方法論記事

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

DOI：

10.3791/63269

⸱

2022年3月22日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微生物代謝の光遺伝学的制御は、発酵プロセスに対する柔軟な動的制御を提供する。ここでのプロトコルは、異なる体積スケールでの化学およびタンパク質生産のための青色光調節発酵を設定する方法を示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微生物細胞工場は、再生可能な原料から化学物質や組換えタンパク質を生産するための持続可能な代替手段を提供します。しかし、微生物に遺伝子組み換えを過剰に負担をかけると、宿主の適応度と生産性が低下する可能性があります。この問題は、動的制御(酵素および経路の誘導性発現、典型的には化学的または栄養ベースの添加剤を使用して、細胞の成長および産生のバランスをとることによって克服することができる。光遺伝学は、遺伝子発現を動的に調節する非侵襲的、高度に調整可能、かつ可逆的な方法を提供する。ここでは、化学物質または組換えタンパク質の生産のために、操作された 大腸菌 および サッカロミセス・セレビシエ の光制御発酵を設定する方法について説明します。私たちは、発酵制御と生産性を向上させるために微生物の増殖と生産を切り離すために、選択された時間と投与量で光を適用する方法、および最良の結果を得るための主要な最適化考慮事項について説明します。さらに、ラボ規模のバイオリアクター実験のための光制御を実装する方法について説明します。これらのプロトコルは、発酵性能を向上させるために、操作された微生物における光遺伝学的制御の採用を容易にする。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光応答性タンパク質による生物学的プロセスの制御であるオプトジェネティクスは、化学的およびタンパク質生産のための微生物発酵を動的に制御する新しい戦略を提供します1,2。操作された代謝経路の負担と、一部の中間体および生成物の毒性は、しばしば細胞増殖を損なう3。このようなストレスは、バイオマスの蓄積不良や生産性の低下につながる可能性があります3。この課題は、発酵を時間的に成長段階と生産段階に分け、代謝資源をバイオマス蓄積または製品合成にそれぞれ捧げることによって対処することができます4。我々は最近、この二相発酵における成長から生産への移行が、照明条件の変化によって誘発され得ることを示した5,6,7。光入力の高い同調性、可逆性、直交性8は、従来の二相発酵の動的制御に使用される化学誘導物質では複製が困難または不可能な光制御発酵に独自の利点を提供します4,9,10,11。

エリスロバクター・リトラリス由来の青色光応答性EL222タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ5,7,12,13における代謝工学のためのいくつかの光遺伝学的回路を開発するために使用されている。EL222は、青色光活性化(465nm)時に立体構造シフトを受ける光酸素電圧センサ(LOV)ドメインを含み、これにより、同族DNA配列(C120)13に結合することができる。EL222をウイルスVP16活性化ドメイン(VP16-EL222)に融合させることで、合成プロモーターPC120からS. cerevisiae7および他の生物14における遺伝子発現を可逆的に活性化することができる青色光応答性転写因子が得られる。EL222に基づくいくつかの回路が開発され、目的の遺伝子がPC120から直接発現される基本的な光活性化OptoEXPシステム7など、S. cerevisiaeの化学生産に使用されています(図1A)。しかし、発酵の生産段階で典型的に遭遇する高い細胞密度での光の浸透の懸念は、OptoINVRTおよびOptoQ-INVRT回路(図1B)5、7、13のような暗闇で誘導される反転回路を開発する動機となった。これらの系は、それぞれセレビシエ菌およびクラッサ菌由来のガラクトース(GAL)またはキナ酸(Q)レギュロンを利用し、対応するリプレッサー(GAL80およびQS)をVP16-EL222で制御して、光では遺伝子発現を抑制し、暗闇では強く誘導します。OptoEXP回路とOptoINVRT回路を組み合わせることで、遺伝子発現の双方向制御が可能になり、成長期が青色光で誘導され、生産期が暗さで誘導される2相発酵が可能になります(図2A)5,7。

