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方法論記事

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

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DOI：

10.3791/62932

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2022年2月25日

 ,  , 
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

この記事について

サマリー

我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた脊髄運動ニューロンにおける光によるTARDNA結合タンパク質43(TDP-43)の相転移を誘導するプロトコルを記述する。

要約

異常なタンパク質凝集と選択的神経の脆弱性は、神経変性疾患の2つの主要な特徴である。これらの特徴間の因果関係は、この実験的アプローチはこれまで限られているが、脆弱な細胞型における疾患関連タンパク質の相転移を制御することによって問い合われる可能性がある。ここでは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)で変性運動ニューロンで発生するTDP-43の細胞質凝集をモデル化するためのゼブラフィッシュ幼虫の脊椎運動ニューロンにおけるRNA/DNA結合タンパク質TDP-43の相転移を誘導するプロトコルについて説明する。ゼブラフィッシュの脊椎運動ニューロンに光遺伝学的TDP-43変異体を選択的に送達する細菌人工染色体(BAC)ベースの遺伝的方法について述べた。ゼブラフィッシュ幼虫の高い半透明性は、拘束されていない魚に対して発光ダイオード(LED)を使用した単純な外部照明によって脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的TDP-43の相転移を可能にする。また、光遺伝学的TDP-43の光照明への応答を特徴付ける、自由に利用できるフィジー/ImageJソフトウェアを用いて、ゼブラフィッシュ脊椎運動ニューロンのライブイメージングと画像解析の基本的なワークフローを提示する。このプロトコルは、ALSに脆弱な細胞環境におけるTDP-43相転移および凝集形成の特徴付けを可能にし、細胞および行動の結果の調査を容易にするべきである。

概要

リボヌクレオプロテイン(RNP)顆粒は、均質な流体が2つの異なる液体相に分解する現象である液液相分離(LLPS)を介して膜のないパーティションを組み立てることによって、核および細胞質における無数の細胞活動を制御する。RNP顆粒成分として通常機能するRNA結合タンパク質の調節不変LLPSは、異常な相転移を促進し、タンパク質凝集をもたらす。このプロセスは、神経発達および神経変性疾患に関与している3,4,5.RNA結合タンパク質の異常なLLPSと疾患の病態との因果関係の正確な評価は、LLPSが効果的な治療標的として利用できるかどうかを決定する上で極めて重要である。RNA結合タンパク質のLLPSは、インビトロや単細胞モデルでは比較的容易に研究できますが、多細胞生物、特に脊椎動物では困難です。組織環境内の個々の細胞におけるこのようなLLPSを分析するための重要な要件は、疾患に脆弱な細胞タイプの目的でLLPSのイメージングおよび操作のためのプローブを安定的に発現させることである。

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脳と脊髄の運動ニューロンが変性のために選択的かつ徐々に失われる、最終的に致命的な神経疾患である。現在までに、25以上の遺伝子の突然変異は、ALS症例全体の5%-10%を占めるALSの遺伝性(または家族性)形態と関連しており、これらのALSを引き起こす遺伝子の一部はhnRNPA1、TDP-43、FUS6,7などのRNPからなるRNA結合タンパク質をコードする。さらに、ALSの散発的な形態は、ALS症例全体の90%〜95%を占め、退化運動ニューロンに沈着したTDP-43の細胞質凝集によって特徴付けられる。これらのALS関連RNA結合タンパク質の主な特徴は、本質的に障害領域(IDR)または低複雑性ドメインであり、秩序ある三次元構造を欠き、LLPS7,8を駆動する多くの異なるタンパク質との弱いタンパク質タンパク質相互作用を媒介する。ALSを引き起こす突然変異がIDRでしばしば起こるという事実は、これらのALS関連タンパク質の異常なLLPSおよび相転移がALS病因の根源であるかもしれないという考えにつながっています。

