質量分析に先立つ堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿

サマリー

本プロトコールは、質量分析前のプロテオームサンプルの堅牢かつ迅速な回収および精製のための制御された条件下での溶媒ベースのタンパク質沈殿を記載する。

要約

質量分析(MS)機器の複数の進歩により、定性的および定量的プロテオーム分析が改善されましたが、MSに先んじてタンパク質を単離、濃縮、および処理するためのより信頼性の高いフロントエンドアプローチは、プロテオーム特性評価を成功させるために不可欠です。低く、一貫性のないタンパク質回収率および界面活性剤などの残留不純物は、MS分析に有害である。タンパク質沈殿は、他のサンプル調製戦略と比較して、信頼性が低く、時間がかかり、技術的に実行が難しいと考えられがちです。これらの懸念は、最適なタンパク質沈殿プロトコルを採用することによって克服されます。アセトン沈殿の場合、特定の塩、温度制御、溶媒組成、および沈殿時間の組み合わせが重要ですが、クロロホルム/メタノール/水沈殿の効率は適切なピペッティングとバイアル操作に依存します。あるいは、これらの沈殿プロトコルは、使い捨てスピンカートリッジ内で合理化され、半自動化されています。従来の形式で、使い捨ての2段階ろ過および抽出カートリッジを使用した溶媒ベースのタンパク質沈殿の予想される結果を、この研究で示します。これには、ボトムアップのLC-MS/MS 分析によるプロテオーム混合物の詳細な特性評価が含まれます。SDSベースのワークフローの優れた性能は、非汚染タンパク質と比較しても実証されています。

概要

質量分析によるプロテオーム分析は、最新のMS機器の感度、分解能、スキャン速度、汎用性の向上により、ますます厳格になっています。MSの進歩は、より高いタンパク質同定効率およびより正確な定量1,2,3,4,5に寄与する。改善されたMS機器により、研究者は、ワークフロー^{のすべての}段階で最小限の時間で高純度タンパク質を定量回収できる、それに対応して一貫したフロントエンドサンプル調製戦略を求めています6,7,8,9,10,11 .生物学的系のプロテオーム状態を正確に反映するには、タンパク質を効率的かつ偏りのない方法で天然のサンプルマトリックスから単離する必要があります。この目的のために、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性界面活性剤を含む、効率的なタンパク質抽出および可溶化¹²を保証する。しかし、SDSはエレクトロスプレーイオン化を強く妨害し、適切に排除しないと厳しいMS信号抑制を引き起こす¹³。

使い捨てスピンカートリッジ^14、15、¹⁶内に含まれる分子量カットオフフィルターを超えるタンパク質の保持など、その後のプロテオーム分析のために様々なSDS枯渇戦略が利用可能である。フィルター支援サンプル調製法(FASP)は、10ppm未満のSDSを効果的に枯渇させ、最適なMSを容易にするため、好まれています。しかし、FASPによるタンパク質回収は可変であり、これが他の技術の探求を促した。タンパク質(または界面活性剤)を選択的に捕捉するクロマトグラフィーアプローチは、様々な便利なカートリッジまたはビーズベースのフォーマットに進化してきた¹⁷、¹⁸、^19、20、21。タンパク質精製に対するこれらの単純で(理想的には)一貫した戦略を考えると、有機溶媒によるタンパク質沈殿の古典的なアプローチは、タンパク質単離への有望なアプローチとして見過ごされがちです。溶媒沈殿はSDSを臨界レベル以下に正常に枯渇させることが示されていますが、タンパク質回収はこのアプローチの長年の懸念事項でした。複数のグループがタンパク質回収バイアスを観察しており、タンパク質濃度、分子量、疎水性の関数として許容できないほど低い沈殿収率で^22,23。文献で報告された沈殿プロトコルの多様性のために、標準化された沈殿条件が開発された。2013年、Crowellらは、80%アセトン²⁴中のタンパク質の沈殿効率に対するイオン強度の依存性を最初に報告した。調べたすべてのタンパク質について、最大30mM塩化ナトリウムの添加は、収量を最大化する(最大100%回収)ために不可欠であることが示された。より最近では、Nickersonらは、アセトン沈殿中のさらに高いイオン強度(最大100mM)と高温(20°C)の組み合わせが、2〜5分²⁵分でほぼ定量的な回復をもたらすことを示した。低分子量(LMW)タンパク質の回収率のわずかな低下が観察された。したがって、Baghalabadiらによるその後の報告では、特定の塩、特に硫酸亜鉛をより高いレベルの有機溶媒(97%アセトン)と組み合わせることによって、LMWタンパク質およびペプチド(≤5kDa)の回収に成功したことが実証されました²⁶。