生産段階で遺伝子発現を誘導するために暗闇の代わりに光を使用することは、光遺伝学的制御の能力を大幅に拡大するが、発酵のこの段階で典型的に遭遇する高い細胞密度の光浸透制限を克服することも必要である。この目的のために、我々は、青色光刺激に対する転写応答を増幅するOptoAMPおよびOptoQ-AMPとして知られる回路を開発しました。これらの回路は、VP16-EL222の野生型または過敏性変異体を使用して、GALまたはQレギュロンの転写活性化剤Gal4pまたはQF2の産生をそれぞれ制御し、光による感度の向上とより強い遺伝子発現を達成します12,13(図1C)。OptoAMP回路は、光学密度(600nmで測定)で5Lバイオリアクターで完全かつ均質な光誘導を達成することができます。OD600)は、照明のわずか〜0.35%(バルク表面の〜7%のみに5%の光線量)を有する少なくとも40の値である。これは、100%に近い照明を必要とするOptoEXPと比較して、より高い感度を示しています12。高い細胞密度で光で遺伝子発現を効果的に誘導する能力は、発酵の動的制御のための新しい機会を開きます。これには、化学生産を最適化するために独自の光スケジュールで成長、誘導、生産段階が確立される三相発酵など、2つ以上の時間的段階における発酵の操作が含まれます(図2B)12。

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図1:セレビシエ菌の動的制御のための光遺伝学的回路 OptoEXP、OptoINVRT、およびOptoAMP回路は、光に敏感なVP16-EL222システムに基づいています。(A)OptoEXP回路では、青色光への曝露はVP16-EL222の立体構造変化および二量体化を引き起こし、DNA結合ドメインを露出させ、PC120からの転写を可能にする。この図はZhao et al.7から修正されたものである。(B)OptoINVRT回路は、GALまたはQレギュロンを利用して、暗闇での発現を誘導する。GALベースの回路では、VP16-EL222およびGAL4が恒常的に発現され、PC120はGAL80リプレッサーの発現を駆動する(Qベースの回路では、GAL4およびGAL80はそれぞれQF2およびQSに置き換えられ、GALプロモーターの代わりに合成QUAS含有プロモーターが使用される)。光の中で、Gal80pはPGAL1からの目的遺伝子の活性化を妨げる。暗闇では、GAL80は発現されず、構成的デグロンドメイン(小さな茶色のドメイン)に融合することによって急速に分解され、Gal4pによるPGAL1の活性化を可能にする。この図はZhao et al.5から修正されています。(C) OptoAMP回路はVP16-EL222を使用してGALまたはQレギュロンも制御します。これらの回路では、GAL80リプレッサー(またはQS)が恒常的に表現され、光感受性デグロン(小さな青色領域)に融合され、暗闇でのタイトな抑制を保証します。PC120および過敏性VP16−EL222変異体は、光でGAL4(またはQF2)の発現を制御し、光中でPGAL1(またはQUAS含有プロモーター)を強く活性化する。GAL由来の回路は、活性が増大したPGAL1-MやPGAL1-Sなどの操作型PGAL1や、GALレギュロン(PGAL1、PGAL10、PGAL2、PGAL7)によって制御される野生型プロモーターを使用することができる。この図はZhao et al.12から修正されています。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

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図2:時間の経過に伴う 二相発酵と三相発酵。(A)逆回路で操作される二相発酵は、光駆動の成長段階と暗黒生産段階からなる。成長段階では、生産経路が抑制されたままであるため、バイオマスは蓄積します。所望のOD600に達すると、細胞は、産生段階のために新鮮な培地に再懸濁される前に代謝的に調整するために暗所にシフトされる。(B)三相プロセスにおいて、成長、インキュベーション、および生産段階は、暗い成長期間、パルスインキュベーション、および完全に照らされた生産段階からなることができる固有の光スケジュールによって定義される。バイオレンダーで作成した図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

光遺伝学的回路は、大腸菌における化学的およびタンパク質産生の動的制御のためにも開発されている。OptoLAC回路は、YF1/FixJ 2成分系をベースとする光応答性pDawn回路を使用して、細菌のLacIリプレッサを制御します6(図3)。OptoINVRT5と同様に、OptoLAC回路は、光の中で遺伝子発現を抑制し、暗闇の中でそれを誘導するように設計されています。OptoLAC回路を用いた発現レベルは、標準的なイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導で達成された発現レベルに匹敵するか、それを超えることができるため、化学的誘導の強度を維持しながら、同調性と可逆性を高めます6。したがって、OptoLAC回路は、大腸菌における代謝工学のための効果的な光遺伝学的制御を可能にする。

