方法論記事

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

DOI：

10.3791/63133

⸱

2021年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。

要約

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次世代シーケンシングの最近の改善により、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識が進歩し、いくつかの研究により血管生物学の新しいパラダイムが明らかになりました。これらの方法を血管発生のモデルに適用するには、胚および出生後の組織からの細胞分離技術の最適化が必要です。細胞収量、生存率、純度はすべて、次世代シーケンシングアプローチから正確で再現性のある結果を得るために最大である必要があります。新生児マウス網膜血管新生モデルは、血管発生のメカニズムを研究するために研究者によって使用されます。研究者は、このモデルを使用して、血管形成および成熟中の血管新生および動脈静脈運命の仕様のメカニズムを調査しました。次世代シーケンシング技術を適用して網膜血管発生モデルを研究するには、細胞収量、生存率、および純度を最大化する網膜内皮細胞の単離方法の最適化が必要です。このプロトコルは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用したマウス網膜組織の単離、消化、および精製の方法について説明しています。結果は、FACS精製CD31+/CD45-内皮細胞集団が内皮細胞の遺伝子発現に対して高度に濃縮されており、FACS後60分間生存率に変化を示さないことを示しています。バルクRNAシーケンシングやシングルセルRNAシーケンシングなど、この方法を使用して単離された内皮細胞に対する次世代シーケンシングアプローチの代表的な結果が含まれており、網膜内皮細胞単離のためのこの方法が次世代シーケンシングアプリケーションと互換性があることを示しています。網膜内皮細胞単離のこの方法は、血管発生の新しいメカニズムを明らかにするための高度なシーケンシング技術を可能にします。

概要

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次世代シーケンシングアプローチによる核酸シーケンシングのハイスループット能力は、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識を大幅に進歩させました。これらの高度な技術には、全トランスクリプトームRNAシーケンシング、一塩基多型(SNP)を特定するための標的領域のDNAシーケンシング、クロマチン免疫沈降(ChIP)シーケンシングにおける結合転写因子のDNAシーケンシング、またはトランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(ATAC)シーケンシングのアッセイにおけるオープンクロマチン領域、およびシングルセルRNAシーケンシングが含まれます1.血管生物学では、これらの進歩により、研究者は発生と疾患の複雑なメカニズムを解明し、さまざまな表現型の連続体に沿って遺伝子発現パターンを区別することができました2,3。将来の実験では、次世代シーケンシングと血管発生の評価モデルを組み合わせることで複雑なメカニズムをさらに定義できますが、サンプル調製の方法は高度なシーケンシング技術と互換性がある必要があります。

次世代シーケンシングアプローチの品質、精度、再現性は、サンプル調製の方法によって異なります。細胞のサブセットを単離したり、組織から単一細胞懸濁液を生成したりする場合、細胞集団の細胞数、生存率、および純度を最大化するには、最適な消化および精製方法が不可欠です4,5。これには消化方法のバランスが必要です:組織から細胞を放出し、下流のアプローチに十分な細胞を得るためには強力な消化が必要ですが、消化が強すぎると細胞の生存率に悪影響を及ぼします6,7。さらに、細胞集団の純度は、堅牢な結果とデータの正確な分析に必要であり、FACSを通じて達成できます。これは、血管発生の確立されたモデルに次世代シーケンシングを適用するために、細胞分離方法を最適化することの重要性を浮き彫りにしています。

血管の発達を調べるための十分に特徴付けられたモデルは、マウス網膜血管発達モデルです。マウス網膜血管系は出生後に2次元の表在神経叢で発達し、出生後(P)3に視神経からの最初の血管新生が見られ、P6に茎細胞と先端細胞を伴う血管新生前部と初期血管成熟が見られ、P9後に血管叢の成熟が見られます8,9。初期血管神経叢のリモデリングの間、内皮細胞は、循環ネットワークを生成するために、異なる血管における動脈、毛細血管、および静脈表現型に向かって仕様化を受ける10、11。したがって、この方法は、研究者が血管新生血管叢形成および内皮動脈静脈の仕様および成熟を、発生中の様々な時点で視覚化することを可能にする9。さらに、このモデルは、血管新生および血管神経叢の発達に対するトランスジェニック操作の影響を調べるための方法を提供し、血管の発達、動脈静脈奇形、および酸素誘発性血管新生の研究に適用されています12,13,14,15,16。.次世代シーケンシングアプローチとマウス網膜血管発生モデルを組み合わせるには、網膜組織から内皮細胞を単離するための最適化されたプロトコルが必要です。