沈殿プロトコルを精製することで、MSベースのプロテオミクスのタンパク質精製戦略がより信頼性の高いものになりますが、従来の沈殿の成功はユーザーの技術に大きく依存しています。この研究の主な目的は、汚染上清からのタンパク質ペレットの単離を容易にする堅牢な沈殿戦略を提示することです。使い捨てろ過カートリッジは、多孔質PTFEメンブレン^{フィルター27}の上に凝集タンパク質を単離することによってピペッティングを排除するために開発された。上清中のMS干渉成分は、短時間の低速遠心分離工程で効果的に除去されます。使い捨てフィルターカートリッジは、交換可能なSPEカートリッジも提供しており、質量分析に先立って、再可溶化とオプションのタンパク質消化後の後続のサンプルクリーンアップを容易にします。

ここでは、修正アセトンおよびクロロホルム/メタノール/水²⁸ プロトコルを含む一連の推奨プロテオーム沈殿ワークフローを、従来の(バイアルベース)および使い捨ての2状態ろ過および抽出カートリッジの半自動形式で紹介します。得られたタンパク質回収率とSDS枯渇効率をボトムアップのLC-MS/MSプロテオームカバレッジとともに強調し、各プロトコルから期待される結果を実証します。各アプローチに関連する実用的な利点と欠点について説明します。

プロトコル

1. 材料に関する考慮事項とサンプルの事前準備

1. 高純度の溶媒(アセトン、クロロホルム、メタノール)(>99.5%)と化学薬品のみを使用し、余分な水分を含まない。
2. 水に塩化ナトリウムと硫酸亜鉛の溶液(1 M)を調製する。
   注:塩溶液は、汚染物質または微生物の増殖がない限り、室温で無期限に保存することができます。
3. 沈殿を誘導するために必要な量のサンプルと溶媒を保持するのに十分な最小のポリプロピレン(PP)微量遠心分離バイアルを使用してください。
4. 沈殿させるサンプル中のSDS濃度が2%(w/v)以下であることを確認します。SDSが高い場合は、サンプルを水で希釈します。
5. 最適な沈殿効率を得るために、0.01 ~ 10 g/L のタンパク質濃度を確保します。
   注:沈殿に最適な質量は、1〜100μgのタンパク質の範囲です。
6. 使用前に、すべての溶媒および溶液に粒子状物質がないことを確認してください。ろ過(<0.5 μm)または遠心分離工程(室温で10,000 x g で1分間)のいずれかを実行して、未溶解の微粒子を除去します。
7. ジスルフィド結合還元およびアルキル化が必要な場合は、タンパク質沈殿の前にこれらのステップを実施してください。過剰な還元試薬およびアルキル化試薬は、沈殿プロセスを通じて除去されるであろう。
8. プロトコールのいずれかを選択して実行することにより、タンパク質を沈殿させる(ステップ2、3、4、または5)。

