マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

Summary

ここでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4で7日間培養した後、マウスから高純度骨髄由来樹状細胞を単離・生成する経済的かつ効率的な方法を紹介します。

Abstract

樹状細胞(DC)の需要は、免疫学研究が進むにつれて徐々に増加しています。しかし、DCはすべての組織において稀である。DCを単離するための従来の方法は、主に、顆粒球 - マクロファージコロニー刺激因子/インターロイキン−4(GM-CSF/IL-4)を大量(>10ng/mL)注射することによって骨髄(BM)をDCに分化させることを含み、手順を複雑かつ高価にする。このプロトコールでは、10 ng/mL GM-CSF/IL-4培地で培養したすべてのBM細胞を用いて、3〜4回の半培養交換の後、マウス(2つの大腿骨)あたり最大2.7 x^107個の CD11c⁺ 細胞(DC)を純度80%〜95%で回収した。培養10日後、CD11c、CD80、およびMHC IIの発現は増加したが、細胞数は減少した。細胞数は培養7日後にピークに達した。さらに、この方法は、すべての骨髄細胞を採取するのに10分しかかからず、培養1週間後に多数のDCが得られた。

Introduction

樹状細胞(DC)は、ナイーブT細胞を活性化し、感染症、アレルギー疾患、および腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導するための最も強力な抗原提示細胞(APC)である^1,2,3。DCは自然免疫と獲得免疫との間の主要なリンクであり、免疫学的防御および免疫寛容の維持に不可欠な役割を果たす。過去40年間、多くの研究者がDCのサブセットと炎症と免疫におけるその機能を定義しようとしてきました。これらの研究によると、DCは骨髄細胞からの骨髄系およびリンパ系に沿って発達する。腫瘍ワクチンは近年、重要なマイルストーンを獲得し、有望な未来を持っています。機械的には、腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原を用いて細胞傷害性Tリンパ球を活性化することによって免疫応答を調節し、腫瘍増殖を防止する。DCに基づくワクチンは、腫瘍免疫療法において重要な役割を果たしており、最も有望な抗腫瘍療法の1つとして同定されている^1,4。さらに、DCは、新しい分子標的薬および免疫チェックポイント阻害剤の試験に広く使用されている⁵。

研究者は、DCの役割をさらに研究するために、多数の高純度DCを緊急に必要としています。しかし、DCは様々な組織や血液ではまれであり、ヒトや動物の血球のわずか1%しか占めていません。骨髄樹状細胞(BMDC)の 体外 培養は、大量のDC細胞を得るための重要な方法である。一方、骨髄からDCを生成するためのLutzプロトコルは、研究者によって広く使用されています⁶。このプロトコルはDC細胞を得るのに有効であるが、複雑で高価であり、高濃度のサイトカインの添加および赤血球の溶解を伴う。

本研究では、マウス骨髄(BM)からほぼすべての骨髄細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4の濃度を低くして、 インビトロでの7~9日後のBMDCへの分化誘導方法を報告する。この手順は、ほとんどすべての骨髄細胞を採取し、それらを完全な培地に懸濁するのに10分しかかかりません。簡単に言えば、我々はこの研究においてBMDCのための効率的かつ費用対効果の高い培養方法を提供する。

Protocol

すべての手順は、南京医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

骨髄の単離とBM細胞の調製

1. C57BL/6マウス(18~22g、6~8週齢)を_CO2 窒息で屠殺する。マウスを操作台に固定します。表面を70%エタノールで消毒する。
2. 脚の皮膚を切って筋肉と大腿動脈を露出させます。2つの鉗子を使用して大腿動脈を締め付けて引き裂き、近位端を腹部に向かって引き抜く。
   注:大腿動脈を直接切断しないでください。さもなければ、それは過度の出血を引き起こし、視野を汚染するでしょう。
3. 大腿骨の周りのすべての筋肉を切断します。
4. 股関節脱臼の音が聞こえ、大腿骨頭の脱が見えるまで、マウスの下肢をゆっくりと外側に伸ばします。
5. 大腿骨頭の内側に沿ってはさみを使って下肢を体から分離します。
6. 膝関節の端から後肢を切断して、自由で完全な大腿骨を得る。
7. ガーゼを使って大腿骨に付着した筋肉を取り除きます。
   注:筋肉を直接引き裂かないでください。マウスの大腿骨は繊細であり、その完全性を維持しなければならない。
8. 大腿骨を75%アルコールに2〜5分間浸します。

