生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

蛍光分光法は、細胞内での摂動を最小限に抑えてタンパク質のダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を定量化する主な方法の1つです。共焦点蛍光相関分光法(FCS)は、分子動力学を単分子感受性、高選択的、および生細胞適合性1として解析する強力な方法の1^つである。他のダイナミクス指向のアプローチと比較して、FCSは〜nsから〜sに及ぶより広範な測定可能な時間範囲を有し、最も重要なのは、イメージングベースの方法でアクセスできないことが多い高速時間スケールをカバーする。また、膜、細胞質、核分子動力学が容易に識別できるように空間選択性も提供^する2。これにより、分子ブリンク、平均局所濃度、および拡散係数をFCSで定量的に解析することができる。結合などの分子間ダイナミクスは、二重色アプローチで蛍光相互相関分光法(FCCS)分析^3、4、5における2つの分子種の共拡散を調べた場合に容易にアクセス可能になります。

相関分光法における主な根底原理は、蛍光標識された生体分子がレーザー焦点の出入りを拡散して放出する強度変動の統計分析である(図1A)。結果として得られる自動相関関数または相互相関関数は、曲線フィッティングによってさらに分析され、最終的に関心のあるレート定数を導き出すことができます。言い換えれば、FCSおよびFCCSの統計的方法は、単一粒子追跡のような単一分子トレースを提供するのではなく、高い時間分解能を有するプローブ標本の動的パターンまたは「指紋」を提供する。フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせると、共焦点設定^5,6において、立体構造変化などの分子内ダイナミクスを同時に監視することができる。FRETは2つのフルオロフォアの距離をプローブし、しばしば分子「ナノルーラー」と呼ばれます。エネルギー移動は、分子が近傍(<10nm)に位置する場合にのみ行われ、ドナーの発光スペクトルはアクセプター分子の吸収スペクトルと著しく重なり、ドナーとアクセプターの双極子配向が(十分に)平行である。従って、FRETとFCCSの組合せは非常に高い時空間分解能の技術を提供する。空間選択性、感度、生細胞適合性が必要な場合、FRET-FCCSは、等温滴定熱量測定(ITC)7、表面プラズモン共鳴(SPR)8、または核磁気共鳴(NMR)9、タンパク質ダイナミクスおよび相互作用を測定するための¹⁰のような他の方法よりも明らかに有利である。

デュアルカラー蛍光相互相関分光(dc-FCCS)の能力と約束にもかかわらず、ライブセルでdc-FCCSを実行することは、スペクトルブリードスルーまたはチャンネル^3、4、スペクトル異なるレーザーライン^{3、4、11、}バックグラウンド、またはノイズフォトのスペクトルに起因する共焦点ボリュームの違いにより技術的に困難です^{。 13、14、15}。FCCSへのパルスインターリーブ励起(PIE)の導入は、チャネル¹⁶間のスペクトルクロストークを低減するための異なるレーザー励起を時間的に切り離す重要な調整であった。スペクトルブリードスルー^17、18、19に対抗する他の補正方法および背景補正も^17、18、19で十分に受け入れられている。FCS、PIE、FRET の詳細と基本については、読者は、次の参照先^2、4、^6、16、20^、21、^22、23、24を参照してください。

ここでは、プロトタイプGタンパク質共役受容体、β 2 -アドレナリン受容体(β 2 AR)の実験結果と共に必要なすべての較正実験および分析が提示され、(1)「緑」(eGFP)または「赤」(SNAPタグベースの標識⁾²⁵フルオロフォアを持つ単一標識分子。(2)二重標識構造物で、N末端SNAPタグおよび細胞内eGFP(NT-SNAP)を有する[この場合、両方の標識が同じタンパク質である。したがって、100%の共拡散が予想される](3)二重標識サンプルで、両方の蛍光体が細胞膜の同じ側にある(CT-SNAP)。C末端のスナップタグと細胞内eGFPを搭載しています。ここで、再び両方の標識が同じタンパク質にあり、再び100%共拡散が予想される。両方のラベルが互いに非常に近く、細胞膜の同じ側に、FRETおよび反相関行動を観察する可能性を示す。全ての構成体は中国のハムスター卵巣(CHO)細胞でトランスフェクションされ、後にCT-SNAP構築物のNT-SNAP構築物に対して膜不透過性および膜透過性である赤色蛍光基質で標識された。最後に、シミュレーションデータは、FRET誘導の非相関に対する実験パラメータの影響と、タンパク質とタンパク質の相互作用が共拡散振幅に及ぼす影響を例示します。