2. アセトンによる迅速な(バイアルベースの)タンパク質沈殿

1. ピペット90 μLの(微粒子フリー)タンパク質またはプロテオーム溶液をPP微量遠心チューブに入れます。次いで、10 μLの1 MNaCl水溶液を加える。
   注:プロテオーム抽出物のイオン強度がすでに100mMを超える場合、追加の塩は必要ありません。
2. ピペット400 μLのアセトンをサンプルに含む。バイアルにキャップを付け、バイアルを静かにタップして溶媒を結合します。激しい混合は必要ありません。
   注:タンパク質、塩、およびアセトンの体積は、それぞれの相対比が維持されている限り、増加させることができる。
3. バイアルを室温で、乱されずに、最低2分間インキュベートする。
   注:低温でのインキュベーションを含むより長いインキュベーション(例えば、従来のアセトン沈殿は冷凍庫での一晩沈殿を使用する)は、より大きな(目に見える)凝集タンパク質微粒子の形成をもたらし(図1A)、一般に総タンパク質回収率を改善しない。
4. インキュベーション後、サンプルを遠心分離機に入れ、バイアルの向きに注意します。室温で10,000 x g 以上で最低2分間回転します。
5. バイアルのキャップを外し、バイアルをゆっくりと廃棄物容器に反転させて上清を静かにデカントします。反転したバイアルをペーパータオルにタッチして、バイアルから残留溶媒を引き出します。
   警告: 廃溶剤は、適切なプロトコルに従って保管し、廃棄してください。
6. SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。
   メモ: ステップ 2.6 はオプションです。
   1. 直ちにサンプルを遠心分離し(室温で10,000 x g 以上で1分間)、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れます。ステップ2.5で説明したように洗浄溶媒をデカントする。
7. キャップを開けたままサンプルを完全に乾燥させます(約1分)。バイアルを要約し、ペレット可溶化を進める(ステップ6)。

低分子量(LMW)ペプチド(ZnSO4+アセトン)の沈殿

1. 54 μL のプロテオーム抽出物を 2 mL の PP バイアルに分注し、次いで 6 μL の 1 M ZnSO₄ を加える。
   注:LMWペプチド(≤5kDa)の最適な回収率は、最終的に97体積%にアセトンを添加することによって得られる。2 mL PP バイアルを仮定すると、最大初期サンプル量は 54 μL です。
2. 1940 μLのアセトンを最終的な97容量%に加える。静かに渦巻いて混ぜ合わせ、ベンチトップに乱れずに最低2分間放置します。
3. 遠心分離機(室温で10,000 x g で1分間)し、バイアルを反転させて上清を除去し、次いでバイアルをペーパータオルに接触させた。
4. SDS含有サンプルの場合は、ペレットを乱さないように注意しながら、400μLの新鮮なアセトンを分注してください。
   メモ: ステップ 3.4 はオプションです。
   1. ステップ3.3に従ってサンプルを直ちに遠心分離し、バイアルを初期スピンと同じ向きでローターに入れる。ステップ3.3で説明したように洗浄溶媒をデカントする。
5. 得られた乾燥ペレットを、短時間のボルテックスまたは超音波処理(〜5分)で水性溶媒に再可溶化する。

4. クロロホルム/メタノール/水(CMW)によるタンパク質沈殿

1. 100 μLのタンパク質またはプロテオーム溶液をPPバイアルに分配します。400 μLのメタノールを加え、続いて100 μLのクロロホルムを加えます。バイアルと渦を短くキャップして混合します。
   注: CMW 沈殿の場合、底が狭い 1.5 mL バイアルが好まれます(図 2A)。
   警告: クロロホルム溶剤は、適切な換気フードで取り扱う必要があります。クロロホルムと接触するすべての溶媒は、廃棄時にハロゲン化廃棄物として処理する必要があります。
2. 300μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配する。バイアルにキャップを付けます。サンプルをベンチトップに1分間邪魔されずに座らせます。
   注:ソリューションはすぐに白く濁って表示されます。水を加えた後にバイアルを混ぜないでください。
3. PPバイアルを遠心分離機に入れ、最低5分間(室温で10,000 x g 以上)回転させます。
   注:遠心分離すると、2つの可視溶媒層が形成されます(上層=メタノール/水、下層=クロロホルム)。固体タンパク質ペレットは、溶媒界面で形成される(図2A)。
4. 大きな(1mL)マイクロピペットチップを使用して、バイアルを〜45°に保持し、上層から約700μLの溶媒を均一な速度で除去する。
5. より小さい(200 μL)マイクロピペットチップを使用して、〜45°傾けたバイアルから上部溶媒層を除去し続けます。ピペットは、上部溶媒層がバイアル内でビーズを形成するまで1回の連続運動で起こる。
6. 400 μLの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに加え、ペレットを乱すことなく、溶媒をバイアルの側面に分配することによって。
7. バイアルにキャップを付けます。バイアルを静かに揺らして溶媒層を結合し、溶媒を一緒に渦巻きます。
   注:ペレットを乱さないようにすることが不可欠です。バイアルを渦巻きにしないでください。
8. ローター内のバイアルの向きに注目して、最低10分間遠心分離機(室温で10,000 x g )します。タンパク質ペレットはバイアルの底に付着する(図2B)。
9. ペレットを下に向けてバイアルを45°傾けます。ピペットチップをバイアルの上端に沿って置き、1mLのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと連続した速度で除去する。バイアル中に約20μLの溶媒を保持する。
10. SDS含有サンプル用のタンパク質ペレットを、400μLの新鮮なメタノールをゆっくりと分配して洗浄する。バイアルを渦巻きにしないでください。
    1. 遠心分離(温度で2分間10,000 x g )を直接進め、バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れます。
11. ステップ4.9に従って溶媒を除去する。残留溶媒が蒸発するまで、サンプルを煙道で空気乾燥させます。
12. ステップ 6 で推奨されている再可溶化手順を参照してください。

