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方法論記事

自動酸化およびニトロソ化化合物からの一酸化窒素およびその誘導体の検出のための化学発光ベースのアッセイ

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DOI：

10.3791/63107

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2022年2月16日

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1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

この記事について

サマリー

ここでは、化学発光ベースのアッセイを高感度に使用して、一酸化窒素およびその生物学的に関連する誘導体を検出するためのプロトコルを提示する。

要約

インビボにおける一酸化窒素(NO)活性は、その直接的な効果、NO自己酸化から生成されるその誘導体の作用、およびニトロソ化化合物の効果を組み合わせた結果である。NO代謝産物の測定は、血管レベルおよび他の組織の両方で、特に外因性NOが投与される実験環境において、NO活性を研究するために不可欠である。オゾンベースの化学発光アッセイは、体液(血漿、組織ホモジネート、細胞培養物を含む)および混合ガス(呼気など)の両方におけるNOおよびNO代謝産物の正確な測定を可能にします。NOはオゾンと反応して励起状態で二酸化窒素を発生する。結果として生じる発光は、光検出および試料のNO含有量を反映する電気信号の発生を可能にする。同じサンプルからのアリコートを使用して、硝酸塩、亜硝酸塩、S-ニトロソチオール、鉄-ニトロシル錯体などの特定のNO代謝産物を測定することができます。また、無細胞ヘモグロビンによって消費されるNOも化学発光分析により定量される。これらすべての手法の図を示します。

概要

サルバドール・モンカダとノーベル賞受賞者のロバート・フルチゴット、ルイ・イグナロ、フェリド・ムラドが一酸化窒素(NO)を以前に知られていた内皮由来の緩和因子(EDRF)として同定して以来、NOの中心的な役割は、血管生物学、神経科学、代謝、および宿主応答全体にわたるいくつかの重要なメカニズムにおいて確立されている1,2,3,4,5,6,7。.NOガスの外因性投与は、新生児8における肺高血圧症による呼吸不全に対する確立された治療法となっている。一酸化窒素ガスはまた、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染、マラリアおよび他の感染性疾患、虚血再灌流傷害の治療、および心臓手術を受けている患者の急性腎障害の予防のために研究されている9、10、11、12。NO、その代謝産物、およびその標的タンパク質および化合物のレベルを評価するための正確な測定技術の必要性は、機構的および介入的研究の両方から生じる。

その高い反応性のために、NOは、それが産生および/または放出される生物学的マトリックスに応じて異なる反応を受け得る。ヘモグロビン(Hb)または他のオキシヘモタンパク質の非存在下では、NOはほぼ完全に亜硝酸塩(NO2−)に酸化される。

2NO + O 2 → 2NO2

NO 2 + NO → N2O3

N 2 O3 + H 2 O →NO2- + H+

NOは、まず分子状酸素(O2)による自動酸化を受けて二酸化窒素(NO2)を生成し、NO2自体と反応して三酸化二窒素(N2O3)を生成する。N2O3の1分子は水(H2O)と反応してNO2-とプロトン(H+)13の2分子を形成する。全血14、15内では、これらの分子がHb[Hb-Fe2+-O2またはオキシヘモグロビン(oxyHb)]の酸化ヘム基と激しく反応してNO3-を生成するため、NOおよびNO2-は硝酸塩(NO3-)に急速に変換される。この反応は、ヘム基の第二鉄状態[Hb-Fe3+またはメト化物(metHb)]への遷移と結合している:

Hb-Fe2+-O2 + NO→ Hb-Fe3++NO3-

赤血球(RBC)関門および内皮のすぐ隣の空間は、この反応を制限する主な要因であり、内皮によって放出されるNOのごく一部がEDRF16,17として作用することを可能にする。実際、循環中の無細胞Hbは、実験的および臨床的設定において血管拡張を破壊することが知られている17、18。RBC内では、酸素化およびNO2-濃度に応じて、NOの一部がデオキシヘモグロビン(Hb-Fe2+)と反応して鉄ニトロシルHb(Hb-Fe2+-NOまたはHbNO)を形成する:

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

RBC15,17において、NO2−は、NOの放出につながるHb−Fe2+を減少させることによってHb−Fe3+を形成することができ、これは次にHb−Fe2+−O2(優先的に)またはHb−Fe2+と結合する。

NO誘導体の生成は、NOが様々な組織および異なる酵素(例えば、腸内細菌またはミトコンドリア内、特に低酸素条件下で)によってNO2−およびNO3−から再生され得るので、厳密に一方向であると考えるべきではない19,20。

産生(または投与)される可変量のNOは、主に求核剤の存在下でのN2O3からのチオールトランスニトロソ化によって、S-ニトロソチオールの下流生成をもたらし、NO+ドナー中間体(Nuc-NO+-NO2-)を生成する:

N 2 O3 + RS- → RS-NO + NO2-

S-ニトロソチオール生成の別の可能性は、酸化チオールのニトロシル化(酸化チオールと反応しない)である:

RS• + いいえ → RS-いいえ

この機構およびNO2 による直接チオール酸化は、他の場所21に記載されている非常に特定の条件においてのみ可能であり得る。S-ニトロソチオールは、S-ニトロソグルタチオンのような軽分子から大きなチオール含有タンパク質まで多岐にわたります。S−ニトロソヘモグロビン(S−NO−Hb)は、β鎖(β93C)22において保存されたシステイン残基のチオール基のニトロソ化によって形成される。

S-ニトロソチオールの生成および代謝は、重要な調節機構の一部である。例としては、グルタチオン、カスパーゼ、N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)、およびリアノジン受容体23、24、25、26、27、28の調節が挙げられる。以前はインビボでのNO生物学の主要なメディエーターと考えられていたニトロソ化アルブミン(S-ニトロソアルブミン)は、特定の追加の生物学的活性を伴わないNO/NO+トランスポーターであるようである29。

生体マトリックス中の特定の生体試料からのNOおよびその誘導体の濃度を測定する場合、酸性度、酸素化、温度、試薬の存在などの特性を考慮することが重要です。例としては、投与された外因性NOドナー、および、急性炎症の設定において、過酸化水素(H2O2)がNO2と反応して、ペルオキシ亜硝酸塩(ONOO)21のような超常的な濃度のフリーラジカルの生成をもたらす。採用されている分析方法に加えて、サンプル調製および保管の前分析段階が基本です。インビボNO活性を表さない下流反応は、予測され、考慮され、遮断されなければならない。有効な例は、S−NO−Hbの不安定性であり、測定22の対象とされる場合、血液試料の専用治療を必要とする。

化学発光ベースのアッセイは、組織ホモジネート30、31を含む任意の生体液中のNOおよびその主要代謝産物[NO2-、NO3-、S-NOおよび鉄-ニトロシル錯体(Fe-NO)]のレベルを検出するためのゴールドスタンダードである。これらの方法は、NOとオゾン(O3)との反応を収容する装置である化学発光検出器(CLD)に依存し、励起状態でNO2を生成する(NO2•)。NO2•の緩和は、光電子増倍管によって検出される光の光子の放出を引き起こし、サンプリングされた混合ガス32のNO含有量に正比例する電気信号を生成する。CLDの簡略化された回路図が表されている。

化学発光セットアップ:NO + O₃からNO₂*への反応。光電子増倍管;図は光放射を表示します。
図1:一酸化窒素ガスの化学発光検出器の簡略回路図。化学発光ベースの一酸化窒素(NO)検出は、化学発光検出器(CLD)に導入されるNOガス分子あたり1つの光子の化学量論的生成である。化学発光反応は、内部発電機からオゾン(O3)を供給された指定チャンバ内で得られ、外部ポンプとの接続により負圧に保たれ、サンプルガスの連続的かつ一定の流入を可能にする。O3の生成には、CLDに接続された専用のO2タンクによって供給される二原子酸素(O2)が必要である(他の製造業者は周囲空気で動作するCLDを提供している)。反応室内では、サンプリングしたガスに含まれるNOガスの各分子が酸素と反応し、活性化状態の二酸化窒素(NO2*)が1分子生成します。基底状態に戻ることにより、各NO2*分子は、反応チャンバに隣接する光電子増倍管(PMT)によって検出される1つの光子を放出する。関連する増幅器および中央処理装置を備えたPMTは、反応チャンバ内の光子数およびNO分子の数に比例した信号を生成する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CLDのサンプル入口は、液体サンプル用の反応チャンバを含むガラス製品システムに接続することができる。システムは、窒素、ヘリウム、アルゴンなどの不活性ガスで連続的にパージされ、反応チャンバからCLDにNOが移送されます。液相サンプルは、専用のメンブレンを介してパージ容器に注入されます。

PTFEスリーブ、NaOHトラップを備えたパージ容器内のガスの流れを示す化学装置図。
図2:化学発光に基づく一酸化窒素ガス検出のためのパージ容器の構造パージ容器(右)は、一酸化窒素(NO)ガスまたは液相試薬から放出されたときに容易にNOガスに変換できる他の任意の化合物の検出を可能にする。不活性ガス導入口は、アルゴン、キセオン、二原子窒素(N2)などの不活性ガスの供給源(タンク)に接続されています。ニードルバルブ(左に開きます)は、パージ容器内の圧力制御に使用され、容器を洗浄するために完全に取り外すことができます。注入口は、試料注入用の膜隔壁を備えたキャップで覆われている。膜は頻繁に交換する必要があります。加熱されたジャケットが反応チャンバを囲み、温水浴に接続され、HClアッセイにおいてVCl3を実行する。パージ容器出口は、化学発光検出器(CLD)またはNaOHトラップ(HClアッセイにおけるVCl3に必要)に接続されています。反応チャンバの内容物を排出するには、まず不活性ガス入口およびパージ容器出口の活栓を閉じ、ニードルバルブを閉じ、噴射口でキャップを取り外し、最後に排水口で活栓を開く。HClの腐食性のためにHClアッセイでVCl3が行われる場合、NaOHトラップ(左)はパージ容器とCLDの間にインラインで配置する必要があります。CLDへの接続には、CLDとパージ容器(または使用する場合はNaOHトラップ)の出力との間に、常に強磁界誘電体(IFD)フィルタを配置する必要があります。IFDフィルターは、浮遊粒子を除去し、液体がパージ容器を通過するのを防ぎます。PTFE = ポリテトラフルオロエチレン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果として、特異的かつ制御された化学反応を介してNOに変換することができる任意の化合物は、任意の生物学的流体および組織ホモジネート24において高感度に検出され得る。化学発光による気相NOの直接測定は、実験的および臨床的環境の両方で行われます。これらの技術は、他の場所33、34、35で広範囲に説明されている。NO2-、S-ニトロソチオール、S-ニトロソ化タンパク質、およびFe-NOの測定は、三ヨウ化物(I3-)との反応混合物にサンプルを添加することによって行うことができ、これは化学量論的にこれらすべての化合物からNOガスを放出する:

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H2 O

I 3− + 2RS-NO →3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO+ I2

I 3-はNO 3-15と反応しません。 各化合物の正確な測定は、塩化水銀(HgCl2)の有無にかかわらず、酸性化スルファニルアミド(AS)によるサンプルアリコートの前処理によって可能になります。具体的には、ASによる前処理は、すべてのNO2-コンテンツを除去する。結果として、CLDによって測定されたNO含有量は、S−NOおよびFe−NOs濃度の合計のみを反映する。AS注射前にサンプルアリコートにHgCl2を注入すると、S-NOによってNO2-が放出される。ASによる処理(NO2-除去につながる)は、測定されたNO含有量がFe-NOの濃度のみを反映することを確実にする。評価間の一連の減算は、3つのNO誘導体22の正確な濃度を計算することを可能にする。

試薬の混合、インキュベーション、および化合物測定ステップを含む逐次生化学分析図。
図3:I-酢酸化学発光アッセイのための試料調製における工程。I3-酢酸化学発光アッセイにおけるIを調製するための逐次的なステップが例示される。光保護された遠沈管を使用する必要があります。チューブ1、2、および3は、アッセイのために調製するために用いられるものである。硝酸塩(NO3-)の測定が必要な場合、HClアッセイにおけるVCl3のために別のサンプルアリコート(チューブ4)が必要である。手順は赤の数字で示されます。試料量を加える前に生理食塩水(PBS)またはHgCl2のリン酸緩衝液で示すようにプレフィル(ステップ1)。図示のとおりに試料量(2)を加え、渦、室温(RT)で2分間インキュベートした。(3)PBSまたは酸性化スルファニルアミド(AS)を指示どおりに添加し、渦巻き、RTで3分間インキュベートします。アッセイによって測定された濃度は、各チューブの下で報告された化合物の濃度の合計である。チューブ番号1は、亜硝酸塩(NO2-)、S-ニトロソチオール(S-NO)、および鉄-ニトロシル錯体(Fe-NO)を単一の信号として測定することを可能にする。硝酸塩(NO3-)測定の場合、サンプルは酢酸中のI3-およびHClアッセイ中のVCl3の両方を用いて実行されなければならず、チューブ1から得られた値はチューブ4から得られた値から差し引かれるべきである。 *残留NO2-、S-ニトロソヘモグロビンおよび鉄-ニトロシル-ヘモグロビンの測定のためのHb分析に使用する推奨量。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

NO3-測定の場合、塩酸(HCl)中の塩化バナジウム(III)(VCl3)は、CLDでNO3-を化学量論的に測定するために、パージ容器内のNO3-からNOへの変換に使用されます。

2 いいえ3-+ 3V + 3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+

十分に速い変換を達成するためには、反応を90〜95°Cで行う必要がある。 NO3-からNO2-への還元は、HClによるNO2-からNOへの還元と結合される。HCl中のVCl3を用いてCLDにより得られた最終濃度は、NO3−、NO2、および他のニトロソ化化合物の凝集体濃度を反映する。I3-を有するCLDで得られた濃度から後者の値を差し引くと、NO3-濃度36、37の計算が可能になる(図3)。

NO消費アッセイでは、(Z)-1-[2-(2-アミノエチル)-N-(2-アンモニオエチル)アミノ]ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート(DETA-NONOate)などのNOドナーによるパージ容器内のNOの連続放出は、注入されたサンプル中の無細胞オキシHbの定量を可能にする安定したシグナルを生成する。パージ容器内で消費されるNOの量は、試料38中のoxyHbの量と化学量論的関係にある。

血漿試料中のNO2−、NO3−、S−ニトロソチオール、鉄−ニトロシル錯体、および無細胞HbによるNO消費の測定のためのプロトコルが例示される。RBC環境におけるNOに関する研究では、非常に脆弱なS-NO-HbおよびHb-NOを測定するために、排除クロマトグラフィーに続く特定のサンプル処理と、総Hb濃度の測定(15、22)が必要です。サンプル調製は、測定の補正に役立ちます。アッセイ中のH2O中のNO2−の事前存在およびNO2−の放出は、S−NO−Hb14、39などの人為的に高濃度のNO誘導体の測定をもたらし得る。サンプル調製の重要な側面も提示する。