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率を最大化するために、P6でマウスの網膜組織を消化するための最適化された方法を説明しています。網膜組織をP6マウスから単離し、20分間消化し、CD31およびCD45について免疫染色し、FACSを通して精製して、約2.5時間で内皮細胞の単一細胞懸濁液を単離した(図1A)。これらの内皮細胞は、単離後60分間高い生存率を維持することが判明し17、次世代シーケンシング法のためのライブラリ調製を可能にしました。さらに、この分離プロトコルを使用した2つの別々の次世代シーケンシングメソッド(全トランスクリプトームRNAシーケンシングとシングルセルRNAシーケンシング)からのFACSゲーティングおよび品質管理結果に関する代表的な結果が得られます。この方法により、次世代シーケンシングアプローチを網膜血管新生モデルと組み合わせて使用することで、血管発生の新しいメカニズムを解明することができます。

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プロトコル

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イェール大学とバージニア大学の施設動物管理および使用委員会は、このプロトコルに記載されているすべての動物実験を承認しました。

1.網膜分離のためのマウスの目を取得します

  1. 氷冷PBSを1回調製し、48ウェルプレートの各ウェルに500 μLを加えます。
  2. 承認された施設のガイドラインに従って、生後6日目(P6)に新生児マウスを安楽死させます。この実験では、約4〜8匹の新生児マウスの同腹仔を、呼吸停止後少なくとも3分間、イソフルラン吸入を介して P6で安楽死させ、続いて斬首します。
  3. 各マウスから目を取り除きます。解剖ハサミを使用してまぶたに対して垂直に切断することにより、目の上の皮膚と膜を切り取ります。次に、鉗子を使用して目の上下をそっと押し下げ、目がソケットから外れるようにします。
    1. 鉗子で目の下を慎重につまみ、目をくっつけたままの視神経を切断します。次に、収穫が終了するまで、準備した1x氷冷PBSの48ウェルプレートに各眼を置きます。
      注:マウスごとに1つのウェルを使用し、同じウェルに1つのマウスの両目を使用します。

2.マウス網膜組織を分離する

  1. 底部に解剖パッドを敷いたペトリ皿に、氷冷PBS1倍500μLを入れて目を沈め、倍率4.0倍に設定した解剖顕微鏡の下に置きます。
    1. 目を傷つけないように、先端の広いトランスファーピペットを使用して解剖パッドに目を吊り下げます。
      注意: 目が完全にPBSで覆われていることを確認してください。
  2. 2つの細かい解剖鉗子を使用して、安定化のために鉗子の1つで視神経を保持し、2番目の鉗子で角膜と強膜が接続する前房に穴を開けます(図1B)。角膜の周りの約75%の円で穴を引き裂きます。
    1. 鉗子の1つで視神経を保持したまま、2番目の鉗子を使用して、網膜組織から強膜をそっと引き裂きます。
    2. 上記のように、2番目の鉗子を使用して、網膜組織の硝子体をそっと引き裂きます。
    3. 再び、2番目の鉗子を使用して、硝子体を取り除いたときに外れなかった水晶体と硝子体神経叢血管をそっと取り除きます。これを行うには、網膜にほとんど触れるまで開いた鉗子で網膜に手を伸ばし、鉗子を閉じて水晶体と顎骨神経叢の血管をつかみ、網膜から鉗子を引き出します。これは、すべての血管が取り外されるまで繰り返すことができます。
      注:硝子神経叢は、透明なウェブのような構造に似ています。
  3. 2 mLの微量遠心チューブに500 μLの1x氷冷PBSを満たし、網膜をチューブに入れます。先に進む前に、すべての網膜を目から隔離し、氷のように冷たいPBSに入れます。
    注:マウスごとに1つのチューブを使用し、同じマウスからの2つの網膜がチューブを共有します。網膜組織が破れている場合は、それを複数の断片に移します。マウスの同腹仔の網膜組織解離の合計時間は、安楽死から最終的な網膜組織分離で終わる15〜60分かかるべきである。

figure-protocol-1
図1:分離プロトコルの概要 。 (A)各ステップの推定時間を含む分離タイムラインの概略図:網膜組織の分離、消化物、抗体染色、FACS、および細胞生存率ウィンドウ。(B)眼から網膜組織を単離するためのステップバイステップガイド、番号付きの解剖ステップ:1)角膜を突き刺す、2)角膜を涙液、3)涙液強膜、4)網膜から強膜を除去する、5)網膜から強膜および接続組織をさらに除去する、6)網膜から硝子体および硝子体血管を除去する。(C)さまざまな消化ステップ中の網膜組織の代表的な画像:消化前、消化後、ペレット(黒い矢印は網膜組織または細胞ペレットを強調しています)。Chavkinらの許可を得て転載、S. Karger AG、バーゼル17に掲載。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.網膜組織を単一の細胞懸濁液に消化します






