このプロトコルは、インビトロで14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。
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この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。
以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。
概要
真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD+)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 - 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する - は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。
代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされる1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します2。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果3として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者6と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。
骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている7。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している10。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。
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プロトコル
放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前の承認が必要です。このプロトコルで使用されるRAMは、ペンシルベニア大学のEnvironmental Health & Radiation Safety(EHRS)によって承認されています。動物の使用には、在宅施設の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前の承認が必要です。以下の研究は、フィラデルフィア小児病院でIACUCによって承認された。
1. 14種類のC標識基質用原液の調製
- 11 gのBSAと33.1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を混合し、BSAが完全に溶解するまで室温で約3時間穏やかに振とうすることにより、4 mMのウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液を作ります。使用前にBSA原液を70°Cの水浴中で温めてください。
- バイアル瓶内の50μCi 14C-オレイン酸塩(エタノール中50μCi/μmol)を空気乾燥し、指定されたRAM作業フードで蓋を8時間外します。312.5 μLのH2Oを加え、次に3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加える。徹底的に混ぜる。
- 得られた溶液を水浴中で70°Cに加温する。予温したBSA原液0.9375mLを加えて、10mMの熱いオレイン酸原液(非標識オレイン酸塩に対する1:11.5の比 の14C-オレイン酸を含む)を得た。原液をアリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存する。
- 解凍直後に14 C-グルコースと14C-グルタミンを使用してください。
14C標識基質を含む培地の調製
注:媒体中のエネルギー基質の信頼できる濃度を確保するために、カスタムメイドの媒体は、使用直前に新鮮な基質を添加して使用する必要があります。ここでは、グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールレッド、または炭酸水素ナトリウムを含まないカスタムメイドの最小必須培地(MEMα)が使用される。しかしながら、最適な培地は、細胞タイプごとに決定されるべきである。
- 培地粉末8.67gを精製水1Lで再構成する。2.2gの炭酸水素ナトリウムを加えてpH7.4を達成し、0.22μm真空濾過を用いて溶液を濾過する。
- 新鮮な成分を加えて、最終濃度5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸、および10%ウシ胎児血清(FBS)を含む完全培地(cMEMα)を得た。さらに、cMEMαに100 mM L-カルニチンと10 μM HEPESを補給して脂肪酸酸化を促進します。
- 使用直前に、新しく調製したcMEMαに 14個のC標識基質を加えてホットメディアを作ります。オレイン酸ホット培地を作るには、10 mMホットオレイン酸ストック溶液をcMEMαに添加し、終濃度100 μMのオレイン酸塩(1:100希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)にします。
注:1:11.5のホット:コールドオレイン酸塩の比率を含む10mMのホットオレイン酸塩ストック(ステップ1.3を参照)は、放射性物質の量を最小限に抑えながら、媒体中の100μMの総オレイン酸塩の生理学的レベルを達成するために使用されます。 - 70°Cのウォーターバス中で2mLのH2Oに24.36mgのオレイン酸ナトリウムを加えて10mMの非標識オレイン酸ストックを作り、完全に溶解するまで約20分間、70°Cに予温した6mLの4mM BSAストックと素早く混合する。 37°Cの水浴に1時間移し、0.22μmのフィルターでろ過します。アリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存してください。
- グルコースを高温培地にするには、終濃度1.333 μM(1:4,125希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)に 14C-グルコースを加えます。グルタミンを高温培地にするには、 14C-グルタミンを終濃度2μM(1:1,000希釈、最終放射能0.4μCi/mL)まで加える。
- グルコースおよびグルタミン高温培地に、ステップ2.4からの非標識オレイン酸塩の10 mMストック溶液を補充し、オレイン酸ホット培地と同じ100μMオレイン酸塩の最終濃度を達成する。
3. 細胞の作製
注:歯槽骨前芽細胞および骨髄マクロファージがここで例として使用されている。ユーザーは、適切なプロトコルに従って選択した細胞タイプを準備する必要があります。酵素活性が異なるロット間で異なる可能性があるため、パイロット実験で消化に使用するコラゲナーゼIIの濃度を最適化します。
- 頭蓋骨前骨芽細胞の単離と培養
- 出生後3-5日目(P3-5)の仔犬を断頭して犠牲にし、ペニシリン - ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷DPBSに移す。
- 皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。DPBSで周囲の組織を後ろから前へ切り取って中央領域を収集します(図1A)。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。
- DPBS中のコラゲナーゼII型2mg/mLおよび4mg/mL溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22μmフィルターで濾過する。洗浄した頭蓋骨をまず2mg/mLのコラゲナーゼ溶液で15分間消化し、消化液を捨てる。洗浄したサンプルを4mg/mLのコラゲナーゼ溶液で3回、15分間消化し、消化液をプールして保存します。
- 消化液を70 μmのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300 × g
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結果
この例では、CO2 トラップ法を使用して、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化と、それぞれ in vitro 骨芽細胞または破骨細胞分化に頻繁に使用されるBMMを比較する。初代細胞を継代し、cMEMα中で一晩培養した後、それらは典型的にはコンフルエントの80〜90%に達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも顕著に大きい(図2)。各細胞型は、ステップ4.1〜4.7に従ってグルコース、グルタミン、およびオレイン酸塩の酸化アッセイに供される。結果は、Eq(1)を用いて分析される。
結果は、各基質の酸化速度がBMMよりも頭蓋骨前骨芽細胞において有意に高く、骨前芽細胞におけるOXPHOSによるより大きなエネルギー産生を示す可能性が高いことを示している(図3)。タツノオトシゴ技術を用いた以前の研究では、OXPHOSが骨芽細胞前部ではATP産生の約60%を占めるが、好気性解糖系がエネル...