したがって、このプロトコルは、技術的/物理的なアーティファクト、課題、および可能な解決策を認識しながら、タンパク質ダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を理解するために、生細胞で組み合わせたFRET-FCCSを実行するための完全なガイドを提供します。

1. 実験プロトコル

1. サンプル準備
   注:無菌条件下で細胞の播種とトランスフェクションを行います。
   1. 洗浄されたカバースリップを6ウェル培養プレートに入れ、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で3回洗浄します。
      注: カバースリップクリーニングプロトコルについては、 補足ノート 1を参照してください。
   2. フェノールレッドを含む完全な細胞培養培地2mL(10%ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を加え、プレートを脇に置きます。
   3. CHO細胞を37°C及び5%CO2でフェノールレッドを含む同一培地で培養_する。 5 mLのPBSで細胞を洗浄し、死んだ細胞を除去します。
   4. 2 mLのトリプシンを加え、室温(RT)で2分間インキュベートします。
   5. フェノールレッドを含む培地8mLで切り離した細胞を希釈し、ピペットで慎重に混ぜます。
   6. ノイバウアーチャンバー内の細胞を数え、カバーリップを含む6ウェル細胞培養プレートの^1.5 x 10 5細胞/ウェルの密度で種子を入れます(ステップ1.1.1-1.1.2で作成)。
   7. 約80%の合流を達成するために、細胞を24時間インキュベーター(37°C、5%CO2)で増殖させます。
   8. 目的のベクターDNA(例えば、CT-SNAPまたはNT-SNAP)の2μgを2つの別々のチューブに希釈し、各ウェルに対して500μLの還元血清培地をそれぞれ含み、RTで5分間インキュベートする。
   9. 2つの溶液を混ぜ合わせてトランスフェクション混合物を得て、RTで20分間インキュベートします。
   10. その間に、播種したCHO細胞を滅菌PBSで一度洗います。
2. 
   
   4. 
      
3. 1. 
      
   2. 
      
   3. 
      

較正および生細胞測定の例示的な結果は、以下で議論される。さらに 、CCFPIE 振幅を増加させるタンパク質とタンパク質相互作用の効果に続くシミュレートされたデータに基づいて、相互相関曲線に対するFRETの効果が実証されています。

PIE ベースの FCS データエクスポート
PIE実験では、タイムタグ時間分解モード(TTTR)29,30でデータが収集されます。図1Bは、記載された設定上の二重標識DNA鎖のPIE測定のフォトン到着時間ヒストグラムを示す(補足注1)。セットアップには 4 つの検出チャネルがあります。蛍光放射は、まず「S」と「P」方向の偏光によって分割されます(光波の電界が振動している垂直および平行面を指します)。次に、検出前に偏光の方向を 2 つのカラー チャネル(緑、赤)に分割し、4 つのチャンネル(S-green、S-red、P-green、P-red)を生成します。「プロンプト」タイムウィンドウでは、緑色の蛍光素が励起され、FRETによる緑と赤の両方のチャンネルで信号が検出されます。遅延時間ウィンドウでは、赤色の蛍光素のみが表示されます( 赤チャネル内)。検出チャネルと「プロンプト」と「遅延」タイムウィンドウに基づいて、少なくとも5つの異なる相関曲線(3つの自己相関曲線(ADF)および2つの相互相関曲線(CCF))が得られる(図1C-D):(1)プロンプト時間枠(ACFgp)の緑色の信号(FRET、ACF rpの場合) (3) 遅延時間ウィンドウ内の赤色の信号 (ACFrd)これらのADFは、タンパク質移動度、光物理学(例えば、三重点滅)および蛍光性蛍光体の他の時間相関性の明るさ変化(FRETによるものなど)について報告する。(4)遅延時間ウィンドウ内の赤色信号を用いたプロンプトタイムウィンドウにおける緑色信号のPIEベースの相互相関CCFPIEにより、緑と赤色のフルオロフォア16の共拡散の割合を求める。(5)プロンプトタイムウィンドウ内の赤色信号を伴う緑色のFRETベースの相互相関CCFFRETは、FRET誘導、緑および赤色信号31、32、33における反相関輝度変化に関連している。