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プロトコル

このプロトコルに示されている手順は、マサチューセッツ総合病院の審査委員会に従っています。使用された血液サンプルは、以前の研究中に収集され、現在の目的のために非同定された18。

メモ: パージ容器を構成するチューブとガラス製品間の最適な接続、洗浄、および一般的なメンテナンスに関する具体的なガイダンスについては、製造元の指示を参照してください。接続は、ガラス製品を傷つけないようにしっかりと慎重に行う必要があります。ガス入口ライン、加熱ジャケットとコンデンサーを備えたパージ容器、水酸化ナトリウム(NaOH)ガスバブラートラップ、パージ容器とバブラー間の接続ライン、強磁場誘電体(IFD)フィルターを備えたパージ容器出口ガスライン(CLDへ)。パージ容器とCLDのサンプル入口との間のIFDフィルターラインは、液体形態のNO代謝産物(血漿、細胞培養物、組織ホモジネート)が測定されるたびに設置されなければなりません(プロトコルに提示されたすべてのアッセイ)。サンプル調製は、分析される流体または組織、および目的の化合物に依存します。前分析フェーズの重要な側面については、セクション 1 と 2 で説明します。特定のアッセイのための具体的な調製ステップは、セクション3〜5に含まれる。セクション6〜8は、すべてのアッセイに適用される。

1. 専用試薬の調製

注: 詳細については、以前の資料15,22 を参照してください。

  1. 500mgのスルファニルアミドを10mLの1N HClに溶解してNO2-除去のための5%(290mM)酸性化スルファニルアミド(AS)溶液を調製する。このソリューションは数ヶ月間安定しています。
  2. 67.9 mgのHgCl 2を5 mLのPBSに溶解して、S-NOsからのNO2-放出のための50 mM塩化水銀(HgCl2)溶液を調製する。ストックソリューションを光から保護します。
  3. チオール基をブロックするために100mM N-エチルマレイミド(NEM)と共にHbを酸化するために800mMフェリシアン化物[K3Fe(CN)6]および(オプション)10%ノニルフェニルポリエチレングリコール溶液(ノニデットp-40)でNO2-ブロッキング溶液を調製して赤血球膜を可溶化する。
    1. K3Fe(CN)6を脱イオンおよび蒸留水(ddH2O、1リットルあたり263.5gの粉末)に加え、最終濃度800mMを得た。
    2. ddH2O溶液(1リットルあたり12.5gの粉末で100mMの濃度を有する)中の800mMK3Fe(CN)6にNEMを加え、溶液を混合してすべての結晶を溶解する。
    3. 800 mM NEM K3Fe(CN)6 100 mM NEM 溶液 (1 リットルあたり 111 mL) の 9 部に 10% NP-40 の 1 部を加え、よく混ぜます (全血分析の必須ステップ)。
  4. 12 mM K3Fe(CN)6、10 mM NEM、100 μM ジエチレントリアミン五酢酸 (DTPA、金属キレート用)、および 1% ノニデット p-40 洗剤を含む S-NO-Hb 安定化溶液を原液から調製します。
    1. PBSにNEM結晶を加えて200mM NEM溶液を調製し(25mg/mL、例えば、10mLPBS中250mg)、すべての結晶が溶解するまで溶液を混合する(実験日に作製される予定)。
    2. ddH2OにK3Fe(CN)6を加えて800 mMK3Fe(CN)6溶液を調製する(5 mLのddH2Oに263.5 mg/mL 例えば1.32 g、終濃度800 mMを得る)(実験当日に作成予定)。
    3. 200mLのddH2Oに786mgのDTPAを加えて10mM DTPAストック溶液を調製し、5N NaOHでpHを7.0に調整してDTPAを完全に可溶化する。
    4. 5 mLの200 mM NEM溶液、1.5 mLの800 mMK3Fe(CN)6 溶液および1 mLのDTPAストック溶液を7.2 pHで81.5 mLのPBSに加え、最後に11 mLの10%NP-40を加えて最終容量を100 mLにする。

2. サンプル収集

注:サンプルコレクションの詳細については、以前に出版された作品15、22、40を参照してください。

  1. 全血を採取する
    1. 溶血を最小限に抑えるために、動脈血管よりも静脈を好むヘパリンコーティングチューブ(特に必要でない限り)で血液を収集し、静脈穿刺よりもカテーテルの配置を好む(可能であれば)。
    2. 直ちにNO2- ブロッキング溶液(全血の4部に溶液の1部)を加え、処理(切片3または4)、または-80°Cで凍結して保存する。
  2. 血漿および赤血球(赤血球)を収集する
    1. 溶血を最小限に抑えるために、動脈血よりも静脈を好むヘパリンコーティングチューブ(特に必要でない限り)と少なくとも20G以上の針で血液を収集し、4°Cで4000 x g で5分間直ちに遠心分離します。
    2. 上清(血漿)とNO2- ブロッキング溶液(溶液の1部対上清の4部)を新しいチューブで混合し、処理(セクション3または4)するか、-80°Cで凍結保存する。
      注:NO消費アッセイでは、NO2- ブロッキング溶液は使用できません。アッセイは、血漿前処理なしで行うことができる。
    3. RBCペレットを底部からS-NO安定化溶液(ステップ1.4参照)で予め充填した新しいチューブ(1mLのペレットを9mLの溶液に)に再懸濁し、5分間インキュベートする。
    4. 排除クロマトグラフィーのためにddH2Oで以前にリンスされたG-25セファデックスポリマーを含むサイジングカラムにRBC溶解液を通過させる
    5. 処理するHb画分を収集し(セクション4)、ドラブキン試薬を用いてHb濃度を測定した(Hb測定については、以前に発表された研究22を参照のこと)。
      注:特定の組織/臓器を調製およびサンプリングするには、そのヒルムを同定し、外科的に単離する。静脈を切開し、動脈を穿刺し、動脈を介してヘパリン化生理食塩水(10U / mL)を注射する。静脈切開部で生理食塩水が逆流し始めたら組織を切除する。ホモジナイズした組織の4部にNO2-ブロッキング溶液1部を添加しながら、メカニクスホモジナイザーで組織を均質化する。