近年、光光によるタンパク質相互作用の調節を可能にするクリプトクロム2ベースの光遺伝学的手法である光滴法が、IDRs11を用いたタンパク質の相転移を誘導するために開発された。この技術がTDP-43に正常に拡張されたので、TDP-43の病理学的相転移の基礎となるメカニズムとそれに関連する細胞毒性12、13、14、15を明らかにし始めた。このプロトコルでは、ALSに脆弱な細胞型、すなわち、運動ニューロン仕様用ホメオドメインタンパク質をコードするmnr2b/mnx2b遺伝子のBACを用いてゼブラフィッシュの脊髄運動ニューロンに光遺伝学的TDP-43を送達する遺伝的方法の概要を示す16,17。ゼブラフィッシュ幼虫の高い半透明性は、脊髄運動ニューロンにおけるその相転移を引き起こす光遺伝学的TDP-43の単純で非侵襲的な光刺激を可能にする。また、光刺激に対する光遺伝学的TDP-43の応答を特徴付けるために、自由に入手可能なフィジー/ImageJソフトウェアを用いたゼブラフィッシュ脊髄運動ニューロンのライブイメージングと画像解析の基本的なワークフローも提示する。これらの方法は、ALSに脆弱な細胞環境におけるTDP-43相転移の調査を可能にし、細胞および行動レベルでの病理学的結果を探求するのに役立つべきである。

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プロトコル

すべての魚の作業は、国立衛生研究所動物福祉局(NIH)の動物福祉局(保証番号A5561-01)を申請している国立遺伝学研究所(日本)の施設動物の世話・使用委員会(承認識別番号24-2)の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って行われました。 米国)。

1. mnr2b プロモーターからの光遺伝学的TDP-43遺伝子発現に関するバチの構築

  1. BAC製剤
    1. ゼブラフィッシュのsnr2b遺伝子座(CH211-172N16、BACPACゲノミクス)を含むゼブラフィッシュBACクローンを購入します。温暖化et al.18に記載されているようにCH211-172N16を収容するDH10B大腸菌(大腸菌)の5mLの一晩LB培養からBAC DNAを精製する。
    2. Ch211-172N16をエレクトロポレーションによりSW102 大腸菌 細胞に変換し、その後、ウォーミングら18に記載されている。
      注:エレクトロポレーションの同じ日に 大腸菌 からのBAC DNAの精製は、通常、BAC変換18のより高い成功率を与えます。それ以外の場合は、精製されたBAC DNAは使用するまで-20°Cに保たれる。
    3. Asakawaら 20に記載されているように、Tol2トランスポゾンを介したBACトランスジェネシス19用のiTol2-ampカセットをエレクトロポレーションによりCH211-172N16のバックボーンに導入する。
      1. Eのグリセロールストックを作ります。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による相同組換えと組み合わせた組み合わせを確認した後、iTol2-ampカセット集積(CH211-172N16-iTol2A)を用いてCH211-172N16を担う 大腸 鎖クローン(Ex Taq) プライマーペアTol2-L-out(5'-AAA GTA TCT GGCタグAAT CTT ACT TGA-3')およびpTARBAC-13371r(5'-タグCGG CCG CAA ATT TAT TA-3')および以下の条件を使用する: 変性ステップは1分間98°Cで、続いて95°Cで10秒で変性の25サイクル、15秒の場合は55°Cでプライマーアニール、プライマー延長を1分間72°Cで延長し、354塩基対のPCR産物を増幅した(bp)。
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h建設
    1. N-およびC末端でmRFP1とCRY2oligでタグ付けされたヒト野生型TDP-43/TARDBP (TDP-43h)の発現カセットをそれぞれ持つプラスミドを構築する(以下、opTDP-43h)14。
      注:opTDP-43h断片はゼブラフィッシュhsp70l遺伝子プロモーター配列(650 bp)およびポリアデニル化(ポリA)シグナル配列と横に並べられ、続いてカナマイシン耐性遺伝子(hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14が続くべきである。
    2. hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kanカセットを、hsp70lおよびKanをアニールするプライマーで増幅し、プライマー対mnr2b-を用いてmnr2b遺伝子の開始子コドンの上流および下流の45bp配列を含む hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca ca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') および Km-r (5'ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc)ctg aag ttc ttt gac ttt tt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAg AA-3')は、98 °Cで1分間変性ステップ、 続いて、10sの95°Cで変性の30サイクル、15sの55°Cでプライマーアニーリング、30sの68°Cでプライマー延長が続き、 PCR産物を5.7 bpの増幅する。
    3. PCR産物をアガロースゲル電気泳動(100V)で分離し、hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNAバンドをDNAカラムで精製します。精製したhsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kanカセットの濃度を、10 mM Tris-HCl(pH 8.0)および1 mM EDTAを含むトリスEDTAバッファー(TE)の50 ng/μLに調整します。
    4. 「ウォーミング et al.18」に記載されているエレクトロポレーションによって ch211-172N16-iTol2A に hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan カセットを導入し、LB寒天プレートにアンピシリンおよびカナマイシン耐性変換剤を選択します。hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan カセットを搭載したCH211-172N16-iTol2Aは、mnr2b-hs:opTDP-43hとして指定されています。
    5. BAC精製キットを使用してmnr2b-hs:opTDP-43hを精製し、フェノール/クロロホルム抽出後にTEで250 ng/μLで溶解します。
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z建設
    1. opTDP-の代わりに、そのN末端(EGFP-TDP-43z)で強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)でタグ付けされたゼブラフィッシュ野生型 タードbp を運ぶ別のプラスミドを構築する- opTDP-の代わりに 43hが、それ以外の場合は 、hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan構造(hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14と同一である。opTDP-43hの光刺激のための内部制御としてEGFP-TDP-43zを使用してください。
    2. 1.2.1-1.2.5に記載されているように、hsp70lp-EGFP-TDP-43z-ポリア-カンカセットをmnr2b遺伝子座に収容するCH211-172N16-iTol2Aを構築します。hsp70lp-EGFP-TDP-43z-ポリア-カンカセットを運ぶCH211-172N16-iTol2Aは、mnr2b-hs:EGFP-TDP-43zとして指定されています。