5. 使い捨てろ過カートリッジを使用したタンパク質沈殿

注: ステップ 2 ~ 5 で説明する各溶媒ベースの沈殿プロトコルは、2 段階のろ過および抽出カートリッジで実行できます ( 材料表を参照)。

1. 上部のろ過カートリッジにプラグを取り付けた状態で(図3A)、以下の3つのオプションのいずれかで概説されているように、抽出されたプロテオーム、塩、および溶媒の所望の体積を分配します。
   1. (オプション1)アセトンによるタンパク質沈殿の場合は、90 μL のタンパク質またはプロテオーム溶液、10 μL の 1 M NaCl 水溶液、および 400 μL のアセトンを組み合わせてください。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。
      注:濃縮タンパク質サンプル(1 g/L)では、目に見える沈殿物が発生します(図3B)。
   2. (オプション2)LMW ペプチド沈殿の場合は、15 μL のサンプル、1.5 μL の 1 M ZnSO₄、および 485 μL のアセトンを組み合わせます。ベンチトップで最低2分間インキュベートします。
      注: 水性サンプル中の塩濃度が 90 mM であっても、ステップ 3 で推奨されている 100 mM と比較して回復率には影響しません。
   3. (オプション3)CMW 沈殿の場合は、プロテオーム抽出物 50 μL、メタノール 200 μL、クロロホルム 50 μL を追加します。バイアルをキャップし、簡単に渦を合わせます。
      1. 150μLの水をバイアルの中央に直接素早く分配します。ベンチトップで1分間インキュベートします。
2. プラグをろ過カートリッジに取り付けたまま、室温で2,500 x g で2分間遠心分離します。
3. カートリッジを反転させ、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。
4. ろ過カートリッジを清潔なバイアルに入れ、遠心分離機に戻します。室温で500 x g で3分間スピンします。フロースルー溶媒を下部バイアルから廃棄する。
   メモ: 上部のろ過カートリッジに溶媒が残っている場合は、遠心分離機に戻り、さらにスピンを実行します。
5. ろ過カートリッジに 400 μL のアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄します (CMW 沈殿の場合、ステップ 5.1.3、メタノール 400 μL を追加します)。
6. 室温で500 x g で3分間、または上部カートリッジに溶媒が残らなくなるまで遠心分離します。
7. ステップ6で説明したように沈殿ペレットを再可溶化する。

6. タンパク質ペレットの再可溶化

1. 以下に記載する再可溶化プロトコールの直前に2〜5μLのイソプロパノールを膜に直接分配することによって、濾過カートリッジの基部にある膜を濡らす。
2. 以下のいずれかの再可溶化方法に従う。
   1. (オプション1)≥2% SDSを含む水性緩衝液を少なくとも20μLをろ過カートリッジに加えます。キャップと渦を激しく(〜1分)。あるいは、超音波処理(>10分)してタンパク質ペレットを分散させる。
      1. 試料を95°Cで5分間加熱する)。加熱後に混合工程を繰り返す。
         注:Laemmliゲルローディングバッファーは、タンパク質ペレットを再可溶化することができます。しかしながら、SDS含有試料は、トリプシン消化および逆相LCおよびMSと互換性がない。
   2. (オプション2)水中に80%(v / v)ギ酸の溶液を調製する。酸溶液(-20°C)、並びに沈殿したタンパク質を含む濾過カートリッジをプレチルする。
      1. 50μLの冷たいギ酸をカートリッジに分注する。キャップと渦を30秒間。冷凍庫(-20°C)に10分間戻します。
      2. カートリッジをもう一度 30 秒間押し込みます。その後、冷却混合サイクルをもう1回繰り返す(10分、-20°C、30秒ボルテックス)。
      3. 最後の500μLに水を加え、ギ酸を8%に希釈する。
         注:コールドギ酸プロトコルは、その後のトリプシン消化と互換性がありませんが、LC-MSと互換性があります。
   3. (オプション3)50 μLの新しく調製した8 M尿素を水中でろ過カートリッジに加えます。30分間超音波処理する。
      1. カートリッジをベンチトップで1時間(一晩まで)インキュベートします。
      2. 8 M尿素を水または適切な緩衝液で最低5倍に希釈する。
         注:一度希釈されると、尿素可溶化プロトコルは、その後のトリプシン消化およびLC-MSと互換性があります。

