を使用した適切なパラメトリック検定と非パラメトリック多重比較検定を実行する必要があります。有意性は通常、アルファ 0.05 (両側) に設定されます。
2. 現在の研究で実施されたすべての実験について、1回の実験内で少なくとも3つのウェル反復を実行します。統計分析に使用した各実験の繰り返しは3~6回であった。

この実験で使用した3種類のインサート(A、B、C)はすべて、同じ孔径0.4μmです。両者の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さで、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5、1.0、2.0mmにすることができ(図3)、異なるベンダーからのものである(詳細については 材料表を参照)。

IR損傷をシミュレートするためにHRを受ける2つの細胞株の別々の層を有する in vitro 共培養モデルを確立するために、我々はECの有無にかかわらず共培養されたCMの細胞膜完全性を調べた。CM層より上のさまざまな距離に配置できるEC用の別のインサートを利用することで、CMの膜損傷の重症度に対する細胞層距離の差異効果も評価することができました。別の実験セットでは、ECの密度、したがってECとCMの比率を変化させました。さらに、シミュレートされた虚血とシミュレートされたIR損傷を区別するために、実験は、1)正常酸素症、2)低酸素のみ、および3)HRの条件下で行った。このモデルでは、24時間の低酸素状態を使用し、続いて2時間の再酸素化を使用しました。

可変距離
セル層間の距離 0.5 mm (挿入 A)
CMを単独で培養した場合、低酸素症は正常酸素症と比較してLDH放出を有意に増加させ、我々の以前の研究と一致した(図4A)6。しかし、LDHは、低酸素のみの群と比較して、2時間の再酸素化時にわずかにしか増加しなかった。ECとCMを0.5mmの距離で共培養した場合、低酸素のみによるLDH放出の増加は減衰せず、ECが保護効果を示さなかったことを示している(低酸素のみの条件下でのCM単独群と比較して)。しかし、ECは人事中にCMに軽度だが重要な保護を行使した。

セル層間の距離 1.0 mm (B を挿入)
2つの細胞層間の距離を1.0mmに増加させたことを除いて、上記と同じ実験を行った(図4B)。我々は、LDH放出が低酸素のみによってCMsのみにおいても有意に増加することを見出した。しかし、0.5mmインサートとは異なり、CMのみのLDH増加は、低酸素のみに対するHRによって増強された。さらに、この増強は、CMのみの群と比較して、再酸素化中のECの存在によってより阻害され、ほぼ消失した。

セル層間の距離 2.0 mm (挿入 C)
2つの細胞株間に2.0mmの距離を作り出す共培養インサート(図4C)を使用した場合、低酸素時のCMのみによるLDH放出の有意な増加も、0.5mmおよび1.0mmの実験と同じ程度に見出された。しかし、興味深いことに、再酸素化によるLDH放出のさらなる増加は、1.0mm実験よりもさらに顕著であった。これらの増加の両方は、ECの存在によって減衰されたが、廃止されなかったが、ECは、0.5または1.0mmのインサートを使用することとは異なり、低酸素のみおよびHRの両方の条件下でCMを傷害から有意に保護したことを示している。

可変EC強度
異なる実験セットにおいて、2.0mmインサートに播種されたECの濃度を、インサート当たりそれぞれ25,000、50,000および100,000細胞に滴定した。LDH放出は、24時間低酸素化に続いて2時間再酸素化後に測定した。我々の結果は、共培養におけるEC強度の増加が、HRによって引き起こされるLDH放出の用量依存的減衰をもたらしたことを示した(図5)。正常酸素条件下ではそのような効果は見られなかった。

図1:ウェル内のインサートの概略図ECs(インサートあたり最大100,000細胞)を備えたインサートは、CM(ウェルあたり300,000個)を底部に取り付けた24ウェルプレートに移されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:実験計画 細胞は通常の酸素条件(21%O2)下で培養され、次いで2つの群に分割される:正常酸素対照群は、通常の条件下でさらに24時間培養され続けるが、低酸素群は、0.01%O2のみでグルコースを含まない低酸素チャンバー内で24 時間培養される。これらの24時間の介入の後、両方の細胞群を培地でリフレッシュし、21%O2 環境で再酸素化段階である別の2時間連続培養してから、最終的にエンドポイントアッセイ(LDH分析など)を実施します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3つの異なるインサートの画像と回路図 インサート内の内皮細胞とウェルの底部の心筋細胞との間の距離は、異なるインサートを使用することによって変化させることができる。ここで使用される3種類のインサートはいずれも、同じ孔径0.4μmです。それらの間の唯一の違いは、挿入からベースまでの高さであり、これにより、2つの共培養細胞層間の距離をそれぞれ0.5(A)、1.0(B)、および2.0mm(C)にすることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:心筋細胞単独(CM;白)、内皮細胞単独(EC;黒)、およびCMとECとの共培養(チェックパターン)について、正常酸素(左)、低酸素のみ(中央)、低酸素/再酸素化条件(右)下での乳酸脱水素酵素(LDH;吸光度単位[au])の放出を評価する際の3種類の培養インサートの比較。 (c)2つの異なる細胞層間の距離が2.0mmである。ECsはインサート当たり100,000細胞の密度で播種し、CMは1ウェル当たり300,000細胞の密度で播種した。データは標準偏差±平均であり、1群あたりn=4である。統計: ANOVAに続いて、スチューデント-ニューマン-キュールズのポストホックテストが続きます。P < 0.05 (両側) は、比較された各ペア間の水平バーで示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:乳酸脱水素酵素(LDH;吸光度単位[au])の放出によって証明されるように、共培養内皮細胞の濃度(EC;25:25,000細胞/インサート;50:50,000細胞/インサートあたり;100:100,000細胞/インサートあたり100,000細胞)の用量依存的影響保護(右)と比較して、低酸素/再酸素化傷害に対する心筋細胞(CM)の保護(右)。ECは正常酸素条件下でのLDH放出に影響を及ぼさなかった。データは標準偏差±平均であり、1群あたりn=4である。統計: ANOVAに続いて、スチューデント-ニューマン-キュールズのポストホックテストが続きます。P < 0.05 (両側) は、比較された各ペア間の水平バーで示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは利益相反がないと宣言しています。