ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

Kazuhide Asakawa; Hiroshi Handa; Koichi Kawakami

doi:10.3791/62932

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方法論記事

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

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DOI:

10.3791/62932

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2022年2月25日

Kazuhide Asakawa¹ , Hiroshi Handa¹ , Koichi Kawakami²^,³

¹Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, ²Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, ³Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

この記事について

サマリー

我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた脊髄運動ニューロンにおける光によるTARDNA結合タンパク質43(TDP-43)の相転移を誘導するプロトコルを記述する。

要約

異常なタンパク質凝集と選択的神経の脆弱性は、神経変性疾患の2つの主要な特徴である。これらの特徴間の因果関係は、この実験的アプローチはこれまで限られているが、脆弱な細胞型における疾患関連タンパク質の相転移を制御することによって問い合われる可能性がある。ここでは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)で変性運動ニューロンで発生するTDP-43の細胞質凝集をモデル化するためのゼブラフィッシュ幼虫の脊椎運動ニューロンにおけるRNA/DNA結合タンパク質TDP-43の相転移を誘導するプロトコルについて説明する。ゼブラフィッシュの脊椎運動ニューロンに光遺伝学的TDP-43変異体を選択的に送達する細菌人工染色体(BAC)ベースの遺伝的方法について述べた。ゼブラフィッシュ幼虫の高い半透明性は、拘束されていない魚に対して発光ダイオード(LED)を使用した単純な外部照明によって脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的TDP-43の相転移を可能にする。また、光遺伝学的TDP-43の光照明への応答を特徴付ける、自由に利用できるフィジー/ImageJソフトウェアを用いて、ゼブラフィッシュ脊椎運動ニューロンのライブイメージングと画像解析の基本的なワークフローを提示する。このプロトコルは、ALSに脆弱な細胞環境におけるTDP-43相転移および凝集形成の特徴付けを可能にし、細胞および行動の結果の調査を容易にするべきである。

概要

リボヌクレオプロテイン(RNP)顆粒は、均質な流体が2つの異なる液体相に分解する現象である液液相分離(LLPS)を介して膜のないパーティションを組み立てることによって、核および細胞質における無数の細胞^{活動を制御}^する。RNP顆粒成分として通常機能するRNA結合タンパク質の調節不変LLPSは、異常な相転移を促進し、タンパク質凝集をもたらす。このプロセスは、神経発達および神経変性疾患に関与している^3,4,5.RNA結合タンパク質の異常なLLPSと疾患の病態との因果関係の正確な評価は、LLPSが効果的な治療標的として利用できるかどうかを決定する上で極めて重要である。RNA結合タンパク質のLLPSは、インビトロや単細胞モデルでは比較的容易に研究できますが、多細胞生物、特に脊椎動物では困難です。組織環境内の個々の細胞におけるこのようなLLPSを分析するための重要な要件は、疾患に脆弱な細胞タイプの目的でLLPSのイメージングおよび操作のためのプローブを安定的に発現させることである。

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