マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

樹状細胞(DC)は、ナイーブT細胞を活性化し、感染症、アレルギー疾患、および腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導するための最も強力な抗原提示細胞(APC)である^1,2,3。DCは自然免疫と獲得免疫との間の主要なリンクであり、免疫学的防御および免疫寛容の維持に不可欠な役割を果たす。過去40年間、多くの研究者がDCのサブセットと炎症と免疫におけるその機能を定義しようとしてきました。これらの研究によると、DCは骨髄細胞からの骨髄系およびリンパ系に沿って発達する。腫瘍ワクチンは近年、重要なマイルストーンを獲得し、有望な未来を持っています。機械的には、腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Tリンパ球を活性化することによって免疫応答を調節し、腫瘍増殖を防止する。DCに基づくワクチンは、腫瘍免疫療法において重要な役割を果たしており、最も有望な抗腫瘍療法の1つとして同定されている^1,4。さらに、DCは、新しい分子標的薬および免疫チェックポイント阻害剤の試験に広く使用されている⁵。

研究者は、DCの役割をさらに研究するために、多数の高純度DCを緊急に必要としています。しかし、DCは様々な組織や血液ではまれであり、ヒトや動物の血球のわずか1%しか占めていません。骨髄樹状細胞(BMDC)の 体外 培養は、大量のDC細胞を得るための重要な方法である。一方、骨髄からDCを生成するためのLutzプロトコルは、研究者によって広く使用されています⁶。このプロトコルはDC細胞を得るのに有効であるが、複雑で高価であり、高濃度のサイトカインの添加および赤血球の溶解を伴う。

本研究では、マウス骨髄(BM)からほぼすべての骨髄細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4の濃度を低くして、 インビトロでの7~9日後のBMDCへの分化誘導方法を報告する。この手順は、ほとんどすべての骨髄細胞を採取し、それらを完全な培地に懸濁するのに10分しかかかりません。簡単に言えば、我々はこの研究においてBMDCのための効率的かつ費用対効果の高い培養方法を提供する。

すべての手順は、南京医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

骨髄の単離とBM細胞の調製

1. C57BL/6マウス(18~22g、6~8週齢)を_CO2 窒息で屠殺する。マウスを操作台に固定します。表面を70%エタノールで消毒する。
2. 脚の皮膚を切って筋肉と大腿動脈を露出させます。2つの鉗子を使用して大腿動脈を締め付けて引き裂き、近位端を腹部に向かって引き抜く。
   注:大腿動脈を直接切断しないでください。さもなければ、それは過度の出血を引き起こし、視野を汚染するでしょう。
3. 大腿骨の周りのすべての筋肉を切断します。
4. 股関節脱臼の音が聞こえ、大腿骨頭の脱が見えるまで、マウスの下肢をゆっくりと外側に伸ばします。
5. 大腿骨頭の内側に沿ってはさみを使って下肢を体から分離します。
6. 膝関節の端から後肢を切断して、自由で完全な大腿骨を得る。
7. ガーゼを使って大腿骨に付着した筋肉を取り除きます。
   注:筋肉を直接引き裂かないでください。マウスの大腿骨は繊細であり、その完全性を維持しなければならない。
8. 大腿骨を75%アルコールに2〜5分間浸します。