2. ゼブラフィッシュにおける TOL2 トランスポゾン媒介性BACトランスジェネシス

  1. 40 mM KCl、フェノールレッド(10%v/v)、25 ng/μLのmnr2b-hs:opTDP-43h DNA、および25 ng/μL Tol 2 トランスポザーゼmRNA19を含む注射液を調製します。
  2. 1細胞段階で野生型ゼブラフィッシュ胚のサイトゾルに注入液(直径約123μmの液滴)を注入します。注射された魚をスクリーニングし、脊髄運動ニューロンを含む様々な胚組織における赤蛍光タンパク質(RFP)陽性凝集体を、受精後2〜3日で蛍光体顕微鏡(dpf)でスクリーニングする。RFP陽性魚を成人期に引き上げます。
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNAを注入します(2.1 および 2.2 に記載されています)。成人期にEGFP陽性魚を上げます。
  4. 数ヶ月後、性的に成熟した注射された魚と野生型の魚を標準2 L交配ケージにペアで入れてF1子孫を得る。F1の魚は、RFP(opTDP-43h)またはEGFP(EGFP-TDP-43z)の脊柱の蛍光で、プランネオフルア5x/0.15対物レンズを搭載したエピフルエンス顕微鏡を使用しています。通常、1匹の魚は10-20の注入された魚から識別されます(生殖細胞系列の伝達率は5%−10%)。
  5. 複数のTg[mnr2b-hs:opTDP-43h]とTg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]は、opTDP-43hまたはEGFP-TDP-43z発現の強度として、異なる創設者魚からの挿入物を分離して比較する。
  6. クロスTg[mnr2b-hs:opTDP-43h]とTg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]魚のラインは、Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] ダブルトランスジェニック魚を含む子孫を得る
  7. 30 mLのE3バッファー(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4、10-5%メチレンブルー)を含むプラスチック皿で魚を上げ、0.003%(w/v)N-フェニルチウリアを受精後8-10hhで添加します。
  8. 30 hpf 後のアルミホイルでプラスチック皿を覆います。

3. 青色照明用LEDの準備

  1. タブレット/電話にインストールされている関連アプリケーションを使用して、LED パネルをオンにします。分光計のプローブを6ウェル皿の空き井戸に入れ、アプリケーションを通して〜456nmでピークを迎える波長にLED光を調整します。空き井戸に光学パワーメーターの光センサーを置き、LEDライトの電力を調整します(約0.61 mW/cm2)。LEDライトの設定は保存することができ、アプリケーションで取得可能です。
  2. 28°Cのインキュベーターに皿/LEDパネル設定を導入します。 魚のイメージングが48 hpfで始まる前に、このステップを完了します。