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図3:大腸菌の動的制御のためのOptoLAC回路。 OptoLAC回路は、pDawnシステムとlacオペロンを適応させて、暗闇の中での活性化と光での抑圧を実現します。暗所では、YF1はFixJをリン酸化し、PFixK2プロモーターを活性化してcIリプレッサーを発現させる。cIリプレッサーは、PRプロモーターからのlacIリプレッサーの発現を防止し、lacO含有プロモーターからの目的遺伝子の転写を可能にする。逆に、青色光はYF1ネットキナーゼ活性を低下させ、FixJリン酸化を逆転させ、したがってcI発現を逆転させ、lacIの発現を抑制し、lacO含有プロモーターからの発現を妨げる。この図はLalwani et al.6から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここでは、化学またはタンパク質生産のための セレビシエ 菌および 大腸菌 の光制御発酵のための基本的なプロトコルについて説明します。酵母とバクテリアの両方について、まず、光駆動の増殖段階と、OptoINVRTおよびOptoLAC回路によって可能になる暗闇誘発生産段階を有する発酵に焦点を当てています。続いて、OptoAMP回路によって可能になる三相(成長、誘導、生産)光制御発酵のプロトコルについて説明します。さらに、光遺伝学的に制御された発酵をマイクロプレートからラボ規模のバイオリアクターにスケールアップする方法についても説明します。このプロトコルにより、化学的またはタンパク質生産のための光制御発酵を実行するための完全で再現性の高いガイドを提供することを目指しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S. cerevisiae OptoINVRT7回路を用いた光制御化学品製造

  1. ひずみ構造
    1. このマーカーは既存のほとんどのOptoINVRTプラスミドに必要であるため、 his3 要求性を有する株を入手してください5。 S. cerevisiaeに天然の遺伝子の光遺伝学的調節を求める場合、その遺伝子の任意の内因性コピーが欠失した株を構築する。
    2. EZ-L4395などのOptoINVRT7回路を含むプラスミドを線形化し、標準的な酢酸リチウム形質転換法を用いて栄養要求性株のhis3遺伝子座に組み込みます15。PGAL1を光で抑制し、暗所で活性化する成分を含むEZ-L439プラスミドを使用する場合は、PmeI制限部位で直線化してください。
    3. 形質転換に続いて、細胞を150 x g で1分間遠心分離し、200 μLの新鮮なヒスチジン - 脱落合成完全培地(SC-His)培地に穏やかに再懸濁する。
    4. 細胞体積全体をSC-His寒天プレート上にプレートし、コロニーが現れるまで30°Cで2〜3日間インキュベートする。
    5. 標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコルを使用してこの株からコンピテントセルを作製し、PGAL1-MまたはPGAL1-Sプロモーターのいずれかの下流で光遺伝学的に制御される遺伝子を含むプラスミドでそれらを形質転換します5。
      注:δ部位(YARCdelta5)に集積し、ゼオシンと選択するプラスミドを使用すると、安定した多重コピーの統合が可能になります7,16,17,18。
    6. 形質転換後、培養物を150 x g で1分間遠心分離し、200 μLの新鮮なSCドロップアウト培地に穏やかに再懸濁する。
      注:PGAL1-Mプロモーターは、Mig1p抑制部位が削除されたPGAL1プロモーターの合成バージョンであり、PGAL1-Sは、余分なGal4pアクチベーター結合部位を有するPGAL1-Mの工学的バージョンである。正規のPGAL1プロモーターは、発現を制御するために使用することができる。しかしながら、発現強度は、これらの操作されたプロモーターからのものよりも低くなるであろう。
    7. 酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)寒天プレートに全細胞体積をδ部位に組み入れる場合はプレートに、選択マーカーを含むプラスミドで形質転換する場合はSCドロップアウトプレートにプレートする。光遺伝学的に制御された遺伝子を抑制し続けるために、一定の青色光の下で30°Cで16時間インキュベートする。
      注:一部の菌株では、コロニーは、一定の照明ではなく、青色光パルス(例えば、1秒オン/79秒オフ、5秒オン/75秒オフ、10秒オン/70秒オフなど)でインキュベートするとより速く成長する可能性があり、必要に応じて各株について実験的に決定する必要があります。
    8. 任意の465 nm光源を使用し、光強度が〜80〜110μmol / m2 / sになるように、プレートから約40cm上にLEDパネルを置きます。量子メーターを使用して強度を測定します( 材料表を参照)。
    9. δ部位に組み込む場合は、400 μg/mL ~ 1,200 μg/mL の範囲のゼオシン濃度を含む YPD プレート上にプレートのレプリカを作成し、さまざまな統合コピー番号 5、7、12、16、17、18 を選択します。レプリカプレートを30°Cで一定またはパルス状の青色光の下で、コロニーが現れるまで2〜3日間インキュベートする。
  2. 最高のコロニーのための予備スクリーニング
    1. 各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに2%グルコースを添加した1mLのSC-His培地を接種する。細胞下の24ウェルプレートで、一定の青色光照明下で200rpm(軌道直径19mm)振とうしながら30°Cで一晩(16〜20時間)増殖させる。
    2. 翌朝、各培養物を2%グルコースを含む1mLの新鮮なSC-His培地で0.01~0.3 のOD600値に希釈し、24ウェルプレートで24ウェルプレートで30°Cの一定光またはパルス光下で200rpm振とうしながら、2~9回のOD600 値の細胞密度に達するまで増殖させます(図4A)。この成長期に必要な時間は、株に依存するであろう。
    3. ライトパネルをオフにし、プレートをアルミ箔で包んで200rpm振とうしながら、30°Cで4時間暗所でプレートをインキュベートします。
      注:このステップにより、細胞は、産生培地に再懸濁する前に代謝的に産生期に移行することができる。
    4. 生産段階を開始するには、24ウェルプレート内の培養物を234 x g で5分間遠心分離し、細胞を2%グルコースを含む1 mLの新鮮なSCドロップアウト培地に再懸濁します。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートをシールする。
    5. 密封プレートを暗所で200rpmで振とうしながら30°Cで48時間発酵させる。プレートがアルミホイルで包まれていることを確認し、光にさらさないようにします。
      注:プレートをホイルで包んでも、発酵中の酸素またはガスの利用可能性が制限されることはありません。しかし、滅菌シールテープはガス移動を制限します。必要に応じて、テープに小さな穴をあけて酸素を導入することができます。
  3. 収穫と分析
    1. 発酵物を回収するには、プレートを234 x g で5分間遠心分離し、800 μLの上清を1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。
    2. 目的の化学物質に応じて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、または使用する機器に最も適したサンプル調製技術を使用した別の分析方法を使用して分析します。