7. タンパク質消化

1. ボトムアップMS分析のために、以下に述べる2つの方法のうちの1つを用いて、再可溶化タンパク質を酵素消化に供する。
   1. (オプション1)ギ酸再可溶化の場合は、ステップ6.2.2.1で80%ギ酸の初期容量を25 μLに減らします。ステップ6.2.2.3では、375μLの水を使用してギ酸を5%(v/v)に希釈します。
   2. ペプシンをタンパク質と酵素のおおよその比率50:1でカートリッジに分配します。ろ過カートリッジにプラグを取り付けて、サンプルを室温で一晩インキュベートします。
2. (オプション2)尿素中での再可溶化のために、ステップ6.2.3.2で100mMのトリスまたは炭酸水素アンモニウムを含有させて、8〜8.3の間のpHを確保する。
   1. トリプシンをおおよそのタンパク質対酵素質量比50:1で加える。プラグをカートリッジに取り付けて、サンプルを37°Cの温水浴中で一晩インキュベートする。
   2. 溶液を10%TFAで酸性化して消化を最終1%まで終了させる。
3. フィルターのベースからプラグを取り外し、清潔なバイアル(2分、5000 x g、室温)に含まれるカートリッジを遠心分離して、ペプシンまたはトリプシン消化タンパク質を回収します。

8. SPE クリーンアップ

注: 消化または溶媒交換後の追加のサンプル脱塩の場合、サンプルは説明されているように逆相クリーンアップの対象となる可能性があります。

1. SPEカートリッジ(材料表を参照)を300 μLのメタノール(2分、400 x g)に、続いて300 μLの5%アセトニトリル/0.1%のTFA(2分、400 x g)を通してプライムします。
2. プライミングされたSPEカートリッジを、再可溶化または消化されたタンパク質を含む濾過カートリッジのベースに接続します。
3. SPEカートリッジを通してタンパク質を回転させます(5分、室温で800 x g )。上部のカートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻してスピンを繰り返します。
   メモ: サンプルを SPE カートリッジに 2 度目に通すと、回復率が向上する場合があります。
4. 300 μL の 5% アセトニトリル/0.1% の TFA を水に浸してカートリッジに加えます。洗浄するには、SPEカートリッジ(2分、2000 x g)を流します。フロースルーを破棄します。
5. LMWタンパク質または消化ペプチドの場合は、50%アセトニトリル/0.1%TFA(5分、2500 x g)を300μL流してサンプルを溶出します。
6. インタクトなタンパク質の場合は、ステップ8.5に従い、300 μL の 75% アセトニトリル/0.1% TFA を使用した追加の溶出ステップを実行します。得られた 2 つの抽出物を結合します。
   メモ: ステップ 8.6 はオプションです。

結果

図4 は、アセトンを用いた使い捨てフィルターカートリッジ中のタンパク質のバイアルベースまたはカートリッジ促進沈殿に続く予想されるSDS枯渇を要約する。アセトン中での従来の一晩インキュベーション(−20°C)は、室温での迅速なアセトン沈殿プロトコル(ステップ2)、ならびにCMW沈殿(ステップ4)と比較される。残留SDSは、メチレンブルー活性物質(MBAS)アッセイ²⁹によって定量した。簡単に説明すると、100 μLサンプルを100 μLのMBAS試薬(250 mgメチレンブルー、50 g硫酸ナトリウム、10 mL硫酸、水で1.0 Lに希釈)と組み合わせ、続いて400 μLのクロロホルムを添加し、UV/Vis分光光度計で651 nmの有機層の吸光度を測定しました。すべてのアプローチは、最適なMS分析を可能にするためにSDSを削減します。

定量的かつ再現性のあるタンパク質回収は、処理された酵母全細胞溶解物のSDS PAGE分析を通じて 図5...

