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方法論記事

マウスの灸戦略

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DOI：

10.3791/63119

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2022年1月7日

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1Department of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2Chinese Academy of Sciences Sichuan Translational Medicine Research Hospital, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy Service, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Acupuncture, Southwest Medical University Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 6Department of Acupuncture, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、マウスの恐怖心を軽減し、その福祉を保証し、研究者の効率を向上させるという利点を持つ、マウスの灸適用方法を説明しています。

要約

灸研究の分野は拡大しており、近年では論文が急増しています。灸は、人間の皮膚上の灸に発火する治療法で、末梢皮膚温度の上昇や局所的な発赤を伴います。この治療中、レシピエントは火傷を防ぐためにじっとしている必要があり、簡単に操作できるように介入部位を露出させます。しかし、灸の際に一定の姿勢を保つことは、動物にとって大きな課題です。したがって、マウスなどの小動物で灸を操作することは、研究者にとっていくつかの困難につながる可能性があります。さらに、動物にとって不快な姿勢は、灸に対する恐怖や抵抗、怪我のリスクの増加、動物福祉の低下、有効な研究データの低下につながる可能性があります。動物福祉を守り、実験結果への悪影響を最小限に抑えるためには、効率的で快適な灸灸法が必要です。ただし、灸の方法は非常に多様であり、多くの場合、有効性は限られています。さらに重要なことは、不快な灸の姿勢は、不安、恐怖、怒りで観察されるようなストレス反応を引き起こす可能性があり、それが研究データに影響を与える可能性があります。したがって、介入中に可能な限り害を及ぼさない動物灸の戦略が必要です。このプロトコルでは、灸介入のためのマウステザリング法を導入し、マウスの不快感を最小限に抑え、研究効率を向上させます。マウスのテザリングと灸の適用に関する基本的な戦略が強調され、テザリング機器の構造が説明されています。

概要

灸は、伝統的な中国医学で使用される外用療法です1。それは、健康を維持し、病気を予防および治癒する手段として、何世紀にもわたって広く適用されてきました2,3。しかし、灸のメカニズムはまだ解明されていません。このように、近年、研究者がその効果や生物学的メカニズムを探求するにつれて、この研究分野は拡大しています。

灸中、レシピエントは最良の結果を達成するためにじっとしている必要があります4。灸治療は通常15〜30分間続きます5,6。このため、動物、特にマウスやラットなどの小動物(動物実験での使用に適した)の灸の操作は、研究者にとって大きな課題となっています。ほとんどの灸装置は臨床使用に適しており、動物、特にマウス7,8,9などの小動物には使用できません。また、動物は人間と違って命令に従うのがやっとで、しばらくの間は安定しています。動物にとって固定された不快な姿勢は、不安、恐怖、怒り、緊張、治療への抵抗などの受動的な感情につながり、怪我のリスクを高め、動物福祉を低下させ、結果として有効な研究データが少なくなる可能性があります10。この問題を解決するために、これまでの研究では、鍼治療、灸、マッサージ研究など、外部の伝統的な漢方療法を含む動物実験中に麻酔薬が長期間適用されてきた11,12,13。しかし、麻酔によって体調が変化し、ほとんどの臨床例では意識のある人に灸が投与されることを考えると、麻酔は研究データの信頼性に影響を与える可能性があります。そのため、動物を意識的に快適につなぎとめる方法が課題となっています。これらの技術的課題を解決するために、マウス灸専用の装置が導入されました。このプロトコルは、研究者が動物に対して灸治療を行うのを支援するテザリング方法を提供し、動物が安定し、意識を持ち、快適に保つことを可能にします。

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プロトコル

すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って実施され、成都TCM大学の施設用動物管理および使用委員会によって承認されました。実験室での動物の世話と維持は、参考文献14,15に従って行われました。試験には、体重20〜25 gの成体雄C57BL/6Jマウスを使用しました。すべてのマウスは、24°C、湿度40%〜50%で12時間の明暗サイクルで維持され、餌と水に自由にアクセスできました。次のプロトコルは、一般的な実験室の住宅条件下での灸の手順を示しています。