図1:パルスインターリーブ励起(PIE)ベース蛍光(十字)相関分光(F(C)CS)(A)において、FCSでは蛍光標識分子は、この小さな体積内で蛍光を誘発する焦点を合わせたレーザービームによって形成された(回折限定の)焦点体積に自由に拡散する。その結果、体積に出入りする分子の強度変動が相関し、分子の移動度に関する情報を提供します。(B) PIEでは、2つの異なる蛍光体(緑色」と「赤」)で標識されたサンプルを励起するために、2つの異なるレーザーライン(「プロンプト」と「遅延」)が使用されます。両方の励起パルス間の時間差は、他方が励起される前に一方が減衰するように、それぞれの蛍光の寿命に適応される。示されている二重標識サンプルでは、両方のフルオロフォアが「緑色」ドナー蛍光機から「赤」アクセプターフルオロフォアにフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を受けるのに十分近い。したがって、赤色蛍光発光は、緑色ドナーの励起時に「迅速な」時間枠で検出することができる。使用されるセットアップ(補足注2)では、各色に対して2つの検出器が使用され、励起ビームの向き("p"と示される)と第2の垂直("s"と示される)に平行に向けられた1つの検出器が使用されます。(C) PIE実験では、3つの異なる自己相関関数を決定することができます:i)グリーンチャネル信号の相関をプロンプトタイムウィンドウ(ACF gp)、ii)プロンプトタイムウィンドウ(ACFrp)およびiii)の赤色チャネル信号で、遅延時間ウィンドウ(ACFrd)に赤色チャンネル信号を入力します。(D) 2つの異なる相互相関関数を決定することができます: iv) 「PIE」相互相関(CCFPIE) のプロンプトタイムウィンドウの緑色のチャネル信号と、遅延ウィンドウの赤チャネル信号と相関し、この曲線の振幅がフルオロフォアの同時拡散に関連する。v) プロンプト時間枠内の緑色のチャネル信号との "FRET" 相互相関 (CCFFRET) が同じプロンプトウィンドウ内の赤チャネル信号と相関する。ここで、この曲線の形状は拡散よりも速い時にFRET誘導強度変化に関連している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

キャリブレーション
図2A-Bは、それぞれ緑色と赤色の蛍光色素を1度拡散した検光量測定を示す。eq. 1と既知の拡散係数D緑色26及びD赤色27との適合度に基づいて、検出体積の形状(z0及びw0)及びサイズ(Veff)をeq. 2a-cを用いて算出する。赤色蛍光素から緑色蛍光素とACFrdからのACF gpからの適合結果を図2Cに要約する。両方のフルオロフォアは、それぞれ8.6 μs(18%)と36 μs(15%)の追加の緩和時間定数を示します。緑色と赤色のフルオロフォアの分子明るさ(eq. 5a-b)は、それぞれ1分子当たり12.5kHz、分子当たり2.7kHzに相当します。

共焦点の容積サイズと形状、および分子輝度の信頼性の高い推定のために、キャリブレーション実験およびすべての反復の関節(またはグローバル)適合ごとに3〜5の測定を行うことを推奨します。

この蛍光色素対のクロストークα(図2D、eq.3)と緑レーザー δによるアクセプタの直接励起(図2E、eq.4)は、それぞれ〜38%〜〜15%である。

図2:緑と赤の校正基準を自由に拡散する口径測定(A-B)2nMグリーン(A)と10nM赤色(B)の測定を行い、3D拡散モデルに適合するキャリブレーション標準測定(eq.パネルの表(C)は、eq. 2a-cおよびeq. 5a-bに基づく適合結果と派生パラメーターを示しています。*拡散係数は文献26,27から取られた。(D) 緑色信号の赤いチャネルへのクロストークαの決定 (eq. 3)緑色標準の励起スペクトルはシアンで示され、発光スペクトルは緑色である。485 nm(青)と561 nm(オレンジ)の励起レーザラインは、破線で示されています。透明な緑色およびマゼンタボックスは、収集された放出範囲を示す(補足注 2)。(E)485nmレーザーによる赤色蛍光色素の直接励起δの測定(eq. 4)。カラーコードは(D)、明るいオレンジと濃いオレンジ色と同一で、それぞれ赤色標準の励起スペクトルと発光スペクトルを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

