本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。
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この記事について
サマリー
要約
質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。
概要
質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフローのすべての段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性....
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プロトコル
1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備
- 高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。
- 水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。
注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。 - 沈殿を誘導するために必要な量のサンプルと溶媒を保持するのに十分な最小のポリプロピレン(PP)微量遠心分離バイアルを使用してください。
- 沈殿させるサンプル中のSDS濃度が2%(w/v)以下であることを確認します。SDSが高い場合は、サンプルを水で希釈します。
- 最適な沈殿効率を得るために、0.01 ~ 10 g/L のタンパク質濃度を確保します。
注:沈殿に最適な質量は、1〜100μgのタンパク質の範囲です。 - 使用前に、すべての溶媒および溶液に粒子状物質がないことを確認してください。ろ過(<0.5 μm)または遠心分離工程(室温で10,000 x g で1分間)のいずれかを実行して、未溶解の微粒子を除去します。
- ジスルフィド結合還元およびアルキル化が必要な場合は、タンパク質沈殿の前にこれらのステップを実施してください。過剰な還元試薬およびアルキル化試薬は、沈殿プロセスを通じて除去されるであろう。
- プロトコール....
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結果
図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ29によって定量した。簡単に説明すると、100 μLサンプルを100 μLのMBAS試薬(250 mgメチレンブルー、50 g硫酸ナトリウム、10 mL硫酸、水で1.0 Lに希釈)と組み合わせ、続いて400 μLのクロロホルムを添加し、UV/Vis分光光度計で651 nmの有機層の吸光度を測定しました。すべてのアプローチは、最適なMS分析を可能にするためにSDSを削減します。
定量的かつ再現性のあるタンパク質回収は、処理された酵母全細胞溶解物のSDS PAGE分析を通じて 図5.......
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ディスカッション
最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、32、33で定量的なSDS枯渇を提供しますが、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存する。バイアルベースの沈殿では、上清の大部分がピペッティングによって除去されると、凝集したペレットの一部が誤って失われる可能性がますます高まります。このため、残留溶媒のより有意な画分(〜20μL)を残し、洗浄工程34を追加することが不可欠である。洗浄工程では、バイアルから残留溶媒を希釈して除去します。特にCMWでは、ペレットが形成されると試料バイアルを渦巻く必要がない。激しい攪拌によってペレットを破壊すると、偶発的なピペッティングによる損失の可能性を高めるという望ましくない効果があります.......
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開示事項
Doucette研究所は、この研究で採用されたProTrap XGを考案し、特許を取得しました。AADはまた、サンプル調製カートリッジを商品化したプロテオフォーム・サイエンティフィックの創設パートナーでもあります。
謝辞
この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会から資金提供を受けました。著者らは、MSデータの取得に貢献してくれたBioinformatics Solutions Inc.(カナダ、ウォータールー)とHospital for Sick Children(トロント、カナダ)のSPARC BioCenter(Molecular Analysis)に感謝する。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトン | フィッシャー・サイエンティフィック | AC177170010 | ≤0.002%アルデヒド |
| アセトニトリル | フィッシャー・サイエンティフィック | A998-4 | HPLCグレード |
| 炭酸水素アンモニウム | ミリポール・シグマ | A6141-1KG | しっかりした |
| ベータ・メルカプトエタノール | ミリポール・シグマ | M3148-25ML | 分子生物学グレード |
| ブロモフェノールブルー | ミリポール・シグマ | B8026-5G | ブロモフェノール青ナトリウム塩 |
| クロロホルム | フィッシャー・サイエンティフィック | C298-400 | クロロホルム |
| 蟻酸 | ハネウェル | 56302 | LC-MS用の溶出添加剤 |
| 融合ルーモス質量分析計 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 標準タンパク質混合物の分析用 | |
| グリセロール | ミリポール・シグマ | 356352-1L-M | 分子生物学では、99%> |
| イソプロパノール | フィッシャー・サイエンティフィック | A4641 | HPLCグレード |
| メタノール | フィッシャー・サイエンティフィック | A452SK-4 | HPLCグレード |
| マイクロ遠心分離機 | フィッシャー・サイエンティフィック | 75-400-102 | 最大21,000 xg |
| マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL) | フィッシャー・サイエンティフィック | 05-408-130 | テーパードボトム |
| マイクロ遠心分離機チューブ (2 mL) | フィッシャー・サイエンティフィック | 02-681-321 | 丸みを帯びた底 |
| マイクロピペットのヒント (0.1-10 & mu;L) | フィッシャー・サイエンティフィック | 21-197-28 | ユニバーサルピペットチップ、非滅菌 |
| マイクロピペットのヒント (1-200 & mu;L) | フィッシャー・サイエンティフィック | 07-200-302 | ユニバーサルピペットチップ、非滅菌 |
| マイクロピペットのヒント (200-1000 & mu;L) | フィッシャー・サイエンティフィック | 07-200-303 | ユニバーサルピペットチップ、非滅菌 |
| マイクロピペット | フィッシャー・サイエンティフィック | 13-710-903 | マイクロピペット・トリオパック |
| ペプシン | ミリポール・シグマ | P0525000 | 凍乾粉末、および >3200単位/mg |
| プロトラップXG | プロテオフォーム・サイエンティフィック | PXG-0002 | 1箱あたり50個の完全なユニット |
| 塩化ナトリウム | ミリポール・シグマ | S9888-1KG | ACS試薬、>99% |
| ドデシル硫酸ナトリウム | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 28312 | 粉末状固体 |
| timsTOFプロ質量分析計 | ブルーカー | 肝臓プロテオーム抽出物の解析 | |
| トリフルオロ酢酸 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | L06374。AP | 99% |
| トリス | フィッシャー・サイエンティフィック | BP152-500 | 分子生物学グレード |
| トリプシン | ミリポール・シグマ | 9002-07-7 | 牛の膵臓から、TPCK処理済み |
| 尿素 | バイオ・ラッド | 1610731 | しっかりした |
| 水(脱イオン化) | サトリウス・アリウム ミニ水質浄化システム | 76307-662 | タイプ1ウルトラピュア(18.2 MΩ cm) |
| 硫酸亜鉛 | ミリポール・シグマ | 307491-100G | しっかりした |
参考文献
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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