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結果

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網膜組織の消化とCD31およびCD45の免疫染色により、細胞、単一細胞、および生存率をゲーティングした後、CD31+/CD45-内皮細胞の識別可能な集団が得られます(図2A)。CD45免疫染色は、血小板および一部の白血球を含むCD31+/CD45+細胞を除去するために必要です21。抗体特異性を示し、ゲーティング戦略を導くために、実験ごとにコントロールを実行する必要があります(図2B)。この割合は比較的低く、消化された単一細胞懸濁液中の全細胞の約0.5%〜1.0%である。

生存率と純度は、ヨウ化プロピジウム染色の定量と、異なる集団から単離されたRNAの遺伝子発現分析によって評価できます。消化時間を変化させると、細胞収量と生存率に影響し、20分の消化時間で最適な収量が得られ、非生存内皮細胞の割合は低くなります(図3A)。単離された内皮細胞は、その後のヨウ化プロピ...

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ディスカッション

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このプロトコルは、高い細胞数、純度、および生存率のために最適化された、出生後のマウス網膜組織から内皮細胞を単離する方法を説明しています。細胞純度は、CD31+/CD45-免疫染色による消化された単一細胞懸濁液からの内皮細胞集団のFACS単離によって得られます。単離の質は、トリパンブルー染色による生存率およびCD31、CD45、およびVE-カドヘリンのqPCRによる遺伝子発現のアッセイで定量化されます(ただし、VE-カドヘリンは免疫染色には使用されていません)。このプロトコルの重要なステップは、網膜組織の分離と組織消化です。網膜組織の単離は、細胞の生存率を維持し、細胞の純度を高めるために正確に迅速に実行する必要があります。組織消化は、記載されているように、細胞収量と細胞生存率を最適化するために実行する必要があります。

このプロトコルへの変更は、この方法を異なる時点、トランスジェニック修飾を有するマウス、または異なるダウンストリームアプリケーションに適用する場合に行うことができる。これは、成人の網膜組織を調査する場合に特に重要であり、組織はP6網膜組織よりも成熟している可能性があり、純...

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開示事項

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著者には関連する開示はありません。

謝辞

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Yale Flow Cytometry施設、バージニア大学フローサイトメトリーコア施設、Yale Center for Genomic Analysis、およびUniversity of Virginia Genome Analysis and Technology Coreの方々に、提示された実験に貢献するための努力、専門知識、アドバイスをいただき、ありがとうございます。この研究は、N.W.C.(T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650), およびK.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765)へのNIH助成金によって資金提供された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2mLエッペンドルフ 安全ロックチューブUSA Scientific4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap CapCorning352235
60 mm Non TC-treated CultureDish Corning430589
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κアイソタイプコントロールBD Biosciences553932
BD FACSChorus SoftwareBD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody Cell SorterBD BiosciencesFACSMELODY
コラゲナーゼ II型Sigma-Aldrich234115
Costar 48ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート、個別包装、滅菌コーニング3548
D-GlucoseGibcoA2494001
使い捨て目盛り付きトランスファーピペットFisher Scientific12-711-9AM
解剖パンワックスCarolina629100
解剖はさみFine Science Tools14085-08
解剖実体顕微鏡 M165 FCライカM165FC
ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM)Gibco11965-052
Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Gibco14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mLSigma-Aldrich22364120
Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
Fine dissection ForcepsFine Science Tools11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco14175095
HEPES (1M)Gibco15630130
iScript cDNA合成キットBio-Rad1708890
Isoflurane, USPCovetrus11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water BathFisher ScientificFSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttttcagttt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: CD45_Reverse: 5'- ctggacagacacagttagca -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー:VE-Cadherin_Forward:5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
プライマー: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
ヨウ化プロピジウムSigma-AldrichP4864
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Sorvall Legend Micro 21R 遠心分離機、冷蔵ThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
Trypan Blue Solutionサーモフィッシャー15250061
V450 ラット 抗マウス CD45BD バイオサイエンス560501
V450 ラット IgG2b, & カッパ;アイソタイプコントロールBD Biosciences560457

参考文献

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  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42(2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366(2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149(2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514(2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049(2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

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