緑と赤色の励起体積の重なりを決定し、較正するために、上述のように二重標識DNA二重鎖(図3A)を用いる。ここで、フルオロフォアは、DNA二重鎖の末端に付着した緑色と赤色のフルオロフォアの間にFRETが発生し得ないような間隔を40bp離した。図3Bは、緑色のフルオロフォア(ACFgp)とマゼンタ(ACFrd)およびPIE-相互相関CCFPIEの両方からの自己相関をシアンで示しています。CCFPIEの場合、プロンプトタイムウィンドウの緑色チャンネルの信号は、遅延時間ウィンドウ16の赤チャンネルの信号と相関していることに注意してください。

ここで、DDNA=77μm²/sのDNA鎖に対する平均拡散係数が得られる。計算の詳細については、ステップバイステップのプロトコルである補足ノート4を参照してください。この値は、較正された緑色および赤色の検出容積サイズ(図2)と、DNA鎖のACFgpおよびACFrdのそれぞれの拡散時間(図3C)を式2aに挿入することによって得られる。次に、得られた補正値rGRおよびrRGを使用し、後でeq.6を使用して、共拡散の量、すなわち、二重標識分子(または2つの異なるタンパク質の共トランスフェクションの場合のタンパク質複合体)を細胞試料から求めることができる。

図3:DNAサンプルを用いた緑と赤色の重なり容積の較正( A) 較正に使用されるDNA鎖は、緑と赤色の校正フルオロフォアを運び、その間に40 bpの距離を持つ。この間の距離は、フルオロフォア間のFRETを除外するのに十分な大きさでなければならない。(B)10nMDNA溶液の60sの測定を代表する。緑色のフルオロフォア(ACFgp、緑色標準)とマゼンタ(ACFrd、赤色標準)およびPIE相互相関CCFPIE(青)の両方からの自己相関。パネル内の表(C)は、付加的な緩和項(eq.1)およびDNAの導出パラメータ拡散係数を含む3D拡散モデルに基づく適合結果を示し、DDNA(eq. 2a)、オーバーラップ体積の大きさと形状(eq. 2a-c)および補正比rGRおよびr RG(eq6)を含む。).緑と赤の検出ボリューム(*で示される)の値は、図2に示す個々のフルオロフォアの適合から取られたことに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

生細胞実験
以下のセクションでは、2つのAR構成体の異なるβの生細胞実験の分析を提示する。β 2ARが膜タンパク質であるように、その拡散は、細胞膜に沿って二次元拡散(図4A)に限られる(膜との間の輸送またはリサイクルプロセスを除く) 2。2D拡散に制限がある場合、eq.1における形状係数s=z0/w0は廃止され、拡散モデルが簡略化される(eq. 9)。

シングルラベル構造: β2AR-IL3-eGFP および NT-SNAP-β2AR
図4は、単一標識構造β 2AR-IL3-eGFP(図4B)の例示的な測定を示し、そこでeGFPが細胞内ループ3に挿入され、構造NT-SNAP-β 2 AR(図4C)、スナップタグがβ 2ARのN末に結合する。SNAPタグは、膜不透過性のSNAP表面基板でラベル付けされています。代表曲線は、それぞれ120〜200sの取得時間を有する4〜6回の繰り返し測定の平均を示す。eGFPおよびSNAP信号のACFgpおよびACFrdのそれぞれの自己相関は、二相性、二次元拡散モデル(eq.9)に適合する。高速ダイナミクスの点では、eGFPはtR1〜9 μsで予想される三重項点滅のみを示し、SNAP信号は2回の緩和時間を必要とします。