2. 大腸菌OptoLACシステムによる光制御タンパク質生産

  1. ひずみ構造
    1. 光LAC1BまたはOptoLAC2B回路6を含むプラスミドと、PT7プロモーターから目的の組換えタンパク質を発現するプラスミドとで共コンピテントBL21 DE3 DE3 ΔlacI-DE3を共変換する19。
    2. 形質転換後、カタボライト抑制(SOC;2%トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース)を用いて、37°Cで1mLの超最適ブロス中で細胞を1時間回収し、回転または振とうした。
      注:目的のタンパク質を含むプラスミドは、OptoLACプラスミド(すなわち、異なる耐性マーカーおよび複製起点)と適合性がなければならず、 lacIのコピーを含んではならない。
    3. 細胞を4845 x g で3分間遠心分離し、ペレットを200 μLのリゾゲンブロス(LB)培地で濃縮する。濃縮した細胞全体を適切な抗生物質でLB寒天プレート上にプレートし、一定の青色光の下で37°Cで一晩増殖させ、タンパク質発現を抑制したままにする。
  2. 発現確認のための初期スクリーニング
    1. 3つのシングルコロニーを採取し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに1mLのLB培地に適切な抗生物質を接種する。一定の青色光照明下で200rpm振とうしながら37°Cで一晩(16〜20時間)成長させる(図4A)。
    2. 翌日、1.5 μLの培養液を使用して、マイクロボリューム測定を伴う分光光度計でOD600 を測定した。培養物を 24 ウェルプレート中の 1 mL の新鮮な LB に希釈し、0.01 ~ 0.1 の範囲の OD600 値にします。
    3. 培養物を37°Cで増殖させ、青色光下で200rpm振とうして2〜3時間振る。2 時間目から始めて、培養物が 0.1 ~ 1.5 の OD600 範囲を過剰に増殖させないように、15 分ごとに OD600 測定を行います。
    4. 培養物が所望のOD600に達したら、ライトパネルをオフにし、プレートをアルミニウム箔で包んで生産段階を開始する。プレートを8時間(37°C)、20時間(30°C)、または48時間(18°C)暗所に保ち、200rpm振とうする。
    5. 各カルチャの最終的な OD600 値を測定して記録します。
  3. 収穫と分析
    1. 各培養物800 μLを1.5 mL微量遠心管に移し、17,000 x gで5分間遠心分離 した。
    2. 細胞ペレットを200 μLの再懸濁緩衝液(トリス50 mM、pH 8.0、NaCl 300 mM)に再懸濁する。
      注:NaClの濃度は、分析中の組換えタンパク質に基づいて調整することができる。
    3. 50 μLの6xドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルバッファー(トリス375 mM、pH 6.8、SDS 9%、グリセロール50%、ブロモフェノールブルー0.03%、DTT 9%)を加える。サーモミキサーにて700rpmで振とうしながら100°Cで10分間インキュベートする。
    4. 培養液を約3~20μLの12%SDS-PAGEゲルにロードする。最終的なOD600測定を目安として、各サンプルについてほぼ同量のタンパク質を負荷する(最終OD600 値1に対応するサンプルの10 μLに相当)。電源を使用して、ゲルが完全に分解されるまで 100 V で電気泳動を実行します。
    5. 電子レンジで30〜40秒間加熱し、プラットフォーム回転子上で少なくとも15分間インキュベートすることにより、クマシーブリリアントブルーG-250溶液でゲルを染色する。
    6. 脱イオン水で2回すすぎ、プラットフォーム回転子で少なくとも30分間(または一晩)脱染し、汚れを吸収するために結び目に取り付けられた2つのクリーニングワイプを追加します。電子レンジで十分な量の水でゲルを15分間煮沸し、脱染プロセスをスピードアップします。

