肝組織の3D細胞培養モデルにおけるヒストン翻訳後修飾のグローバルレベルの定量化

Summary

このプロトコルは、3次元細胞培養システムを使用して、ほぼ生理学的状態のクロマチン修飾をモデル化、処理、および分析する方法を概説しています。

Abstract

哺乳動物細胞の扁平培養は、細胞生理機能を理解するために広く使用されている インビトロ アプローチであるが、このシステムは、不自然に速い細胞複製のために固体組織のモデリングにおいて制限されている。これは、高速複製細胞がDNA複製に頻繁に関与し、不均一な倍数体集団を有するため、成熟クロマチンをモデル化する場合に特に困難である。以下に、3次元(3D)細胞培養システムを使用して静止クロマチン修飾をモデル化、処理、および分析するためのワークフローを示します。このプロトコールを使用して、肝細胞癌細胞株は、活発な栄養拡散および低い剪断力を提供するインキュベーター内で再現性のある3Dスフェロイドとして増殖される。酪酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムによる処理は、それぞれヒストンアセチル化およびスクシニル化の増加を誘導した。ヒストンアセチル化およびスクシニル化のレベルの増加は、より開放的なクロマチン状態と関連している。次いで、スフェロイドを回収して細胞核を単離し、そこからヒストンタンパク質を抽出し、翻訳後修飾を分析する。ヒストン分析は、タンデム質量分析とオンラインで結合された液体クロマトグラフィー を介して 実行され、その後に社内の計算パイプラインが続きます。最後に、組み合わせヒストンマークの頻度および出現を調査するためのデータ表現の例が示されている。

Introduction

19^世紀後半以来、細胞培養システムは、人体外の細胞の成長と発達を研究するためのモデルとして使用されてきました^1,2。それらの使用はまた、組織および器官が健康な状況および罹患した文脈の両方でどのように機能するかを研究するために拡張されている^1,3。浮遊細胞(例えば、血液細胞)は、インビボで三次元(3D)構造で集合しないので、ペトリ皿またはフラスコ中でシームレスかつ交換的に増殖する。固体器官に由来する細胞は、二次元(2D)または3D培養系のいずれかで増殖することができる。2D培養では、細胞は平坦な表面^2,4に接着する単層で増殖する。2D細胞培養システムは、指数関数的な増殖および速い倍加時間(典型的には24時間〜数日⁵)によって特徴付けられる。3Dシステム内の細胞は、組織のようなコングロマリットをより密接にモデル化する複雑な細胞間相互作用を形成するように成長し、倍加時間が1ヶ月以上に達することができる動的平衡に達する能力によって特徴付けられる⁵。

この論文では、低重力をシミュレートする回転細胞培養システムで3Dスフェロイドを増殖させる革新的な方法論^{を紹介します6}。これは、1990年代にNASAによって導入された細胞培養システムの単純化された派生物です⁷。このアプローチは、スピニングフラスコのような既存の方法で発生するせん断力を最小限に抑え、回転楕円体の再現性を高めます⁶。さらに、回転バイオリアクターは活性栄養素拡散を増加させ、培地交換が実用的でない吊り下げドロップ細胞培養のようなシステムで起こる壊死形成を最小限に抑える⁶。このようにして、細胞はほとんど乱れずに成長し、組織内で増殖する細胞に関連する構造的および生理学的特性の形成を可能にする。このようにして培養されたC3A肝細胞(HepG2/C3A)は、超構造細胞小器官を有するだけでなく、インビボで観察されたレベルに匹敵する量のATP、アデニル酸キナーゼ、尿素、およびコレステロールも産生した^1,2。加えて、2D対.3D細胞培養系で増殖した細胞は、異なる遺伝子発現パターン^を示す8。3Dスフェロイドとして増殖したC3A肝細胞の遺伝子発現解析は、これらの細胞が広範囲の肝臓特異的タンパク質、ならびに肝機能を調節する重要な経路に関与する遺伝子を発現することを示した⁸。以前の出版物は、2D培養における指数関数的に増殖する細胞のプロテオームと、3Dスフェロイド培養における動的平衡状態の細胞との間の違いを実証した⁵。これらの違いには、細胞代謝が含まれ、これは今度は細胞⁵の構造、機能、および生理機能に影響を及ぼす。2D培養で増殖した細胞のプロテオームは、細胞複製に関与するタンパク質がより豊富であったが、3Dスフェロイドのプロテオームは肝機能においてより豊富であった⁵。

3Dスフェロイドとして増殖した細胞の複製速度が遅いほど、クロマチン状態および修飾に関連する特定の現象(例えば、ヒストンクリッピング⁹)がより正確にモデル化される。ヒストンクリッピングは、ヒストンN末端尾部の一部のタンパク質分解的切断を引き起こす不可逆的なヒストン翻訳後修飾(PTM)である。その生物学的機能はまだ議論中である^10,11,12,13が、初代細胞および肝臓組織におけるその存在は、スフェロイドとして増殖させたHepG2/C3A細胞によってモデル化されるが、平坦な細胞としてはモデル化されていないことは明らかである⁹。クロマチンの状態と修飾は、主に遺伝子へのアクセス可能性、ひいては遺伝子の発現を調節することによってDNAの読み出しを調節するため、これは非常に重要です¹⁴。ヒストンPTMは、ヒストンが組み立てられるヌクレオソームの正味電荷に影響を与えることによってクロマチン状態に直接影響を及ぼすか、またはクロマチンを作家、読者、および消しゴム¹⁴に募集することによって間接的に影響する。現在までに数百のヒストンPTMが同定されており¹⁵、クロマチンが^DNA16を解釈するために細胞によって使用される「ヒストンコード」を宿主とする仮説を補強している。しかしながら、無数のPTMの組み合わせ¹⁵の同定、およびヒストンPTMの組み合わせが、孤立して存在するPTMとは異なる生物学的機能をしばしば有するという発見(例えば、Fischle、et ^al.17)は、「ヒストンコード」を解読するためにより多くの作業が必要であることを強調する。