生きている細胞における蛍光色素の分子明るさは、与えられた励起条件(eqs. 5a-b)の下で、1分子当たり0.8 KHz(eGFP)および1.7kHz(SNAP)である。標識β 2AR構成体の濃度は、ナノモル範囲に収まるべきであり、eq8を用いて、平均分子数(eq.9、図4C)および緑と赤色チャネルのそれぞれの共焦点体積の大きさによって決定することができる。

図4:単一標識構築物の代表的な測定を行った β。検出容積を通して自由に浮遊する検光に用いられるフルオロフォアやDNA鎖とは対照的に、膜タンパク質は主に膜に沿って横方向に拡散し、2次元拡散と呼ばれる。(B, D)シングル・ラベルのACFgpおよびACFrd は、2AR-IL3-eGFP (B) および NT-SNAP-β2AR (D) をβします。図は、120~200sで収集した4~6の測定値の平均です。パネルの表(C)は、追加の緩和項を含む二相的な2次元拡散モデルへのデータの適合結果を示す(eq. 7)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ダブルラベル構造: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
二重標識構造NT-SNAP-β 2AR-IL3-eGFP(短いNT-SNAP)では、eGFPが細胞内ループ3に挿入され、そして、スナップタグがβ 2ARのN末に結合した(図5A)。この構成では、eGFP は膜の内側にあり、外側のスナップは FRET の距離が長すぎます。理想的な場合には、この構成体は、緑と赤のフルオロフォアの100%の共拡散を示し、FRET信号を示さない。図5B-Dは、2つの異なる測定日における2つのセルにおけるNT-SNAPの2つの測定値を示す。図5Bに示す「より良い」測定値のACFgpとACFrdをeq.9と共にフィッティングすると、ACF gpとACFrdに焦点を当てた50~60分子が明らかになり、NアプリはCCFPIE(図5C)に1/G0(t c)~114).標識された受容体の濃度は、eq. 8で決定される〜100 nMの範囲にある。二重標識分子の平均濃度を求めるには、まず、CCFPIEのG0(tc)(1/N(app))とACF gp及びACF rdの比をそれぞれ、算出する(eq. 6)。次に、これらの値は、rGRcell=0.43およびrRGcell=0.53と、この測定日のDNA測定から得られた値(rGR,DNA=0.51およびr RG,DNA=0.79)と比較される。プロポーションの規則を用いて、eGFP信号のACFgpからのrGRcell=0.43は、0.84の共拡散(rGRcell/rGR,DNA)の一部に反映され、SNAP基板信号のACFrdの他の場合、この値は0.67に相当する。二重標識NT-SNAP構成の平均濃度は、最終的にeq. 10に基づいて計算することができます。これに対し、別の日から図5Dに示す測定では、受容体の濃度が非常に低く、データが非常に騒々しく、適合範囲が10μsまで制限される。また、少量の共拡散(15~26%)しか観察されない。

図5:二重ラベル付きNT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFPコンストラクト(A)二重標識構造では、eGFPが細胞内ループ3に挿入され、β 2 AR(NT-SNAP)のN末に取り付けられたSNAPタグが挿入される。(B, D)ACFgp、ACF rdおよびCCFPIEは、二重標識構造の2つの測定値を測定した。データは、二重モードの2次元拡散モデル(eq.9、CCF PIE)に適合し、追加の緩和項(eq.7、ACF gpおよびACFrd)を含む。パネル内の表(C)は、適合結果と導出されたパラメータ濃度(eq.8)、相関相関時間ゼロ(G0(tc))における相関振幅の比と共拡散分子の割合(eq. 10)を示す。測定は異なる日に取得されたので、振幅補正のためのわずかに異なる要因が使用されたことに注意してください(B:r GR、DNA = 0.51およびrRG、DNA = 0.79;D: rGR,DNA = 0.51 およびrRG,DNA = 0.56)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