3. セレビシエ・オプトAMPシステムによる三相発酵

  1. ひずみ構造
    1. 既存のOptoAMPプラスミドを使用するためにはこのマーカーが必要であるため、his3栄養要求性マーカーを有する株を入手してください5。S. cerevisiaeに天然の遺伝子の光遺伝学的調節を求める場合、この遺伝子の内因性コピーが欠失する株を構築する。
    2. EZ-L58012などのOptoAMP4回路を含むプラスミドを線形化し、標準的な酢酸リチウム形質転換法を使用して栄養要求性株のhis3遺伝子座に組み込みます15。EZ-L580を用いる場合は、プラスミドをPmeI制限部位で線形化する。
    3. 形質転換後、細胞を150 x g で1分間遠心分離し、200 μLの新鮮なSC-His培地に穏やかに再懸濁します。
    4. 細胞体積全体を選択培地(SC-His-寒天)にプレートし、コロニーが現れるまで30°Cで2〜3日間インキュベートする。
    5. この菌株からコンピテントセルを作製し、PGAL1-Sプロモーター12の下流に光遺伝学的に制御する遺伝子を含むプラスミドで形質転換します。
      注:δ部位に集積し、ゼオシンと選択するプラスミドを使用すると、安定したマルチコピーの統合と選択が可能になります。
    6. 形質転換後、培養物を150 x g で1分間遠心分離し、200 μLの新鮮なSCドロップアウト培地に穏やかに再懸濁する。
      注:PGAL1-Sプロモーターは、Mig1p抑制部位が欠失し、余分なGal4pアクチベーター結合部位が付加されたPGAL1プロモーターの合成バージョンである。通常のPGAL1プロモーターを使用することができる;しかしながら、発現強度は、この操作されたプロモーターよりも低くなるであろう。
    7. 細胞体積全体をYPDまたはSCドロップアウト寒天プレート上に平板し、暗所で30°Cで16時間インキュベートした(アルミニウム箔で包んだ)。暗闇の中でインキュベートすると、光遺伝学的に制御された遺伝子が抑制され、細胞は代謝資源を化学生産ではなく細胞増殖に向けることができます。
    8. δ部位に集積する場合、レプリカプレートを、様々な集積コピー数について選択するゼオシン濃度の範囲を含むYPDプレート上にする。コロニーが現れるまで、プレートを暗所(アルミニウム箔で包んだ)で30°Cで2〜3日間インキュベートする。
  2. 最高のコロニーのための予備スクリーニング
    1. 各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに1mLのSC-His培地に2%グルコースを接種する。細胞を暗所で一晩(16〜20時間)増殖させ、30°Cで200rpm振とうする。
    2. 翌朝、各培養物を2%グルコースを含む1 mLの新鮮なSC-His培地で0.1 OD600に希釈し、30°Cで暗所で200rpm振とうしながら3のOD600に達するまで増殖させた。光に晒されないようにアルミホイルでプレートを包んでください。この成長期に必要な時間は、株に依存するであろう。
    3. 誘導相を開始するには、プレートをパルス光(例えば、5 秒オン/95 秒オフ)下で、200 rpmの振とうで30°Cで12時間インキュベートします。任意の465nm光源を使用し、最適な結果を得るために、光強度が〜80〜110μmol/m2/sになるようにLEDパネルをプレートの上に置きます(図4A)。
      注:このインキュベーションに最適な光パルス持続時間は、生成される化学物質によって異なります。0.1% (たとえば、1 秒 on 999 s オフ) から 100% (フル ライト) までのさまざまなライト スケジュールをスクリーニングすることをお勧めします。
    4. 生産段階を開始するには、培養物を234 x g で5分間遠心分離し、2%グルコースを含む新鮮なSC-His培地に再懸濁します。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートを密封する。
    5. 密封プレートを200rpmで振とうしながら30°Cで48時間光中で発酵させる。一部の化学物質は完全な光ではなくパルス生産段階の恩恵を受けるため、このステップ中の光スケジュールを最適化します。
  3. 収穫と分析
    1. プレートを 234 x g で 5 分間遠心分離し、800 μL の上清を 1.5 mL マイクロ遠心分離管に移して発酵物を回収します。
    2. 目的の化学物質に応じて、HPLC、GC-MS、または使用する機器に最も適したサンプル調製技術を使用した別の分析方法を使用して分析します。