4. 光遺伝学的TDP-43を発現するゼブラフィッシュ幼虫のイメージング

  1. RFP(opTDP-43h)またはEGFP(EGFP-TDP-43z)上記のエピフルエンスを使用して脊髄運動列の蛍光を選択し、少なくとも47 hpfの前にTg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z]二重トランスジェニック魚を選択します。
  2. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 二重トランスジェニック魚をデコールネイト.
  3. エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩の250μg/mLを含む1%低融点アガロースを42°Cで予熱する。
  4. 簡単に Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] トリケネの同じ濃度を含む E3 バッファー内 48 hpf で二重トランスジェニック魚.
  5. 室温でガラスベース皿に予熱1%低融点アガロースの滴を置きます。ガラス皿のドーム状のアガロースの落としの直径は8-10mmです。
  6. パスツールピペットを使用して、ガラスベースディッシュの低融点アガロースに麻酔魚を加え、数回ピペットで混ぜます。魚と一緒にアガロースに添加E3バッファーの量を最小限に抑えます.
  7. アガロースの固化時に注射針(通常約1分)を使用して魚を脇に維持し、脊髄が適切な水平位置にあることを確認します。固化後、ドーム型のアガロースに取り付けられた魚の上にE3バッファーの滴を数滴置きます。
  8. 1.00の開口数を持つ20倍の水浸し対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡でスキャンし、1ピクセル当たり4.0 μs(12ビット/ピクセル)のスキャン速度、目的のスライスあたりのステップサイズ1.0 μm、および励起/波長の組み合わせを使用して、脊髄の連続共焦点zセクションを取得します。 チャネル 1) 473/510 nm EGFP およびチャネル 2) 559/583 nm (mRFP1 用)。
    注:魚の腹側のクロアカは、ポイント間の脊髄セグメント(レベル16-17)を識別し、比較するのに役立つ参照として、関心領域(ROI)に含まれています。
  9. 撮影が完了したらすぐに注射針でアガロースを慎重に割ってアガロースから魚を取り除きます。<30分間埋め込むアガロースは魚の生存率に影響を与えませんが、魚がアガロースに埋め込まれる時間をできるだけ短くしてください。

5. 青色発光ダイオード(LED)光のフィールド照明によるopTDP-43h発現魚の光刺激

  1. ウェルにE3バッファの7.5 mLを追加し、画像Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] ダブルトランスジェニック魚をウェルに配置します。皿とLEDパネルをスペーサーで5mm離して(例えば、5つのスライドグラスを積み重ねて)、LEDパネルに6ウェル皿を置きます。
  2. 青色のLEDライトを点灯します。Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 二重トランスジェニック魚の一部を、イルミネーションのないコントロールフィッシュが必要な場合にアルミニウム箔で覆われた別の6ウェルディッシュに保管してください(すなわち、暗い状態で)14。
  3. 照明後(例えば、 図3の72hpfで24時間)、ステップ4.3~4.9を繰り返して、照射された魚の脊髄を画像化する。

6. 脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的TDP-43の細胞質移動の可視化

  1. 画像ファイルを、https://imagej.net/Fiji/Downloads からダウンロードできるNIH Imageが開発したオープンソースのJava画像処理プログラムImageJ/Fiji21 (バージョン:2.1.0/1.53c)で開きます。
  2. Z スクロールバーを使用して、焦点面を移動します。[イメージ]|をクリックして、複数のスライスの最大強度投影を作成します 。スタック|Z プロジェクト |最大強度 と脊椎モーターカラムのヘミセグメントをカバーする開始スライスとストップスライスを設定します。
  3. [イメージ] をクリックして、マルチチャンネル 画像を 2 つのシングルチャンネル 画像に分割| カラー|チャンネルを分割します。
  4. EGFP-TDP-43z 信号を増強し、画像をクリックして細胞質 EGFP-TDP-43z がはっきりと見えるように ||を調整する明るさ/コントラスト と 調整最小
  5. [分析] をクリックして ROI マネージャ を開|ツール|ROIマネージャー。細胞体の相対位置に基づいて、48 hpf および 72 hpf の両方の画像で識別可能なセルを見つけます。EGFP-TDP-43z 信号で視覚化された単一の脊椎運動ニューロンの細胞体の輪郭を フリーハンド選択で概説し、ROI マネージャで [Add[t] を クリックして ROI を設定します。
  6. 直線を使用して直線を描画し、[分析]をクリックして、相馬の長軸を設定| 48 および 72 hpf の EGFP-TDP-43z (C1) および opTDP-43h (C2) 画像のプロット プロファイル。
  7. 各 EGFP-TDP-43z および opTDP-43h 信号の最大値で値を割ってプロット プロファイルを正規化します。X-y座標で正規化された値をプロットし、xとyはそれぞれ相馬の長軸を表し、相対蛍光強度を、統計ソフトウェアでXYグラフを使用して示します。

