完全麻酔血友病Aマウスにおける尾静脈切除出血モデル

サマリー

麻酔をかけたマウスにおける精製尾静脈切除(TVT)出血モデルは、血友病出血の評価のための敏感な in vivo 法である。この最適化されたTVT出血モデルは、失血と出血時間をエンドポイントとして使用し、他のモデルを改良し、死亡をエンドポイントとして回避します。

要約

尾出血モデルは、血友病研究、特に凝固促進効果の評価において重要なツールである。尾静脈切断(TVT)生存モデルは、臨床的に関連する用量のFVIIIに対する感受性のために多くの設定で好まれてきたが、テールクリップモデルなどの他の確立されたモデルは、より高いレベルの凝固促進化合物を必要とする。生存をエンドポイントとして使用しないようにするために、我々は失血と出血時間をエンドポイントとして確立し、実験全体を通して完全な麻酔を確立するTVTモデルを開発しました。簡単に説明すると、麻酔をかけたマウスは、尾部を温食塩水(37°C)に沈めて位置決めし、右側尾静脈に試験化合物を投与する。5分後、テンプレートガイドを使用して左側尾静脈をトランスセクトし、尾を生理食塩水に戻し、血液を採取しながらすべての出血エピソードを40分間監視および記録する。傷害後10分、20分、または30分で出血が起こらない場合、湿ったガーゼ綿棒で切り傷を2回拭くことによって血餅に優しく挑戦する。40分後、失血は生理食塩水に採血されたヘモグロビンの量によって定量化される。この迅速かつ比較的簡単な手順は、一貫性のある再現性のある出血をもたらす。TVT生存モデルと比較して、薬理学的介入に対する感受性を損なうことなく、より人道的な手順を使用する。さらに、3Rの原則に従って、繁殖する必要がある動物の総数を減らして、両方の性別を使用することが可能です。出血モデルにおける潜在的な制限は、止血の確率的性質であり、モデルの再現性を低下させる可能性がある。これに対抗するために、手動血餅破壊は、モニタリング中に血餅が挑戦されることを保証し、原発性(血小板)止血が出血を止めるのを防ぎます。出血傷害モデルのカタログへのこの追加は、標準化された人道的な方法で凝固促進効果を特徴付けるオプションを提供する。

概要

動物モデルは、血友病の病因を理解し、治療レジメンおよび治療法を開発および試験するために不可欠である。第VIII因子ノックアウトマウス(F8-KO)は、血友病A ^1,2の研究に広く使用されているモデルである。これらのマウスは、疾患の主要な特徴を再現し、組換えFVIII産物³、⁴、⁵および遺伝子治療戦略^6、7などの治療法の開発に広く使用されている。

インビボで異なる止血化合物の薬理学的効果を評価するための様々な出血傷害モデルがある。これらの凝固モデルの1つは、マウス⁸、⁹、^10、11、^12、

プロトコル

この議定書に記載されているすべての手順は、Novo Nordisk A/Sの動物福祉機関、およびデンマーク食品農業水産省のデンマーク動物実験検査官によって承認されています。最適化された40分の方法には、麻酔と投与時間が設計に含まれています(図1)。この手順には、10〜16週齢の両性の血友病マウスが必要である。

1. 学習前の準備

1. 正しい濃度で投薬溶液を調製する。
2. ウォーターバスを開始し、37°Cに加熱する。 採血用の15 mL遠沈管に生理食塩水(0.9% NaCl)を充填します。
3. 実験開始の少なくとも15分前に、加温したベースプレートの穴に15mL生理食塩水チューブを置く。
4. マウスを特定し、その体重を記録します。マウスを必要以上に扱うことは、ストレスを引き起こし、研究に影響を与える可能性があるため、避けてください。
5. ナプキン、テールホルダー、ガーゼ、注射器、メス、ストップウォッチ、血流表記用紙など、すべてが手の届くところにあるように、ヒュームフードにワークステーションを準備してください。
6. テールマークと切断ブロックを加熱プレートに置きます - 冷たいブロックは静脈を収縮させ、それによって出血に影響を与えます。

2.麻酔

....