2. BMDCの誘導培養

1. 残留アルコールをPBSですすいでください。止血鉗子を使用して大腿骨の中央部と底部をクランプし、もう1つのセットを使用して大腿骨の下端をクランプします。止血鉗子は大腿骨に横方向に適用され、大腿骨は骨端シールラインから分離される。
   注:骨端線は、大腿骨が骨折するまで容易には見えません。このステップと次のステップはすべて、滅菌環境で実行されます。
2. 1mLシリンジ(針:0.6 mm x 25 mm)を使用して骨端ラインブレイクから骨髄腔を貫通し、針を回転させて大腿骨頭および骨髄腔を貫通する。骨が白くなるまで、GM-CSF/IL-4を含む1mLの完全培地を用いて骨髄腔をパルスし、フラッシュする。
   注:完全培養培地:10%FBS、1%ペニシリン - ストレプトマイシン、55μM β-メルカプトエタノール、10 ng / mL GM-CSF、および10 ng / mL IL-4。
3. すべての細胞を24 mLの完全培養培地(約5 x 105^cells/ mL)に再懸濁する。混合後、すべての培地を4mL/ウェルの6ウェルプレート上に播種し、次いで5%_CO2 と共に37°Cで2日間インキュベートした。
   注:赤血球を溶解する必要はありません。
4. 2日後にすべての培地をGM-CSF/IL-4 7を含む培地に交換^{してください}。4日目、6日目、および8日目に、培地の半分を10 ng/mL GM-CSF/IL-4を含む完全培地と交換する。
   注:このステップでは、赤血球およびリンパ球などの浮遊細胞が除去される。
5. 細胞増殖を記録するために毎日写真を撮ります。6日目から始めて、1日に1ウェルの細胞を採取して細胞数をカウントし、CD11c、CD80、およびMHC II発現⁶、^{7を検出した}。

3. CD11c、CD80、およびMHC IIの発現のフローサイトメトリー検出

1. DCをPBSで洗浄した後、100μLのFACSバッファーに1 x 106細胞を再懸濁し、0.5μgの抗マウス^CD16 /32抗体を加え、氷上で10分間インキュベートして非特異的抗原部位をブロックします。
2. 1 μg の Percp/cy5.5-CD11c、0.5 μg の PE-CD80、および 0.04 μg の APC-MHC II 抗体を加え、氷上で 30 分間インキュベートします。
3. 1,000 x gで4°Cで3分間遠心分離し、上清を除去し、1mLの4%パラホルムアルデヒドを加え、4°Cで30分間固定し、300μLのFACS緩衝液に再懸濁する。
4. フローサイトメトリーを実行します。

Results

1 x 107-1.7 x¹⁰⁷細胞を2つの大腿骨から抽出し、6ウェルプレートに植え付ける前に24 mLの培地に再懸濁した(図1A)。2日後、培養液を完全に交換して非接着細胞を除去した。培地を交換する前に、かなりの数の浮遊細胞が観察された(図1B)。培養の3日後、小細胞コロニーが形成され始めた。6日目に、コロニーのサイズと数は大幅に増加しました。7日目に、細胞数はピークに達し(22 x 106-27 x¹⁰⁶)、その後徐々に減少した(図2A)。DC細胞の表面は、より長い偽足症で粗くなり、典型的な成熟DC細胞形態を示す(図2B)。フローサイトメトリー分析により、全細胞に対するCD11c陽性の割合は6日目に71%であったのに対し、10日目には96.1%に増加した(図2C、2D)。

共刺激分子の発現を評価するために、CD11c、CD80、およびMHC IIを共染色^した8。図3Aに示すように、CD11c、CD80、およびMHC IIの発現は、6日目から10日目にかけて培養時間の増加とともに徐々に増加した。さらに、フローサイトメトリー分析は、CD11cおよびCD80二重陽性、CD11cおよびMHCII二重陽性(図3B、3D)、および三重陽性細胞(図3C、3D)の割合の漸進的な増加を示した。