HClアッセイ調製におけるVCl3

注:HClアッセイ調製におけるVCl3の詳細については、以前に公開された研究37,41を参照されたい。

警告: このアッセイの実行時に NaOH トラップが正しく設置されていない場合、CLD は損傷します。これはHClの腐食性によるものです。

  1. 標準曲線のためのNO3- の標準解を準備する
    1. 85mgのNaNO3を10mLのddH2Oに溶解して0.1MNaNO3-を得る(この溶液は数週間安定なままである)。
    2. 血漿または尿サンプルの検量線を実行するために、原液を使用してddH2Oに希釈して5 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、200 μM NaNO3の濃度を得る(細胞培養で作業する場合はより低い濃度を使用する)。
  2. パージ容器内のNO3-還元のためのVCl3(塩化バナジウム)飽和溶液を調製する
    警告: 水と VCl3 の反応は発熱性です。酸を加えるとき、および実験の最後にガラス製品をすすぐとき、高いガラス製品温度に注意してください。
    1. 1.6 g の VCl 3 を 200 mL の 1 M HCl に溶解するには、まず VCl3 をクリーンなフラスコに加え、次に 200 mL の 1 M HCl を加えます。
    2. 溶液を濾紙(11μmの濾紙など)で真空濾過するが、任意の濾紙を使用することができる。
      注:ろ過された溶液は透明な青色に変わり、ろ過されていないVCl3 溶液は未溶解粒子のために茶色になります。
    3. 飽和溶液をアルミニウム箔またはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープで覆い、化合物が光に敏感であるように保管してください。
  3. 循環水浴を用意する
    1. 循環水浴装置をパージ容器のウォータージャケットに接続する。プライミングする前にラインが乾いていることを確認してください。
    2. ウォーターバスを95°Cで開始し、ラインの周りに(非付着性の)ペーパータオルを塗布して、ウォーターラインに漏れがないことを確認します。
  4. ガスバブラートラップを設定する
    1. バブラーのPTFEスリーブが所定の位置に収まっており、破損していないことを確認します。
    2. ガスバブラーを開き、15mLの1M NaOHをバブラーベースに注入する。
    3. ガバブルの位置を変え、下部を上部に押し、2つの部分をわずかにねじって接続をしっかりと密閉します。力を加えずにバブラーの上部を回転させることができないことは、正しいシールを示しています。
    4. パージ容器の出口をガスバブラートラップの入口に接続します。

I3- 酢酸アッセイ調製物中

注:酢酸アッセイ調製におけるI3−の詳細については、以前に公開された著作物15、22、38、41、42を参照されたい。

  1. NO2の標準曲線を準備する-
    1. 亜硝酸ナトリウム(NaNO2)69mgを10mLのddH2Oに溶解して原液を調製し、100mM溶液を得た。この溶液は、気密容器に保管し、冷蔵し、光から保護すれば安定である。
    2. 900 μLのddH2Oで予め充填された1.5 mL微量遠心チューブにストック溶液を段階的に希釈する:100 μLのストック溶液を第1の遠沈管に加え、混合し、標識し、第2のチューブに100 μLのチューブを使用し、次いで10 mM、1 mM、次いで100 μMになる。
    3. さらにddH2Oで希釈して、検量線に使用する50 μM、25 μM、10 μM、1 μMおよび500 nMNaNO2 アリコートを得た。
  2. パージ容器用の酢酸中でI-3-を調製する(室温(RT)で1週間保存可能)22
    1. 2 g のヨウ化カリウム (KI) および 1.3 g のヨウ素 (I2) を 40 mL の ddH2O および 140 mL の酢酸に加えます。
    2. 混合物を少なくとも30分間撹拌することによって十分に混合する。
  3. NO2-、S-ニトロソチオール(S-NO-Hb、Hbを採取した場合)および鉄-ニトロシル錯体(Hbを採取した場合はHb-NO)の鑑別定量のためにサンプルを準備する(図3)
    1. 各サンプルを270 μLの3つのアリコート(S-NO-HbおよびHb-NOを測定する場合はHbの900 μL)に光保護微量遠心チューブで分割し、そのうちの2つに30 μLの1x PBS(S-NO-HbおよびHb-NOを測定する場合は100 μL)を予め充填し、3番目のチューブに30 μLのHgCl2 (S-NO-HbおよびHb-NOを測定する場合は100 μL)を充填し、 渦を巻き、RTで2分間インキュベートします(図3)。
    2. Fe-NOを測定するためにHgCl2を含むサンプルに5%ASの30 μL(Hb-NOの場合は100 μL)を加え、S-NOおよびFe-NOを測定するためにPBSを添加したもの(S-NO-HbおよびHb-NOの場合は100 μL)に30 μLのPBSを添加し、すでに1x PBSで予め充填されている3番目のサンプルに30 μLのPBSを追加して、Hb収集からの残留NO 2-、S-NOおよびFe-NOを測定し、 S-NO および Hb-NO)。ボルテックスし、RTで3分間インキュベートします(図3)。