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ディスカッション
このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無傷のミトコンドリアを含む組織外植体または組織ホモジネートに対して容易に適合させることができる17。
このプロトコルで考慮すべきいくつかの重要なステップには、試薬の調製および14CO2トラップ用のチューブのセットアップが含まれる。オレイン酸塩からBSAへの適切な結合を確実にすることは、遊離脂肪酸(FFA)が細胞膜を損傷するのを防ぎ、代謝のための細胞による効率的な取り込みを可能にするために極めて重要である。BSA溶液を完...
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開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
この作業は、NIH助成金R01 AR060456(FL)によって部分的に支援されました。マイケル・ロビンソン博士とエリザベス・クリズマン博士(フィラデルフィア小児病院)がシンチレーションカウンターを惜しみなく助けてくれたことに感謝します。
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材料
14
培養媒体の準備のための長い骨から骨髄を洗い流すのに使用されて 熱い媒体<を作るのに使用 熱いmediaC-oleate PerkinElmerレ シンします します
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 以上mフィルター | シグマ・アルドリッチ | SLGVM33RS | BSA溶液のろ過に使用 |
| 0.25% トリプシン-EDTA | ギブコ | 25200056 | 細胞培養プレートから細胞を解離 |
| 1.5mL エッペンドルフチューブ | PR1MA | PR MCT17 RB | 反応インキュベーションに使用 |
| 10cmプレート | TPP | 93100 | 細胞培養に使用 |
| 10mLシリンジ | BD | 302995 | 細胞 |
| 14C-グルコース | PerkinElmer | のNEC042X050UC | |
| 10% FBS | アトランタの生物製剤 | S11550 | |
| >sup14C-グルタミン | PerkinElmer | NEC451050UC | を作るのに使用 |
| NEC317050UC | ホットメディアを作るために使用 | ||
| 23 G ニードル | BD | 305120 | 長骨から骨髄を洗い流すために使用 |
| 24 ウェルプレート | TPP | 92024 | 細胞培養に使用 |
| 70 μm細胞ストレーナー | MIDSCI | 70CELL | キャヴァリアル消化中に上清をろ過するために使用される |
| アクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化物(AO/PI)色素 | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | 生細胞を染色して種子密度を決定する |
| 牛血清アブミン | Proliant Biologicals | 68700 | 脂肪酸抱合に使用 |
| セロメーター オート2000 | Nexcelom Biosciences | 生細胞の数を決定 | |
| 遠心分離機 | サーモフィッシャー | ジェンドマイクロ21R | 細胞のペレット化に使用 |
| コラゲナーゼII型 | ワーシントン | LS004176 | 組織から細胞を解離させる |
| カスタムMEM α | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | カスタムホットメディアの作成に使用 |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 | Gibco | 10010023 | 試薬の溶解と希釈、および培養皿の洗浄に使用 |
| フィルターペーパー | ミリポアシグマ | WHA1001090 | トラップ CO2 with sa sodium hydroxide |
| グルコース | Sigma-Aldrich | g7528 | カスタム培地の作成に使用 |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 細胞培養中に |
| L-カルニチン | Sigma-Aldrich | C0283 | 脂肪酸酸化のために補充 |
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | g3126 | カスタム培地の製造に使用 |
| MEM α | Thermo | A10490 | 細胞培養培地 |
| パラフィルム | Pecheney プラスチック包装 | PM998 | 細胞培養皿のシールに使用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャー | 15140122 | 細胞培養の汚染を防止 |
| 過塩素酸 | Sigma-Aldrich | 244252 | 代謝アッセイ中にCO2を放出 |
| ピルビン酸 | Sigma-Aldrich | p5280 | カスタムメディアを作るために使用 |
| シンチレーションカウンター | ベックマン・コールター | LS6500 | 濾紙から放射能を測定 |
| チレーション液 | MP Biomedicals | 882453 | RAMから放出されたエネルギーを吸収し、光の閃光として再放出 |
| シンチレーションバイアル | フィッシャーサイエンティフィック | 03-337-1 | シンチレーション流体用反応容器 |
| 炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S5761 | 中型水酸化ナトリウム用バランスバッファー |
| Sigma-Aldrich | 58045 | メタボイルクアッセイ中にCO2をトラップ | |
| オレイン酸ナトリウム | サンタクルス | SC-215879 | BSA 共役脂肪酸製剤 |
| 真空ろ過 1000 | TPP | 99950 | フィルター cMEMα |
参考文献
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