ディスカッション

最適なMS特性評価は、残留SDSが10ppm未満で枯渇すると達成されます。FASPやビーズ上消化などの代替アプローチは、可変回収率31、^32、33で定量的なSDS枯渇を提供します^が、沈殿の主な目的は純度と収率を同時に最大化することです。これは、タンパク質ペレットを乱すことなく上清(SDSを含む)を効果的に単離することに依存する。バイアルベースの沈殿では、上清の大部分がピペッティングによって除去されると、凝集したペレットの一部が誤って失われる可能性がますます高まります。このため、残留溶媒のより有意な画分(〜20μL)を残し、洗浄工程³⁴を追加することが不可欠である。洗浄工程では、バイアルから残留溶媒を希釈して除去します。特にCMWでは、ペレットが形成されると試料バイアルを渦巻く必要がない。激しい攪拌によってペレットを破壊すると、偶発的なピペッティングによる損失の可能性を高めるという望ましくない効果があります...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセトン	フィッシャー・サイエンティフィック	AC177170010	≤0.002%アルデヒド
アセトニトリル	フィッシャー・サイエンティフィック	A998-4	HPLCグレード
炭酸水素アンモニウム	ミリポール・シグマ	A6141-1KG	しっかりした
ベータ・メルカプトエタノール	ミリポール・シグマ	M3148-25ML	分子生物学グレード
ブロモフェノールブルー	ミリポール・シグマ	B8026-5G	ブロモフェノール青ナトリウム塩
クロロホルム	フィッシャー・サイエンティフィック	C298-400	クロロホルム
蟻酸	ハネウェル	56302	LC-MS用の溶出添加剤
融合ルーモス質量分析計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック		標準タンパク質混合物の分析用
グリセロール	ミリポール・シグマ	356352-1L-M	分子生物学では、99%>
イソプロパノール	フィッシャー・サイエンティフィック	A4641	HPLCグレード
メタノール	フィッシャー・サイエンティフィック	A452SK-4	HPLCグレード
マイクロ遠心分離機	フィッシャー・サイエンティフィック	75-400-102	最大21,000 xg
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)	フィッシャー・サイエンティフィック	05-408-130	テーパードボトム
マイクロ遠心分離機チューブ        (2 mL)	フィッシャー・サイエンティフィック	02-681-321	丸みを帯びた底
マイクロピペットのヒント        (0.1-10 & mu;L)	フィッシャー・サイエンティフィック	21-197-28	ユニバーサルピペットチップ、非滅菌
マイクロピペットのヒント        (1-200 & mu;L)	フィッシャー・サイエンティフィック	07-200-302	ユニバーサルピペットチップ、非滅菌
マイクロピペットのヒント       (200-1000 & mu;L)	フィッシャー・サイエンティフィック	07-200-303	ユニバーサルピペットチップ、非滅菌
マイクロピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	13-710-903	マイクロピペット・トリオパック
ペプシン	ミリポール・シグマ	P0525000	凍乾粉末、および         >3200単位/mg
プロトラップXG	プロテオフォーム・サイエンティフィック	PXG-0002	1箱あたり50個の完全なユニット
塩化ナトリウム	ミリポール・シグマ	S9888-1KG	ACS試薬、>99%
ドデシル硫酸ナトリウム	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	28312	粉末状固体
timsTOFプロ質量分析計	ブルーカー		肝臓プロテオーム抽出物の解析
トリフルオロ酢酸	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	L06374。AP	99%
トリス	フィッシャー・サイエンティフィック	BP152-500	分子生物学グレード
トリプシン	ミリポール・シグマ	9002-07-7	牛の膵臓から、TPCK処理済み
尿素	バイオ・ラッド	1610731	しっかりした
水(脱イオン化)	サトリウス・アリウム ミニ水質浄化システム	76307-662	タイプ1ウルトラピュア(18.2 MΩ cm)
硫酸亜鉛	ミリポール・シグマ	307491-100G	しっかりした