4. 光制御バイオリアクターにおける大腸菌からの化学(メバロン酸)生産

  1. 初期接種とバイオリアクターのセットアップ
    1. 光制御化学生産で操作された大腸菌株のコロニーを、0.2% w/v カザミノ酸、5% w/v グルコース、および微量金属混合物 20 (0.0084 g/L EDTA, 0.0084 g/L EDTA, 0.0084 g/L EDTA, 0.0084 g/L EDTA, 0.855 mM NaCl, 0.935 mM NH4Cl) の 5 mL の M9 最小塩 (3.37 mM Na2HPO4, 2.2 mM KH2PO4, 0.855 mM NaCl, 0.935 mM NH4Cl) に接種する。 0.0025 g/L CoCl2, 0.015 g/L MnCl2, 0.0015 g/L CuCl2, 0.003 g/L H3BO3, 0.0025 g/L Na2MoO4, 0.008 g/L ZnCl2, 0.06 g/L クエン酸塩, 0.0045 g/L チアミン, 1.3 g/L MgSO4) を 50 mL 円錐管に入れた。
    2. 培養物を青色光照明下で200rpm振とうしながら30°Cで一晩生育させる。
    3. バイオリアクター容器ヘッドプレートをセットアップし、次のポートが取り付けられていることを確認します。溶存酸素(DO)プローブ;ガススパーガー - 0.2μmフィルターを介して空気源に接続します。インペラ;ガスコンデンサー - 0.2μmフィルターに接続します。冷却ライン(x2);供給ライン(x2) - 1つは培地添加用、もう1つはpH制御用。サンプリングライン - 容器の底に達することを確認します。空のポート。pHプローブ - 設置前にpH = 4およびpH = 7の標準でプローブを校正し、容器の残りの部分でオートクレーブするか、95%エタノールで滅菌し、セットアップ前に無菌的に挿入します。
    4. 容器にろ過水1Lを満たし、ヘッドプレートを取り付けて締め付け、Oリングがぴったりとフィットして密閉することを確認します。
    5. 反応器への開口部をアルミホイルで覆います。
    6. 3つのチューブストリップを準備します:1つは水を除去するため、もう1つは飼料を挿入するため、もう1つはpH制御用です。端部をアルミホイルで覆い、すべてのチューブをアルミホイルで包みます。
      注:pH調整に使用されるNH4OHは、シリコーンチューブ内でスムーズに流れず、不正確な流速および培養物の過剰塩基化につながる可能性があります。この問題を回避するには、NH4OHフィードに生体適合性ポンプチューブ(BPT)を使用してください。
    7. バイオリアクターおよびチューブをオートクレーブし、30分間の液体サイクルを使用した。
    8. オートクレーブから材料を取り外します。十分に冷えたら、インペラ、pHおよびDOプローブ、空気源、コンデンサーの入口と出口、冷却入口と出口をコントロールステーションに接続します。
    9. サーマルプローブを挿入し、容器を加熱ジャケットで覆います。培養物が光にさらされるのを妨げないように、ジャケットを容器の上部に固定します。
    10. 滅菌チューブの1つをサンプリングラインに接続し、サンプリングポンプを介して固定します。少なくとも1Lを収容できる空の容器に流れ込むようにもう一方の端を置き、容器内の水を排水します。
    11. 別の滅菌チューブを供給ラインの1つに接続し、供給ポンプの1つを介して固定します。チューブのもう一方の端をM9メディアのボトルに接続します。媒体を反応器に供給する。
    12. 別の滅菌チューブを供給ラインの1つに接続し、供給ポンプの1つを介して固定します。チューブのもう一方の端を28%〜30%のNH4OHを含むボトルに接続します。
      警告: NH4OH は腐食性です。飼料ボトルに移す際にヒュームフード内で作業し、飼料ボトルが二次封じ込めに配置されていることを確認します。
    13. 3つのライトパネルを反応器から約20cm離れた三角形の層に置き、容器の表面の光強度が両側から約80〜110μmol/m2/sに達することを確認します(図4B)。
    14. 翌日、バイオリアクターシステムとチラーの電源を入れます。反応器温度設定値を37°C、pH設定値を7.0、攪拌を200rpmとした。暖房ジャケットがオンになります。