7. imageJ/フィジーを用いた opTDP-43h と EGFP-TDP-43z 信号の比比比較

  1. ImageJ/Fiji で画像ファイルを開き、6.1~6.5 の EGFP-TDP-43z の最大強度投影画像を使用して、単一 mnr2b-positive セルの ROI を設定します。バックグラウンド信号(バックグラウンドROI)を表す側腹側脊髄(例えば、脊索)の外にROIを追加します。
  2. EGFP-TDP-43z および opTDP-43 イメージごとに、[イメージ] をクリックして複数のスライスの投影 を作成|スタック|Z プロジェクト |合計スライス と設定開始スライスと停止スライスは、ヘミ脊髄モーターの列をカバーします。
  3. 最大強度投影イメージで作成された ROI マネージャーを開きます。EGFP-TDP-43z のイメージウィンドウを選択し、ROI マネージャで [すべて表示 ] をクリックして、スライスの合計イメージに ROI を表示します。ROI マネージャの [メジャー] をクリックして、ROI ごとの平均値を取得します。
  4. opTDP-43h の平均値を取得する 7.3 で提供されているのと同じ手順に従います。
  5. ROI ごとに、背景 ROI の平均値を差し引いた後、opTDP-43h の減算平均を EGFP-TDP-43z の減算平均で除算し、比率メトリック値を求めます。レシオメトリック値は、異なる時間ポイント間で比較することができ、Prismソフトウェアのカラムグラフを使用して表示されます。

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結果

ゼブラフィッシュ幼虫のmnr2b+脊髄運動ニューロンにおける光遺伝学的および非光遺伝学的TDP-43タンパク質の生画像化
ゼブラフィッシュの脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43相転移を誘導するために、N-およびC末語でmRFP1およびCRY2olig22でタグ付けされたヒトTDP-43hをそれぞれ、opTDP-43h14と呼び出した(図1A)。opTDP-43h遺伝子断片をmnr2b遺伝子座を含むBACに導入した(図1B)。得られたBACは、mnr2b-hs:opTDP-43hと指定され、Tol2トランスポゾン媒介BACトランスジェネシス19によってゼブラフィッシュゲノムに導入された。脊髄運動ニューロンにおける非光...

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ディスカッション

ゼブラフィッシュのopTDP-43hおよびEGFP-TDP-43zの mnr2b-BAC媒介発現は、脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43相転移の生画像化のためのユニークな機会を提供する。ゼブラフィッシュ幼虫の体組織の光学的透明性は、opTDP-43hの単純で非侵襲的な光遺伝学的刺激を可能にする。時間の経過に伴う単一の脊髄運動ニューロン間の比較は、opTDP-43hの光依存性オリゴマー化がALS病理を連想させる細胞質クラスタリングを引き起こすことを示した。

本質的に障害を起たたタンパク質の相挙動を定義する重要なパラメータの1つは、細胞内濃度である。高レベルのopTDP-43h発現は、光に依存しないopTDP-43hオリゴマー化、相転移、および凝集につながる可能性がある。したがって、脊髄運動ニューロンにおける安定した無毒性レベルのopTDP-43h発現の誘導は、脊髄運動ニューロンにおけるopTDP-43相転移の生理学的および病理学的影響の評価に成功するための鍵となる。opTDP-43 hのmnr2b-BAC媒介発現は、Tg[mnr2b-hs:opT...

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開示事項

KAとKKは、本稿に記載されている知的財産の発明者であり、原学研究所が仮特許を提出した。

謝辞

この作品は、セリクヤファンド(KA)、カケンヒグラント番号JP19K06933(KA)、JP20H05345(KA)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
共焦点顕微鏡オリンパスFV1200
落射蛍光顕微鏡ZEISSAxioimager Z1
蛍光実体顕微鏡ライカMZ16FA
ガラスベースディッシュ岩城3910-035
インキュベーターMEECN-25C
LEDパネルナノリーフリミテッドNanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgaroseLONZA50181
対物レンズOlympusXLUMPlanFL N 20×/1.00
対物レンズZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
光パワーメーターHIOKI3664
光センサーHIOKI9742-10
フェノールレッド溶液 0.5%メルクP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼタカラR050A
QIAquick ゲル抽出キットキアゲン28704
6ウェルディッシュファルコン353046
分光器プローブ BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
シリンジ針テルモNN-2725R
タカラ Ex タカラRR001A
トリケーンSigma-AldrichA5040
ゼブラフィッシュ BAC クローン CH211-172N16BACPAC ゲノミクスCH211-172N16

参考文献

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