図1:異なる培養時間におけるDCの代表的な画像。(B)異なる文化時代のDCの代表的な画像。骨髄細胞を10 ng/mL GM-CSFおよびIL-4を含む24 mLの培養液に懸濁し、6ウェルプレートに播種した。BF、培養液を変更する前;AFは、培養液を交換した後。赤い矢印、DCコロニー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なる培養時間におけるDCの数および純度。(B) DCの代表的な画像 (C,D) DCの割合の分析のフローサイトメトリーおよびグラフ表示。陽性細胞はCD11cでソートされました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:DCにおける共刺激分子の発現 (A)DCsにおけるCD11c、CD80、およびMHC ΙΙの発現。 (B)CD11cおよびCD80二重陽性、CD11cおよびMHC ΙΙ二重陽性、およびトリプルポジティブ細胞の割合のフローサイトメトリー分析。(C, D)6日目〜10日目からのフローサイトメトリー分析および統計分析を示すためにグラフ表示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ヒトおよびマウスは、古典的なDC(cDC、cDC1およびcDC2を含む)、形質細胞様DC(pDC)、および単球由来DC(MoDC)を含む異なるDCサブセットを有する⁹、^10、11。cDC1sは細胞内病原体および癌に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を調節し、cDC2sは細胞外病原体、寄生虫、およびアレルゲンに対する免疫応答を調節することが一般に受け入れられている¹²。かなりの数のDCを、GM−CSFおよびIL−4の存在下でマウスのBM前駆細胞からインビトロで産生することができる⁶、^13、14。DCの純度と量は、DC免疫療法の成功に重要な役割を果たします。研究者らは、1 x 105〜1 x 106 DCの2回の投与が、異種移植片モデルにおいて効率的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発し得ることを示した^15,16,17,18。これは、腫瘍免疫療法におけるDCの役割をさらに調査するために、多数の高純度DCを培養する必要があることを意味する。

骨髄細胞を得る伝統的な方法は、大腿骨の両端を切断し、培地^6、7ですすいでおくことである。この研究では、生理学的解剖学的構造を革新的に使用して大腿骨を切断しました。止血鉗子は、大腿骨の下端をクランプし、それを横方向に動かすために使用された。骨端線は生理学的に弱く、ストレスを受けたときに骨折しやすい¹⁹。大腿骨が骨端線から分離された後、少量の骨が骨髄腔内に残る。針は骨髄腔内に骨を容易に貫通することができる。この方法は操作が簡単で、貴重な骨髄細胞を保護し、多数のDCの培養のための細胞基盤を提供する。我々は、GM-CSF単独よりもDCの成熟に大きく寄与する10ng/mL GM-CSFと10ng/mLのIL-4の組み合わせを用いてDCを培養した。LabeurとSonは、DCの培地にGM-CSFとIL-4を併用することで、IFN-ɣ、TNF-α、IL-6などの成熟マーカーの発現が高まり、抗原提示能が増強されたことを報告した7,20,21。Sonらはまた、GM−CSFとIL−4の組み合わせがDCの成熟を促進することを提案した^7,21。

本研究では、赤血球を溶解することなく、採取した骨髄細胞を直接培養し、勾配遠心分離により分離したところ、細胞消失、最終的には回収されたDCの減少につながる可能性がある。培地を交換する前に、赤血球、T細胞、B細胞、および顆粒球を含むいくつかの懸濁細胞が培養系に存在していた。共培養の間、これらの細胞は、DCの成熟を促進するためにサイトカインを産生し得る。

制限の点では、このプロトコルは、より小さな脛骨を除いて、マウスの2つの大腿骨のみを使用し、いくつかの間葉系幹細胞の損失をもたらした。要するに、我々は、骨髄細胞を分離するのにわずか10分しかかからないマウスからの骨髄由来樹状細胞の単離および生成のための費用対効果が高く効率的なプロトコルを開発しました。多数の高純度DCを、10ng/mLのGM-CSFおよびIL-4と共に6日〜7日間のインキュベーション後に回収した。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-メルカプトエタノール	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	サーモ	11875093
組換えマウス GM-CSF	Solarbio	P00184
組換えマウス IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (抗マウス CD16/32) 抗体		Biolegend 156603