FRET を受ける二重標識構造: β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
二重標識構造β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (図 6A))では、eGFP は、C 末に取り付けられた SNAP タグ付きの NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP コンストラクトと同一の細胞内ループ 3 に挿入されます。ここで、両方の標識は細胞の形質膜の同じ側にあり、蛍光体が近傍に入るようにして、FRETが焼入れeGFPの寿命で示されるように生じることとなる(補足注5)。C末流34およびGPDR35の少なくとも2つの異なるタンパク質立体構造、「高FRET」(HF)または「低FRET」(LF)のような比較的非構造化タンパク質領域の柔軟性を考慮すると、eGFP-SNAP距離変化によるFRET効率の動的変化を観察し、CCFFRETの抗相関項(図6Bのオレンジ曲線のオレンジ)によって同定することができた。).FRETの変動は、受容体がHFまたはLFのいずれかである一度に1つの状態にしかなることができないので、反相関であることが示されている。5つの相関曲線(図6B)の関節(またはグローバル)適合は、〜100 msでゆっくりと拡散分子の70%〜70%を明らかにし、残りは〜1ミリ秒で拡散する。すべての自己相関とCCFFRETは、37 μsおよび3 μsで緩和項を示します。赤信号によって支配されたこれらの相関(ACFrp、ACF rdおよびCCFFRET)は、追加の遅い成分〜50 ms(図6C)を示す。

異なる条件下でのCCFFRETのFRET誘導変化(図6D)は、LF状態とHF状態の間の変動時間が70μの2状態システムの一連のシミュレーションによって実証されています。LF から HF 状態に切り替えると、反相関信号の変化がプロンプトタイム ウィンドウで観察されます: 緑色の信号が減少し、赤信号が増加します (逆に HF-> LF スイッチングの場合も同様です)。HF-LF切り替えが拡散時間よりも速いタイムスケールで起こる場合、つまり、焦点中の分子の滞留時間中に、その速度はCCFFRET6、31、36における抗相関から導き出すことができる。FCSでは、拡散時間よりも遅い動的プロセスは観察できませんのでご注意ください。

このデモでは、2 つの異なる FRET シナリオが想定され、2 つの状態間の FRET 効率の中程度または最大の変化が示されました。シミュレーションはバービュレーター37を用いて行い、三重項点滅の不在または存在を考慮し、赤色チャネルへのドナークロストークの量を増加させる。拡散項は、tD1=1msで30%の高速拡散分子を有する双性分布としてモデル化し、残りの分子はtD2= 100msでゆっくりと拡散する。合計で、107フォトンがw 0 = 0.5 μm、z 0 = 1.5 μm、ボックスサイズ20、N FCS = 0.01の3Dガウス形のボリュームでシミュレートされました。

図6E-Fは、中程度のFRET誘発相関CCFFRET(図6E)および最大FRETコントラスト(図6F)が存在しない場合のシミュレーション結果(実線)および三重項点滅(破線)の存在を示しています。FRET誘導抗相関は図6Fで容易に見ることができる。三重化状態を追加すると「減衰」効果により、相関振幅(図6E-F)38,39 が減少する。

図6:動的FRETを示す二重標識サンプルのシミュレーション(A)細胞内ループ3に挿入βされたeGFPとC末端SNAPタグを有する2ARのダブルラベル付き。両方のフルオロフォアはFRETを受け、受容体がタンパク質ダイナミクスを受けた場合、FRET効率の変化を示すのに十分近いです。(B) 自己相関 (ACFgp, ACFrpおよびACFrd) eq. 7) と交差相関曲線(CCFFRET (eq. 7) およびCCFPIE (eq. 9) の測定例を示す。パネルの表(C)は、適合結果を示しています。(D-F)実験パラメータが予想されるに及ぼす影響を示すために、FRET誘発性非相関項、12のシミュレーションを実施し、FRET効率の変化(小さいまたは大)、アクセプターチャネルへのドナークロストークの異なる量(0%、1%または10%)および三重瞬きの不在および存在をモデル化した。両方のFRET状態の平衡分率は50:50と仮定され、それらの為替レートは得られた緩和時間t R = 70 μsになるように調整した。シミュレーションの詳細はテキストに表示されます。(E) CCFFRETのシミュレーション結果は、適度なFRETコントラストを有し、クロストーク(ダークオレンジ)、クロストーク(オレンジ)1%、クロストーク10%(ライトオレンジ)がない場合。実線は、トリプレットの存在下で三重線、破線が存在しない結果を示す。(F)最大のFRETコントラストを有するシミュレーション結果のCCF FRET。カラーコードは(E)と同じです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