5. 無細胞Hbセットアップによる消費なし

注:詳細については、以前に出版された著作物38を参照されたい。

  1. 既知の濃度の精製ストックHb溶液から標準的なoxyHb溶液を調製する
    1. ddH 2 Oを添加してストック溶液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに連続希釈し、検量線に使用する溶液(62 μM、50 μM、25 μM、12.5μM、6.25 μM、3.125 μM、1.56 μM)を得た。
  2. DETA-NONOate ソリューションの準備
    1. pH 7.4 PBS の 610 μL の 10 μM NaOH に 10 mg の DETA-NONOate を加え、100 mM の DETA-NONOate を生成して氷上に保管します。

6. 化学発光検出器(CLD)を起動し、パージ容器を準備する

注:パージ容器の準備については、以前に出版された著作物43を参照されたい。

  1. CLD との間のメイン接続を確認します。
    1. 酸素ラインをCLDに接続し、CLDの製造元と一致する圧力で酸素タンクを開きます。
    2. 強烈誘電体(IFD)フィルタラインがCLDに接続され、パージ容器またはNaOHトラップには接続されていないことを確認してください。
  2. CLD を起動します。
    1. CLD インターフェースで、液相アッセイ用の検出プログラムの実行を開始します。
    2. 酸素供給が適切であることを確認します。この場合、CLDは入口からサンプリングを正常に開始し、ミリボルト(0~5mV)の信号による検出を示します。それ以外の場合、CLD は否定的な診断シグナルをプロンプトします。
  3. パージ容器の準備
    1. 3つのポートすべてでパージ容器を閉じます:ニードルバルブを右に完全にねじ込み、入口活栓と出口活栓を閉じます。
    2. パージ容器からキャップを取り外し、サンプルの注入に使用したシリンジ針が流体カラムに到達できるように、計画されたアッセイに固有の十分な量の試薬を反応チャンバ(表1)に追加します。
    3. 安定な所望のベースラインの存在を検証した(表1)。
  4. パージガスの流れを開始する
    1. 不活性ガスタンク(例えば、N2)に2段レギュレータが装備されていることを確認し、不活性ガスタンクを容器のガス入口に接続します。
    2. 1〜5psiのレギュレータで出口圧力でガスを開き、パージ容器の入口を開き、パージ容器のニードルバルブをゆっくりと開いてガスの流入を可能にする。パージ容器内のバブリングを確認します。
  5. ガス流量を調整する
    1. 周囲空気をサンプリングするIFDフィルタラインでCLDによって測定されたセル圧力を記録します。
    2. パージ容器のキャップを再配置し、IFDフィルターラインをパージ容器に接続し(またはHClアッセイではVCl3のNaOHトラップに)、パージ容器の出口を開きます。
    3. ニードルバルブを使用して、周囲空気に記録されているのと同じ細胞圧をCLDレベルで到達させます。

