Method Article

ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル

DOI:

10.3791/63289

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December 16th, 2021

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1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

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ここでは、レーザーマイクロダイセクションを介してヒトの死後黒質緻密組織から神経メラニン顆粒を分離するための堅牢なプロトコルを示します。この改訂および最適化されたプロトコルは、サンプル収集に必要な時間を大幅に最小限に抑え、必要なサンプル量を削減し、LC-MS/MS分析によるタンパク質の同定と定量を強化します。

Abstract

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ニューロメラニンは黒褐色がかった色素であり、 黒質のドーパミン作動性ニューロンのいわゆるニューロメラニン顆粒(NMG)に存在する。NMGには、ニューロメラニン以外にも、さまざまなタンパク質、脂質、金属が含まれています。パーキンソン病やレビー小体型認知症などの神経変性疾患では、NMGsを含むドーパミン作動性ニューロンが優先的に失われますが、NMGの形成メカニズムや健康や病気におけるNMGの役割についてはほとんど知られていません。したがって、NMGの分子特性評価に関するさらなる研究が不可欠です。残念ながら、タンパク質の単離のための標準的なプロトコルは、密度勾配超遠心分離に基づいているため、大量のヒト組織が必要です。したがって、自動レーザーマイクロダイセクション(LMD)ベースのプロトコルがここで確立され、偏りのない自動化された方法で最小限の量の組織を使用してNMGおよび周囲の 黒質 (SN)組織の収集が可能になります。その後、摘出されたサンプルを質量分析法で分析し、プロテオミクス組成を解読します。このワークフローでは、2,079のタンパク質が同定され、そのうち514のタンパク質がNMGで、181のタンパク質がSNでのみ同定されました。現在の結果は、両方のプロテオームで87.6%の重複に達する同様のLMDベースのアプローチを使用した以前の研究と比較され、ここに提示された改訂および最適化されたプロトコルの適用性を検証しました。現在の知見を検証するために、目的のタンパク質を、並行反応モニタリング(PRM)実験などの標的質量分析法で分析しました。

Introduction

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すべての組織は、異なる細胞タイプの不均一な混合物で構成されていますが、より正確な特性評価には、多くの場合、1つの細胞タイプの特異的分離が不可欠です。顕微鏡とレーザーアプリケーションを組み合わせたレーザーマイクロダイセクション(LMD)は、複雑な複合材料から組織領域、単一細胞、または細胞下部構造を特異的に分離するための強力なツールです。質量分析(LMD-MS)と組み合わせたLMDの適用は、DNA1、RNA2、タンパク質3,4,5の単離を含むいくつかの研究課題に対してすでに成功裏に実施されています。このプロトコルでは、パーキンソン病の新しい病態メカニズムを解読するために、ヒトの死後脳組織および細胞内成分のプロテオミクス分析のために、改訂および最適化されたLMD-MSプロトコルが説明されています。

ニューロメラニンは、黒質コンパクタ6のカテコールアミン作動性のドーパミン産生ニューロンに見られる黒色のほぼ不溶性の色素です。タンパク質や脂質とともに、ニューロメラニン顆粒(NMG)と呼ばれる二重膜に囲まれたオルガネラ様顆粒に蓄....

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Protocol

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人間の脳組織の使用は、ドイツの規制とガイドラインに従って、ドイツのルール大学ボーフムの倫理委員会(ファイル番号4760-13)によって承認されました。このプロトコルは、商業的に入手した 黒質コンパクタ 組織スライスに適用されています。提示されたプロトコルの概要を 図1に示します。

1.組織切片

  1. クライオスタットチャンバーを予冷します。
    注:組織ごとに異なるクライオスタット温度が必要であり、これはそれぞれのベンダープロトコルに記載されています。
  2. ステンレス鋼のナイフを70%エタノールで洗浄し、ブレードホルダーに取り付けます。
  3. アイスボックスを使用して、-80°Cの冷凍庫からクライオスタットに組織を移し、クライオスタットチャンバーの温度に15分間調整します。
  4. 鉛筆を使用してメンブレンスライドに明確にラベルを付けます。
    注:LMDベースのサンプル収集には、PET/PENメンブレンスライドが必要です。PET / PENメンブレンスライドは非常に壊れやすいため、取り扱いには注意してください。
  5. 市販の凍結切片培地をティッシュホルダーに一滴塗布します。完全に凍結する前に、組織を凍結切片培地の上に置き、硬化させて、組織を組織ホルダーに接続します。
  6. クラ....

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Results

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NMGおよびSN組織の特異的分離は、このプロトコルの適用を成功させるための最も重要なステップです。ベンダーが提供するLMDソフトウェアの 視野分析 機能を使用すると、NMGを色に応じて自動的に選択できます。したがって、NMGを含む組織領域(図2A)を特定し、色の閾値を調整した視野分析を実行して、NMGを標識する必要があります(図2B)。100μm²未満の領域をカバーする物体をフィルタリングした後は、NMGのみが分離のためにラベル付けされたままになります(図2C)。標識されたNMGの正確な分離は、レーザー設定を調整した後に達成されます(図2D)。NMGの単離後(図2E)、プロテオミクスプロファイルの比較のためにSN組織を50倍の倍率で選択し(図2F)、.......

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Discussion

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LMDは、特定の組織領域、単一細胞、または細胞内構造の単離に広く適用可能な技術です。ここで提示された改訂および自動化されたプロトコルでは、この技術は、神経メラニン顆粒(NMG)およびNMG周辺組織(SN)の特異的単離に適用されます。これまで、人間の 死後 脳組織からNMGを分離するための2つの異なるアプローチが公開され、広く使用されていました。

a)黒質組織20の1gを消費する不連続スクロース勾配。人間の死後黒質組織はまれであり、いくつかの研究課題で高い関心が寄せられているため、残念ながら、患者ごとに大量の組織が必要な場合、大規模なコホート研究を設定することは非常に困難です。したがって、このアプローチは、NMGs26の十分な単離に必要な組織量を0.15gに低減することをさらに改善した。しかし、それでも、完全な黒質化の少なくとも半分が必要でした。

b)LMDを使用.......

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Disclosures

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著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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この作業はdeによってサポートされました。NBI、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(助成金番号FKZ 031 A 534A)およびP.U.R.E.(ヨーロッパ内のタンパク質研究ユニットルール)およびタンパク質診断センター(ProDi)のプロジェクト、どちらもドイツのノルトラインヴェストファーレン州のイノベーション科学研究省からの助成金。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ジチオスレイトールAppliChemA1101
アセトニトリルメルク1.00029.2500
重炭酸アンモニウムSigma-AldrichA6141
ギ酸Sigma-Aldrich56302
ヨードアセトアミドAppliChemA1666,0100
マイクロチューブ 500カールツァイス415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN Membrane slideCarl Zeiss415190-9041-000<
em>substantia nigra pars compacta tissue slicesNavarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain)
トリフルオロ酢酸メルク91707
トリプシン シーケンシング グレードServa37283.01
アルティメット 3000 RSLC ナノ LC システムサーモフィッシャーサイエンティフィックULTIM3000RSLCNANO
ソフトウェア名strong>Weblink/CompanyVersion
FreeStyleモフィッシャーサイエンティフィック1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburサーモフィッシャーサイエンティフィック4.3
サー

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....

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Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

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