しかし、実験条件に最も類似したシミュレーション(α=10%、15%の三重線点滅および中程度のFRETコントラスト、図6Eの黄色の破線)では、非相関項はほぼ減少する。図7は、蛍光寿命相関分光法(FLCS)17、19または種フィルタFCS(fFCS)18を用いて、光子到着時間ヒストグラムに符号化された情報(すなわち蛍光寿命)を用いてこの模擬データを分析した結果を示す。ここで、既知のHFおよびLF種の蛍光寿命(図7A)は、相関手順中に適用される重み又は「フィルタ」(図7B)を生成するために使用される。得られた種-自己相関曲線と交差相関曲線(図7C-D)では、この非相関性が明確に観察される。

図7:寿命フィルタFCSは、CCFFRETにおけるFRET誘導抗相関をマスキングする高いクロストーク、有意な三重項まばたきまたは他の光物理学的または実験的特性を有するサンプルにおけるFRET効率のタンパクダイナミクスベースの変動を明らかにするのに役立つ。ここで、10%クロストークと5%三重点滅を含むシミュレーションに対して図6Eに示すデータに対するアプローチを例示する。(A)2つのFRET種(それぞれ高低FRETの光と濃緑色)およびIRF(グレー)の蛍光強度減衰パターンを正規化した。並列検出チャネルのパターンは、垂直検出チャネルの実線、破線で示されます。(B)(A)に示すパターンに基づいて重み付け関数または「フィルタ」が生成されたのは、カラーコードが(A)と同一である。緑検出チャネルの信号のみ、したがってFRET誘発ドナーの消音のみが考慮されることに注意してください。(C)4つの種選択的相関が得られる:低FRET状態(sACFLF-LF、濃緑色)と高いFRET状態(sACFHF-HF、ライトグリーン)の種自己相関と、低FRETと高FRET状態(sCCF LF-HF、濃橙色)と(sCCF HF-LF)の間の2種の相互相関(sCCFLF-LF-LF-LF)および逆(sCCF HF-LF-LF) 、オレンジ色)。sCCF は μs 範囲の反相関を明確に示しています。黒い破線はフィット感を示します。sACF はeq. 9および sCCF とeq. 11と合わせていました。パネルの表 (D) に適合結果が示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

タンパク質とタンパク質の相互作用(PPI)を研究するためのCCFPIE振幅
最後に、生細胞におけるPIEベースのFCSの一般的な使用例は、2つの異なるタンパク質間の相互作用を研究することです。ここで、読み出しパラメータは、CCFPIEの振幅、またはCCF PIEの振幅に対する自己相関振幅ACFgpおよびACF rdの比である。CCFPIEに対する共拡散の増加の効果を示すために、2つのAR-IL3-eGFPとNT-SNAP-β 2 AR β 2つの単一標識構造に基づいてシミュレーションが行われている(図8A)。図8Bは、共拡散分子の分画が0%から100%に変化した場合にCCFPIEの振幅がどのように増加するかを示す。遅延時間ウィンドウの赤チャネルに緑色の信号の1%のクロストークが追加され、上記のようにモデル化された拡散成分が追加されました。

図8: CCFPIEを用いて2つのタンパク質の相互作用を研究することができるが、ここでは、NT-SNAP-β 2 AR("赤"SNAP-ラベルを持つ)を用いたβ 2AR-IL3-eGFPの共同トランスフェクション研究を模擬した。(B)共拡散分子の増加量(0%(濃い青色)->100%(水色))の振幅G(tc)が増加する。拡散項は、tD1=1msで30%の高速拡散分子を有する双性分布として再びモデル化され、残りの分子はtD2=100msでゆっくりと拡散した。さらに、赤遅延時間ウィンドウに緑色信号の1%クロストークが追加されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:変数と略語のリスト 蛍光およびFRET実験におけるシンボルおよび定義の使用については、FRETコミュニティ40 のガイドラインが推奨される。

補助ファイル:

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