7. 実験

注:実験の詳細については、以前に出版された著作物43を参照されたい。

  1. 化学発光信号取得プログラムを開始する
    1. CLDのシリアルポートを、集録プログラムがインストールされているコンピュータのシリアルポートに接続します。
    2. 解析プログラムを実行します。
    3. [ 取得]をクリックし、.dataファイルを保存するフォルダを選択し、ファイル名を入力して [保存]をクリックします。
      メモ: プリセット時間が経過すると録画が自動的に停止するため、画面上のプリセット実行時間に注意してください。必要に応じて、プリセットの実行時間を長くすることができます。
  2. 繰り返しサンプル注入の準備をする
    1. 画面上の電圧スケールを調整して、 最小 値および/または 最大 ボタンをクリックし、目的の値を入力して、ターゲットベースラインを制御できるようにします。
    2. ddH2 O で満たされた20mL または 50 mL のチューブを持って、サンプル間のシリンジをすすぎます。
    3. 繊細なタスクワイプの箱をすぐに入手してください。
  3. サンプル注入
    注:検量線の標準溶液から始めて(最も濃縮されていないサンプルから最も濃縮されたサンプルに注入し)、実験サンプルに進みます(重複または3連で行うことを検討してください)。
    1. 各サンプルを抜き取る前(および各注入後)にシリンジをddH2 Oで少なくとも2回以上すすぎ、タスクワイプで妨げられない水の噴出を確認するたびに確認します。
    2. シリンジとチューブの両方を近距離に保持しながらシリンジをサンプルチューブに挿入し、気泡および/または均質化されていない固体部分がトラップされていないことを確認しながら、プランジャーを所望の体積に引き上げる。
    3. シリンジの先端をタスクワイパーで拭き取り、注射口のセプタキャップにシリンジを挿入し、シリンジの先端が反応チャンバ内の液相内にあることを確認した上で注入します。
  4. ソフトウェアプログラムでインジェクションをマークして待ちます
    1. 注射によってシグナルが上向きの変化(補足図1)(無細胞HbアッセイによるNO消費では下向き)を引き起こすことを確認し、サンプル名の下の灰色のボックスをクリックして サンプル名を入力し、「 注射のマーク」をクリックします。
      メモ:サンプル注入で信号が生成されない場合は、シリンジの障害物が疑われます。
    2. 電気信号が再びベースラインに到達するのを待ちます(これには通常3〜4分かかります)。この時間を使用して、ステップ 7.3.1 を実行できます。
  5. 実験が終了するまで、すべての注射中および注射後に手順7.3および7.4に示したすべての手順を繰り返します。保存ソリューションのサンプルを必ず実行する (使用されている場合)
  6. 実験を停止する
    1. STOPをクリックして信号集録を中断し、CLDを停止し、ウォーターバスをオフにします(NO3-が測定された場合)。
    2. ガスの流れを中断し、ニードルバルブを開き、パージ容器からキャップを取り外し、排水管の下に廃棄物容器を置き、排水活栓を開きます。
      注:実験で60分以上のデータ取得が必要な場合は、60分の実行時間後に集録を再開し(手順7.1.3を繰り返し)、新しいファイルを作成する必要があります。

8. 測定と計算

メモ: 測定と計算はオフラインで行われ、別の時間に実行できます。

  1. オフラインデータ解析のための化学発光取得プログラムを開始する
    1. プログラムを起動し、[ プロセス]をクリックします。
    2. 実験ファイルを選択し、[ 開く] をクリックします。
  2. 各投与の曲線下面積を計算する
    1. ソフトウェアは、各サンプル投与によって生成された各波のベースライン(補足図2A、水平黄色線)とピーク軸(垂直黄色線)を画面上に自動的にグラフ化します:正しい位置を確認する(または各線をクリックしてマウスまたは矢印で動かして調整する)、「しきい値OK」(補足図2B)をクリックします。
      注:無細胞Hb測定アッセイによるNO消費では、ソフトウェアは通常、サンプル注入によって生成された波形を正しくキャプチャすることはできません。各波形をズームすることで、オペレータは面積計算においてソフトウェアを容易に支援することができます(補足図2)。
    2. ソフトウェアは、各サンプル投与によって生じる各ピークの開始(緑色の垂直線)と終了(垂直赤色の線)を自動的にグラフ化します:正しい位置を確認し(または各線をクリックしてマウスまたは矢印で動かして調整)、 積分 をクリックします(補足図2C)。
      メモ: トレース内の一部の領域は、この時点で誤って注入として定義されている可能性があり、一部のピークは自動的に 2 回カウントされることがあります。どちらの間違いも、ステップ 8.2.2 で再識別して削除することができます。
    3. ソフトウェアは、実験中にマークされた注入に続くすべての信号領域とその割り当てられた名前を自動的に照合します:次のピークと前のピークをクリックして、各ピーク(黄色の垂直線で示される)を割り当てられた名前とナビゲートし、次に[すべてOK]ボタンをクリックして、最終的に画面上のすべての領域の計算を取得します。
    4. ユーザーまたはプログラムによって行われたすべての命名または一致の間違いを修正するには、必要に応じて 補足ファイル 1 に示されているボタンを使用します。
  3. 検量線値をスプレッドシートに転送し、線形回帰式を生成する(補足図3)
    1. CLD プログラムから新しいスプレッドシートにデータを転送するには、コピー&ペーストを行います。データシートの 2 つの列を [サンプル濃度 ] と [曲線の下の面積] として配置し、両方の列に一致した値 0 を追加します。
    2. 2 つの列を選択し、[ >散布図の挿入] をクリックし、[ グラフのデザイン ] メニューで [ グラフ要素の追加] > [近似曲線] > [線形] を選択します。
    3. 生成された近似曲線を右クリックし、[近似曲線の書式設定] をクリックしてから、[近似曲線の書式設定] メニューの [グラフに方程式を表示] オプションと [グラフに R 2 乗値を表示] オプションをクリックして、単純な線形キャリブレーション式を取得します。
  4. 各サンプルの計算された領域を転送して、その濃度を計算する(補足図3)
    1. スプレッドシート上のすべての値を報告します。次の列で、ステップ 8.3.3 から得られた式を適用して、注入された各サンプルの濃度を求めます (ここで、y は濃度 (新しい列の値)、x は注入後に測定された曲線下面積です。
      注:保存液で測定された濃度(使用する場合)を考慮に入れ、それに応じて値を減算することを忘れないでください。

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結果

無細胞HbアッセイによるNO消費を、既知の濃度の無細胞オキシHbを含むサンプルで使用した(図4)。オキシHbの1つのヘムがアッセイにおいて化学量論的に1つのNO分子を放出するように、精製された無細胞オキシHbがアッセイ用の検量線を構築するために使用される(補足図3)。

心臓手術中に心肺バイパス(CPB)から外れた患者における無細胞Hb(比色アッセイで測定)とNO消費との間の用量反応関係を図5に示す。CPB後には、無細胞Hbの少数のヘム群のみがNOを消費するCPB中にNOを投与された患者と比較して、Hb-Fe2+-O2状態(図5、赤色)においてより高濃度のヘム基が存在すると仮定することができる(図5、緑)。

無細胞H...