結果

最適化されたモデルの適用性を評価するために、市販の組換え第VIII因子補充療法(rFVIII)を投与したF8−KO(C57BL遺伝的背景)マウスにおいて研究を実施した。1IU/kg、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの4つの異なる用量が試験された。さらに、陽性対照群としてC57BLマウスを用いたF8-KOマウスおよび野生型(WT)群における対応するビヒクル(陰性)対照を試験し、モデルにおける応答範囲を評価した。

最適化されたプロトコールに従って、ビヒクル群と比較してrFVIII処置群について失血の有意な減少があった。さらに、ビヒクル群と比較して、5IU/kg、10IU/kg、および20IU/kgの治療群で出血時間の減少が観察された(図2)。WTマウスでは、全失血は201.8〜841.9nmolのHgb(95%CI)の範囲であり、ビヒクルマウスでは5335〜7148nmolのHgb(95%CI)の範囲であった。全血の1000 nmolのHgb~125 μLのおおよその等価性に続いて、ビヒクル処理マウスの平均出血は780.25 μLであ.......

ディスカッション

尾静脈切断(TVT)のこの最適化された方法は、TVT生存法と比較していくつかの利点を有する。動物は研究期間全体にわたって完全に麻酔をかけられるため、マウスの取り扱いが容易になり、動物の健康が向上します。さらに、TVT生存モデルとは異なり、一晩の観察は必要なく、この最適化されたモデルは、失血を測定し、40分にわたって正確な出血時間を観察する可能性を提供する。また、意識のある動物における出血のより長い期間は、放血によって死を引き起こし、動物の痛みおよび苦痛およびおそらくストレスをもたらし、潜在的に変動の増加をもたらす¹⁴。失血と出血時間は、エンドポイントとしてうまく特徴付けられ、検証され、死または臨死までの時間を置き換えています。実際の尾部損傷は、TVTを実行するために切断ブロックガイドを使用し、再現可能な切断を確保し、手順の難しさと技術的変動性を低減するため、明確に定義され標準化されています。したがって、より高いモデルの堅牢性を達成し、必要な動物の数を減らすことができます。さらに、データは、3Rの原則に従って、雄および雌マウスの両方を使用することが可能であり、したがって繁殖する動物の総数を減.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#11メスの刃	Swann-Morton	503
15 mL遠心分離管	Greiner Bio-One、オーストリア	188271
300 G針を300 µに接続。L 精密(インスリン)シリンジ	BD Micro-Fine + U-100 インスリンシリンジ	320830
ベート	武田薬		組換え第VIII因子補充療法 (rFVIII)
アルコールパッド 70% エタノール	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
カッティングテンプレート (ステンレス鋼)	自己生産、あなたは正確な図面		補足図2:サイズ仕様:20ミリメートル×40ミリメートル×10ミリメートル(L x B x H)。溝:深さ3mm、幅3mm。半径1.5mm
赤血球(RBC)溶解液	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
ガーゼ
血液分析装置	シスメックス	CT-2000iv
スタンド上ヒーティングランプ	フィリップス	IR250
サーモスタット付ヒーティングパッド	CMA	モデル150
ヘモグロビンの基準と制御 - 8.81 mmol / lバッチ依存	HemoCue、デンマーク	HemoCueキャリブレーター、707037	標準とコントロールは、HemoCueキャリブレーターの2つの異なるガラスから作られています。この値は、ヘモグロビンの国際参照法 (ICSH) に対して決定されます。
チューブ、マスク、誘導ボックスを備えたイソフルオラン麻酔システム	シグマ デルタ ダメカ
イソフルラン	バクスター	26675-46-7
ライト付き拡大鏡	エッシェンバッハ
測定テンプレート (アルミニウム)	自己生産、正確な図面		については著者に連絡することを歓迎します補足図1:サイズ仕様:20 mm x 40 mm x 10 mm(L x B x H)。溝:深さ2.5mm、幅2.5mm。半径 1.25 mm
マイクロピペット + チップ	フィンピペット
光度計	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	バージョン 9.0.1
生理食塩水 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
TVTテールカット		用特殊テールマーカーブロック
テールホルダー
真空液体吸引	Vacusafe comfort、IBS
ウォーターバス、サーモスタット	TYP 3/8 Julabo

アド品 日本 の著者に連絡することを歓迎されています