    15. 最初に温度とDO測定値が一定になるまで待ってDOプローブを較正します(これは100%の設定値になります)。次に、プローブをシステムから取り外します(これは0%の設定値になります)。プローブを接続したときにDO測定が100%で安定するまで繰り返し、DOセットポイントを20%に設定します。
  2. 光制御化学品製造
    1. バイオリアクターを0.001-0.1の初期OD600 に接種する。ライトパネルをオンにして、成長を開始します。
    2. 3時間後、サンプリングラインからサンプルの採取を開始し、最適な誘導細胞密度(ρs)の過成長を避けるためにOD600測定を行います。最適なρs(メバロン酸塩生産の最適値は0.17)に達したら、ライトパネルをオフにし、反応器をアルミ箔で覆い、セットアップを黒い布で包んで暗い生産段階を開始します。
    3. 暗闇に切り替えてから8時間後に50μLの消泡剤を加える。空のポートを緩め、消泡剤を反応器に直接ピペットします。
    4. サンプリングポートを使用して、HPLCまたはGC分析用のサンプルを定期的に採取します。
  3. 分解と分析
    1. 実験が終了したら、システムの電源を切ります。DOプローブとpHプローブを慎重に緩め、石鹸と水で洗ってください。ヘッドプレートのネジを緩め、ブラシを使って石鹸と水で洗います。
    2. 培養物を空の容器に移し、漂白剤を最終濃度10%v/vまで加える。ヒュームフードに入れ、30分後に処分してください。
    3. ブラシを使用して、反応器容器を石鹸と水で洗浄します。
    4. 目的の製品に基づいて分析用のサンプルを準備します。メバロン酸生産のために、560 μLの培養物を140 μLの0.5 M HClと渦で高速で1分間混合する。これは、メバロン酸塩を(±)-メバロノラクトンに変換する。
      警告: HCl は健康上の危険があります。適切なPPEで取り扱い、ボルテックスの前にサンプルチューブが適切にキャップされていることを確認してください。
    5. 17,000 x g で4°Cで45分間遠心分離機。 250 μLの上清をHPLCバイアルに移す。
    6. メバロン酸塩については、有機酸イオン交換カラムを用いて試料を分析する。屈折率検出器(RID)を使用して生産を定量化し、ピーク面積を(±)-メバロノラクトンの標準と比較します。

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結果

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微生物代謝の光遺伝学的調節は、バイオ燃料、バルク化学物質、タンパク質、天然物を含む様々な製品を生産するために首尾よく実施されている5,6,7,12,13。これらのプロセスのほとんどは、細胞増殖が光の中で起こるように設計されており(細胞密度が低い場合、光透過に最小限の課題をもたらす場合)、および細胞が増殖すると暗闇によって産生が誘導されるように設計されている。このアプローチを用いて酵母から生産された様々な化学物質には、貴重な高分子前駆体や食品添加物である乳酸や、次世代バイオ燃料であるイソブタノールなどが含まれる。両方の化学物質について、共通の課題は、S. cerevisiaeがグルコースを目的の生成物ではなくエタノール生産に向けて代謝する強い駆動力と、深刻な成長欠陥を引き起こすことなくエタノール発酵...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動的制御は、代謝工学と組換えタンパク質生産の収量を改善するために長い間適用されてきました4。酵素発現の変化は、IPTG21、ガラクトース22、およびテトラサイクリン23などの化学誘導物質を用いて最も典型的には実施されるが、温度およびpHなどのプロセス条件を用いて媒介される。遺伝子発現の光遺伝学的制御により、発酵パラメータや培地組成を変更する必要がなくなり、従来の誘導戦略に容易に適用できる代替手段となります。光を簡単にオンまたはオフにできることは、遺伝子投与量の迅速かつ可逆的な調整などの新しい機能も提供します。さらに、これらのプロトコルは青色光応答系に焦点を当てていますが、既存の光応答を反転させる光遺伝学的ツール24、または他の波長の光に応答する光遺伝学的ツール25,26,27,28,29の存在は

