ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl-)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。
概要
嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。....
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プロトコル
すべての実験は、ヘルシンキ宣言と人間の研究倫理に関するHuriet-Serusclat法によって記述されたガイドラインと規制に従って行われました。
1. フラスコおよび異種培地の調製
- 表1に記載したように増幅、空気 - 液体、および凍結媒体を調製する。
- コラーゲン50mgを0.2%氷酢酸100mLに溶解してヒトコラーゲンIVの原液を調製する。マグネチックスターラーで少なくとも1時間混合し、溶液をフィルター滅菌する。光から保護されたガラス瓶に4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- 原液を二重蒸留水で1:5に希釈してコラーゲンIVの作用溶液を調製する。4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- プラスチック細胞培養フラスコまたはトランスウェルフィルターをコラーゲン作業溶液でコーティングする。0.33 cm 2 トランスウェルフィルターに 100 μL、25 cm 2 フラスコに 500 μL、75cm 2 フラスコに 1 mL をフラスコの成長面全体に均等に分配します。
注:これは、フラスコを左右に静かに傾けることによって達成することができる。あるいは、フラスコのコーティングを容易にするために、増加した体積を使用することができ、そして、表面全体が均等に覆われるとき、コ....
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結果
気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、免疫染色によって評価されるように、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示す(図1)。HNE細胞は、繊毛化(陽性α-チューブリン染色)および非繊毛粘液産生杯細胞(陽性Muc5Ac免疫染色)からなる擬似重層化呼吸器上皮の in vivo 状況を模倣する上皮細胞の不均一な層(陽性ケラチン8免疫染色)に再分化する。全体的な上皮はタイトジャンクションを提示する(ZO-1、帯-オクルデン-1染色によって評価される)。強力な頂端CFTR染色は野生型(WT)HNE細胞で見られ、F508del/F508del HNEでは頂端表面と細胞質の両方でCFTR染色の減少が観察されます。
試料は、拡大に成功しただけでなく、気液界面で3週間後に擬似層状上皮に分化することに成功し、200 Ω・cm2を超えるTEERを提示し、短絡電流測定が可能になったため、肯定的な結果が得られたと考えました。短絡電流測定によるCFTR関連のCl- 分泌アッセイを行.......
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ディスカッション
個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を横切るCFTR依存性Cl− 輸送の評価を可能にし、これは、様々な遺伝子型を有する患者の鼻電位差によって評価されるCFTR インビボ 活性と有意に相関することが示された9。VX−809処置時のHNE細胞におけるCFTR活性のレスキューはまた、ルマカフトル−イバカフトル処置F508delホモ接合型患者における臨床転帰FEV1 の改善にも有意に相関した12。
重要なことに、この研究.......
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開示事項
著者らは、この出版物または科学ビデオ制作に関連する競合する金銭的利益を報告していない。
謝辞
私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 ヤギ二次抗体 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 ヤギ二次抗体 | Invitrogen | A11012 | |
| アムホテリシンB | ライフテクノロジー | ズ 15290026 | |
| 抗α-チューブリン抗体 | アブカム | ab80779 | |
| 抗CFTRモノクローナル抗体 (24-1) | R&Dシステム | MAB25031 | |
| 抗サイトケラチン8抗体 | Progen | 61038 | |
| 抗Muc5AC抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| 抗ZO-1抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| シプロフロキサシン | ッカー病院薬局 | ||
| コリマイシン | サノフィ | ネッカー提供)病院 薬局 | |
| コラーゲン IV型 | Sigma-Aldrich メルク | C-7521 | |
| 細胞診ブラシ | 研究室 GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich メルク | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| エピネフリン | Sigma-アルドリッチ メルク | E4375 | |
| F12-栄養混合物 | ライフテクノロジー | ズ 11765054 | |
| FBS | ライフテクノロジー | ズ 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| フラスコ 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| フラスコ 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| 氷酢酸 | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich メルク | H3375 | |
| ヒドロコルチゾン | Sigma-Aldrich メルク | SLCJ0893 | |
| インスリン | Sigma-Aldrich メルク | I0516 | |
| Mg2+ および Ca2+フリー DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ライフ | テクノロジーズ 15140130 | |
| タゾシリン | マイラン | ネッカー病院提供 薬局 | |
| トランズウェルフィルター | シグマ・アルドリッチ メルク | CLS3470-48EA | |
| トリトン-X100 | シグマ・アルドリッチ メルク | T8787 | |
| トリプシン 0.25% | ライフテクノロジー | 25200056 | |
| ベクタシールド 封入剤 DAPI | 付き ベクターラボラトリーズ | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| キシロカインナファゾリン 5% | アスペンフランス | ネッカー病院薬局 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
参考文献
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201(2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecul....
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