1. 機器の準備

  1. マウステザリング
    1. 縦型プレート、縦型プレートベース、木製のブラケットで構成されるマウステザリングデバイスを準備します。
      1. 固定体を直線状の木製添え木(長さ30cm×幅3cm×高さ3cm)で組み立て、固定ベルクロベルト(フック側(4cm×3cm)とループ側(10cm×3cm)の2辺で構成)を取り付けて、柔軟性を保ちながらマウス本体をつなぎ合わせることができます( 素材表参照)。
      2. 木製スプリントの右側にフック側をグルーガンで取り付け、左側にループ側の1/4の長さを取り付けます。
    2. マウスを固定ベッドに置き、固定ベルクロベルトを使用してマウスの胴体を固定します。
      注意: テザリングベルトが心臓に圧力をかけるほどきつく締まっていないことを確認してください。これにより、マウスが死亡する可能性があります。マウスをゆるく、しかししっかりとテザリングします。
    3. テープを使用して、下肢/上肢を木製スプリントの両側に取り付け、テールを木製スプリントの表面に取り付けます。
  2. マウスベッドラックの準備
    メモ: ラックは、縦型木製プレート、木製ベースプレート、および木製ブラケットで構成されています。ブラケットはL字型のステンレス鋼で構成されており、各マウスベッドをサポートします。
    1. 縦長プレートをベースプレートに取り付け、ベースプレートに四角い溝をあけて、バッフルとして使う木の棒を差し込む(図1)。
    2. マウスに頭の上に灸を投与する場合は、透明なプラスチック製のヘッドカバーを準備します。
      1. 1000mLシリンジを使用し、針とコアロッドを取り外します。切削工具またはナイフを使用して、シリンジジャケットを半分にカットします。
      2. シリンジジャケットのどちらかの側を選択し、頭と尾を切り取り、中央部分(長さ:4 cm)をマウスのヘッドカバーとして脇に置きます。
      3. シリンジジャケットの中央にドリルマシンで穴(1cm)を開け、その穴に灸スティックを置きます。マウスの頭にヘッドカバーをかぶせて、頭の動きを制限し、発火した灸から保護します。
    3. マウスに前肢に灸を投与する場合は、マウスベッドの頭端に平行な木片2枚(長さ7cm×幅1cm)と横掛け(長さ7.5cm×幅1cm)を取り付けます(図2)。
      注意: 各平行な木製のストリップとマウスベッドの間のスペースは1cmである必要があります。ブラケットの数と垂直プレートの高さは、実験要件に基づいて決定できます。これらの手順は、マウスを怖がらせないように穏やかに実行する必要があります。実験の1週間前にマウスに適応訓練を必ず行ってください。
  3. 灸スティックホルダーの準備
    1. 磁性金属製の長方形(長さ30cm)、金具台座(縦5cm×幅5cm×高さ2cm)、木立体(縦3cm×幅1.5cm×高さ1cm)からなる灸棒ホルダーを用意し、それぞれ中央に灸棒を入れるための穴(直径0.55cm)を設けます( 資料表参照)。
    2. 各立方体の片側に平らで細い磁石(縦3cm×幅1.5cm、厚さ0.2cm)を取り付けます。灸スティックの立方体とホルダーの間の磁気引力により、灸スティックの高さを調整できます。
      注意: キューブ磁石の磁極がホルダー磁石の極と反対側にあることを確認してください。
  4. 灸手順の開始と終了を記録するには、マウステザリングデバイスの近くにタイミングデバイス( 資料の表を参照)を置き、簡単に読み取ることができるようにします。
  5. マウスを保持してつながれるときは、素手または手袋をはめた手を使用してください。薄く手袋をはめた手は、灸治療にも効果的です。