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この記事で説明した光遺伝学的回路および方法に関するいくつかの特許を申請している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、米国エネルギー省科学局、生物環境研究局賞番号DE-SC0019363、NSF CAREER賞CBET-1751840、ピュー慈善信託、およびカミーユドレフュス教師学者賞の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<S. cerevisiae
24ウェル培養プレートUSA ScientificCC7672-7524
寒天粉末サーモフィッシャーサイエンティフィック303991049
アルミホイレイノルズB004NG90YO
バイオスペクトロメーター μキュベットエッペンドルフ6135000923
青色LEDパネルHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 プラスミド該当なし該当なし 参照1
グルコースサーモフィッシャーサイエンティフィック501879892 (G8270-5KG)
マイクロ遠心機サーモフィッシャーサイエンティフィックセ75002403
マイクロ遠心チューブUSA Scientific1615-5510
オービタルシェーカーYamato Scientific AmericaSOU-300
ペトリ皿Celltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
量子計Apogee InstrumentsMQ-510
レプリカめっき装置ThomasScientific F37848-0000
レプリカメッキパッドサンライズ科学製品3005-012
SC-彼の粉末サンライズ科学製品1303-030
SC 完全な粉末サンライズ科学製品1459-100
滅菌シーリングフィルムExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD 寒天プレートVWR100217-054
ZeocinサーモフィッシャーサイエンティフィックR25005
光制御タンパク質生産 E. coli
6X SDS サンプルバッファーCepham Life Sciences10502
12% アクリルアミドタンパク質ゲルサーモフィッシャーサイエンティフィックNP0341BOX
24ウェル培養プレートUSA ScientificCC7672-7524
アルミホイルレイノルズB004NG90YO
バイオスペクトロメーターμキュベットEppendorf6135000923
Blue LED panelHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
電気泳動セルBio-Rad1658004
電気泳動電源Bio-Rad1645050
LB ブロス (Miller)Fisher Scientific
マイクロ遠心機サーモフィッシャーサイエンティフィック75002403
マイクロ遠心チューブUSA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC プラスミド該当なし 該当なし 参照2
オービタルシェーカーYamato Scientific AmericaSOU-300
ペトリ皿セルトリート229656
量子計アポジー機器MQ-510
SOC 培地サーモフィッシャーサイエンティフィック15544034
サーモミキサーエッペンドルフ5382000015
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP1521
<ストロング>Sを使用した三相発酵。cerevisiae
「S. cerevisiaeを使用した光制御化学生産」プロトコルと同じ材料に加えて、以下を加えます:
EZ-L580 OptoAMP4 プラスミドN/A N/A 参照 参考文献 10
光制御バイオリアクターでの化学生産
アルミ箔ReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
Bioreactor with control stationEppendorfB120110001
BioSpectrometer with μキュベットエッペンドルフ6135000923
漂白剤VWR Scientific89501-620 (CS)
青色LEDパネルHQRP884667106091218
BPTチューブフィッシャーサイエンティフィック14-170-15
グルコースサーモフィッシャーサイエンティフィック501879892 (G8270-5KG)
塩酸 (HCl)フィッシャーサイエンティフィック7647-01-0
M9 最小限の塩サーモフィッシャーサイエンティフィックサイ
マイクロ遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75002403
マイクロ遠心チューブUSA Scientific1615-5510
NH4OH ソリューションSigma-AldrichI0503-1VL
オービタルシェーカーヤマトサイエンティフィック アメリカSOU-300
量子計Apogee InstrumentsMQ-510
SC コンプリートパウダーサンライズ サイエンス プロダクツ1459-100
を使用したstrong>光制御化学生産 ル サイエンティフィック サイエンティフィック BP97235エンティフィック A1374401

参考文献

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