2. BMDCの誘導培養

1. 残留アルコールをPBSですすいでください。止血鉗子を使用して大腿骨の中央部と底部をクランプし、もう1つのセットを使用して大腿骨の下端をクランプします。止血鉗子は大腿骨に横方向に適用され、大腿骨は骨端シールラインから分離される。
   注:骨端線は、大腿骨が骨折するまで容易には見えません。このステップと次のステップはすべて、滅菌環境で実行されます。
2. 1mLシリンジ(針:0.6 mm x 25 mm)を使用して骨端ラインブレイクから骨髄腔を貫通し、針を回転させて大腿骨頭および骨髄腔を貫通する。骨が白くなるまで、GM-CSF/IL-4を含む1mLの完全培地を用いて骨髄腔をパルスし、フラッシュする。
   注:完全培養培地:10%FBS、1%ペニシリン - ストレプトマイシン、55μM β-メルカプトエタノール、10 ng / mL GM-CSF、および10 ng / mL IL-4。
3. すべての細胞を24 mLの完全培養培地(約5 x 105^cells/ mL)に再懸濁する。混合後、すべての培地を4mL/ウェルの6ウェルプレート上に播種し、次いで5%_CO2 と共に37°Cで2日間インキュベートした。
   注:赤血球を溶解する必要はありません。
4. 2日後にすべての培地をGM-CSF/IL-4 7を含む培地に交換^{してください}。4日目、6日目、および8日目に、培地の半分を10 ng/mL GM-CSF/IL-4を含む完全培地と交換する。
   注:このステップでは、赤血球およびリンパ球などの浮遊細胞が除去される。
5. 細胞増殖を記録するために毎日写真を撮ります。6日目から始めて、1日に1ウェルの細胞を採取して細胞数をカウントし、CD11c、CD80、およびMHC II発現⁶、^{7を検出した}。

3. CD11c、CD80、およびMHC IIの発現のフローサイトメトリー検出

1. DCをPBSで洗浄した後、100μLのFACSバッファーに1 x 106細胞を再懸濁し、0.5μgの抗マウス^CD16 /32抗体を加え、氷上で10分間インキュベートして非特異的抗原部位をブロックします。
2. 1 μg の Percp/cy5.5-CD11c、0.5 μg の PE-CD80、および 0.04 μg の APC-MHC II 抗体を加え、氷上で 30 分間インキュベートします。
3. 1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を除去し、1mLの4%パラホルムアルデヒドを加え、4°Cで30分間固定し、300μLのFACS緩衝液に再懸濁する。
4. フローサイトメトリーを実行します。

1 x 107-1.7 x107細胞を2つの大腿骨から抽出し、6ウェルプレートに植え付ける前に24 mLの培地に再懸濁した(図1A)。2日後、培養液を完全に交換して非接着細胞を除去した。培地を交換する前に、かなりの数の浮遊細胞が観察された(図1B)。培養の3日後、小細胞コロニーが形成され始めた。6日目に、コロニーのサイズと数は大幅に増加しました。7日目に、細胞数はピークに達し(22 x 106-27 x106)、その後徐々に減少した(図2A)。DC細胞の表面は、より長い偽足症で粗くなり、典型的な成熟DC細胞形態を示す(図2B)。フローサイトメトリー分析により、全細胞に対するCD11c陽性の割合は6日目に71%であったのに対し、10日目には96.1%に増加した(図2C、2D)。

共刺激分子の発現を評価するために、CD11c、CD80、およびMHC IIを共染色した8。図3Aに示すように、CD11c、CD80、およびMHC IIの発現は、6日目から10日目にかけて培養時間の増加とともに徐々に増加した。さらに、フローサイトメトリー分析は、CD11cおよびCD80二重陽性、CD11cおよびMHCII二重陽性(図3B、3D)、および三重陽性細胞(図3C、3D)の割合の漸進的な増加を示した。

図1:異なる培養時間におけるDCの代表的な画像。(B)異なる文化時代のDCの代表的な画像。骨髄細胞を10 ng/mL GM-CSFおよびIL-4を含む24 mLの培養液に懸濁し、6ウェルプレートに播種した。BF、培養液を変更する前;AFは、培養液を交換した後。赤い矢印、DCコロニー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なる培養時間におけるDCの数および純度。(B) DCの代表的な画像 (C,D) DCの割合の分析のフローサイトメトリーおよびグラフ表示。陽性細胞はCD11cでソートされました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:DCにおける共刺激分子の発現 (A)DCsにおけるCD11c、CD80、およびMHC ΙΙの発現。 (B)CD11cおよびCD80二重陽性、CD11cおよびMHC ΙΙ二重陽性、およびトリプルポジティブ細胞の割合のフローサイトメトリー分析。(C, D)6日目〜10日目からのフローサイトメトリー分析および統計分析を示すためにグラフ表示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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