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ディスカッション

高感度のため、NOおよび関連化合物の測定のための化学発光ベースのアッセイは、NO2-汚染のリスクが高い。実験に使用した各試薬(特にNO2-ブロッキング溶液)および希釈剤(ddH2Oを含む)は、バックグラウンドシグナルを補正するためにそのNO2-含有量について試験されるべきである。亜硝酸塩は、全血中の半減期が約10分と非常に反応性があり、急速にNO3-を生成する。したがって、採血から遠心分離、またはNO2-ブロッキングの間に経過する時間は、事前分析エラーを引き起こす可能性があり、最小限に抑える必要があります15。血漿サンプルを用いたアッセイでは、好ましくはヘパリンチューブで血液を採取し、250mgのNEMを10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して生成した40μLの200nM NEMでチオール基封鎖後、750 x gで4°Cで5...

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開示事項

L.B.は、溶血と一酸化窒素に関する研究の主任研究者としてK23 HL128882/NHLBI NIHから給与支援を受けています。LBは、ジョージメイソン大学のメルカタスセンターにある「COVID-19研究のためのファストグラント」とiNOセラピューティクスLLCから助成金を受けています。B.Y.は、NHLBI/#R21HL130956およびDOD/The Geneva Foundation(W81XWH-19-S-CCC1、Log DM190244)からの助成金によって支えられています。B.Y.はMGHで一酸化窒素の発電に関する特許を取得しました。

L.B.およびB.Y.は、COVID-19疾患PCT出願番号:PCT/US2021/036269 2021年6月7日に出願された送達なしの特許出願を提出しました。RWCは、資源の少ない環境にある小児における結核の分散型診断を目的とした技術開発の主任研究者として、ユニットエイドから給与支援を受けています。

謝辞

この原稿で報告されたプロトコルは、マサチューセッツ総合病院の麻酔科のクリティカルケアにおける麻酔研究のウォーレン・ザポール博士の研究室の以前のフェローの蓄積された貢献によって可能になりました。我々は、中川明人博士、フランチェスコ・ザデック博士、エマヌエーレ・ヴァッセナ博士、チョン・レイ博士、長坂靖子博士、エステル・スパニョッリ博士及びエマヌエーレ・レゾアグリ博士の貢献を認識する。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸Σ45754500 mL - 液体
消泡剤 B エマルジョンΣA5757250 mL - 液体
DETA NONOateケイマン8212010 mg
Gibco DPBS (1x) カルシウムなし、マグネシウムなしThermoFisher14190144500 mL
ヒドロクロル酸 37% (1 M)Σ258148500 mL - 液体
ヨウ素SAFC207772100 g - 固体
キムワイプKimtech34155
水銀 (II) 塩化物 ACS 試薬> 99.5%シグマ215465100 g - 固体 (水に溶解)
Mili-Q 水質浄化システムミリポア
モデル 705 RN 50 μLシリンジハミルトン80530マイクロリットルシリンジ
モデル802 N 25 μL シリンジハミルトン84854マイクロリットル シリンジ
N-エチルマレイミドSigma426025 g - 結晶性
一酸化窒素分析装置 + バンドル ソフトウェア - パージ容器ZysenseNOA 280i化学発光検出器
Nonidet p-40 (NP-40)サーモフィッシャー8512510% - 500 mL
ヘキサシアノフェレート カリウム (III) ACS 試薬 ≥ 99%シグマ244023100 g - 粉末
ヨウ化カリウム ACS 試薬> 99%シグマ221945100 g - 固体
亜硝酸カリウム cryst.分析用 EMSURE ACSSupelco105067250 g - 結晶性
PowerGen 125フィッシャー・サイエンティフィック14-359-251メカニック・ホモジナイザー
RV3 2段ロータリーベーンポンプエドワーズA65201906真空ポンプ - 分析装置付き
ヘパリンナトリウム - BD ヘモガード クロBDバイオサイエンスBD36787175 USP ユニット
酸化ナトリウム 無水 ACS 試薬≥97%シグマ7954291 kg - ペレット
硝酸ナトリウム ACS 試薬 ≥ 99%シグマ221341500 g - 粉末
亜硝酸ナトリウム ≥ 99%シグマS2252500 g - 結晶性
スルファニルアミド ≥ 98%シグマS9251100 g - 固体
塩化バナジウム (III) 塩化バナジウムグマ11239325 g - 固体 - 注意 (発熱)
Whatman 1 濾紙シグマWHA10010155
水 シ

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