2.灸の手順

  1. 実験用手袋を着用します。灸治療の前に、灸部位でマウスシェーバー で 毛皮を剃り、ツボを露出させます。
  2. 灸スティックホルダー(磁性金属製の長方形、ブラケットベース、中央に灸スティック挿入用の穴が開いた木製の立方体で構成され、1つのスティックホルダーには灸スティック1本しか収納できない、ステップ1.3)に灸スティック(直径0.5cm、長さ10cm)を挿入します。
  3. 灸の温度を確認するには、ツボにデジタル温度検出器を取り付けて温度変化を監視します。
  4. タイマーを開始し、灸スティックに点火します。ツボの皮膚と灸スティックの照明端との間の距離を、実験に必要な温度変化に応じて固定または制御します。

3. マウスの同時灸

注:マウスはグループとして灸で治療できます。マウスベッドラックは、マウスのグループを同時に治療できるようにマウスベッドを配置するために使用されます。

  1. 各マウスベッドをラックに置き、木製の棒をベースプレートに挿入して、マウスが落下しないようにします(図3)。
  2. 灸スティック(直径0.5cm、長さ12cm)を、各マウスベッドと一致するレベルで灸スティックホルダーに挿入します。マウスラックとスティックホルダーの距離を調整してから、moxaスティックに点火します。
    注:これにより、マウスをリラックスした快適な状態で灸で治療することができます。灸中は、マウスラックとスティックホルダーの間の距離がすべてのマウスで一貫していることを確認してください。
  3. モデリングする前に、熱離脱閾値(TWL)テストに対するマウスの反応を実施して、灸が鎮痛に有効かどうかを判断します。

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結果

表1 は、灸に対する反応に影響を与えるさまざまな要因をまとめたものです。マウス灸の肯定的な結果は、マウスの福祉と肯定的な効果の複数の尺度によって示されています。

次に、灸技術を完全なフロイントアジュバント(CFA)誘発注射手順と組み合わせたときに得られる結果の具体例を概説します。熱離脱閾値 (TWL) テストを使用して、灸薬の有効性を評価しました 痛みの緩和16.

24°C、湿度40%〜50%の12時間の明暗サイクルで1週間適応的に給餌した後、マウスを拘束してCFA注射(20μL、CFA誘導モデル群を含む、および灸群、CFA + MOXIを含む)または生理食塩水注射を投与しました。CFA誘発性炎症性疼痛モデルが確立されました17。TWLテストは、モデリングを評価するために、各グループの設立前と3日後に適用されました。CFA誘発性炎症性疼痛モデルの後、および灸後にST36を適用しました(

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ディスカッション

灸法は、疲労、不眠症、下痢、疼痛症候群など、多くの疾患に効果的です20,21,22,23,24,25,26。多くの疾患に対する灸治療の利点により、この技術のメカニズムは研究者の注目を集めています。灸の分子メカニズムを研究するためには、動物への灸の適用が必要です。灸のメカニズムを解析するために、研究者にとって最大の課題の1つは、動物を適切な位置につなぎとめ、動物を不快感なく安定させ、一定期間にわたって治療を可能にする方法を決定することです。この問題を克服するために、動物に麻酔をかけるための多くの研究が行われてきた...

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開示事項

著者は、開示することは何もないと宣言します。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(81704187年、8210152562年)、四川科学技術プログラム(2019YJ0587、2018JY0482、2019YJ0329)、四川医科学院および四川人民病院研究基金(2018ZX05)、成都伝統中国医学大学の興林奨学生研究基金(QNXZ2019034)からの助成金によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コンプリートフロイントのアジュバント(CFA)Sigma-AldrichSF588102
Glue gunDeli Group Co., Ltd.DL5041
実験手袋Boci  Co., Ltd53625130323
磁性金属長方形(厚さ0.2cm)Sitoo Stationery Co., Ltd1007908729
Moxa stickHanyi Airong factory5613
Steel sheetRizhan金属材料有限公司1108
シリンジ(1000mL)Xinmin Fuda Co., Ltd
タイマーBevoza株式会社KT003
ベルクロベルトミネソタ鉱業製造株式会社3MSJ3550
木製キューブChuang Hing木材チップ株式会社2581457A
木製スプリントChuang Hing木材チップ株式会社3410968M
木スティックChuang Hing木材チップ株式会社2785476M
木製ストリップChuang HingウッドチップCo.、Ltd2374652S
796341

参考文献

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