現在、ヒストンPTM分析は、抗体を利用する技術(例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、またはクロマチン免疫沈降に続いてシーケンシング[ChIP-seq])または質量分析(MS)のいずれかに基づいている。抗体ベースの技術は高感度であり、ヒストンマークのゲノムワイド局在化に関する詳細な情報を提供することができるが、まれなPTMまたは組み合わせに存在するPTMを研究する際にはしばしば制限される¹⁸、^19、20。MSは、単一および共存するタンパク質修飾、特にヒストンタンパク質¹⁸、¹⁹、²⁰のハイスループットかつ偏りのない同定および定量により適している。これらの理由から、この研究所と他のいくつかの研究所は、ヒストンペプチド(ボトムアップMS)、無傷のヒストンテール(ミドルダウンMS)、および全長ヒストンタンパク質(トップダウンMS)の分析のためにMSパイプラインを最適化しました^21,22,23。

以下に詳述するのは、HepG2/C3Aスフェロイドを増殖させ、タンデム質量分析(nLC-MS/MS)とオンラインで組み合わせたナノ液体クロマトグラフィーによるヒストンペプチド分析(ボトムアップMS)の準備ワークフローです。2D細胞培養物を増殖させ、細胞を回収し、バイオリアクターに移し、そこでスフェロイドを形成し始める(図1)。培養の18日後、スフェロイドを酪酸ナトリウムまたはコハク酸ナトリウムで処理して、ヒストンアセチル化およびスクシニル化の相対的存在量を増加させた。特に、3D培養物は、遺伝子毒性化合物およびそれらの平坦な培養物と同等の化合物で処理することができる。実際、最近の出版物は、3D培養における細胞の毒物学的応答が、2D平坦培養におけるものよりも初代組織に類似していることを強調している^24,25。次いで、指定された時点で細胞を回収し、核単離を行った。次いで、ヒストンを抽出し、ガルシアらによって最初に開発されたプロトコールに従ってトリプシン消化の前後に無水プロピオン酸で誘導体^化した。この手順により、逆相クロマトグラフィー(_C18)によるオンライン分離およびMSによる検出に適したサイズのペプチドが生成されます。最後に、ヒストンペプチドを同定および定量し、生成されたデータを、より完全な生物学的解釈のために複数の方法で表した。

Protocol

1. 緩衝液および試薬の調製

1. 細胞増殖培地(HepG2/C3A細胞の場合):ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、4.5g/Lグルコースを含む)にウシ胎児血清(FBS)(10%v/v)、非必須アミノ酸(1%v/v)、L-グルタミンサプリメント(1%v/v)およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%v/v)を加える。増殖培地は、4°Cで最大2週間保存される。
2. 200 mM 酪酸ナトリウム (NaBut) 溶液: 10 mL を調製するために、220.18 mg の NaBut を 10 mL の ddH₂O. ストア 1 mL アリコートに再懸濁し、-20 °C で 1 mL のアリコートを保存します。 細胞処理の前に、0.45 mmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過し、ろ過した溶液1 mLを9 mLの細胞増殖培地に添加して、作業濃度20 mMにします。
3. 100 mM コハク酸ナトリウム (NaSuc) 溶液: 10 mL を調製するために、162.05 mg の NaSuc を 10 mL の ddH₂O. に再懸濁し、-20 °C で 1 mL アリコートを保存します。 細胞処理の前に、0.45 mmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過し、ろ過した溶液1 mLを9 mLの細胞増殖培地に添加して、作業濃度10 mMにします。
4. 冷0.2 M_H2SO4:1 Lを調製するために、10 mLの濃縮_H2SO4を990 mLのHPLCグレードの水に加える。 4°Cで保存してください。
5. 冷たいアセトン + 0.1% 塩酸 (HCl): アセトンに濃縮 HCl (0.1% v/v) を追加します。4°Cで保存してください。
6. 100 mM_NH4HCO3溶液、pH 8.0:1 Lを調製し、7.91 gのNH_4HCO3を1 LのHPLCグレードの水に再懸濁する。50 mL アリコートを -20 °C で保存します。
7. 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)溶液:濃縮TFA(0.1% v/v)をHPLCグレードの水に加えます。4°Cで保存してください。
8. 60%アセトニトリル/0.1%TFA溶液:HPLCグレードのアセトニトリル(60% v/v)をHPLCグレードの水に加えます。次いで、濃縮TFA(0.1% v/v)をこの溶液に加える。4°Cで保存してください。
9. 2% HPLCグレードのアセトニトリル + 0.1%ギ酸:HPLCグレードのアセトニトリル(2% v/v)をHPLCグレードの水に加えます。次いで、濃縮ギ酸(0.1% v/v)をこの溶液に加える。
10. 80% HPLC グレードのアセトニトリル + 0.1% ギ酸: HPLC グレードのアセトニトリル (80% v/v) を HPLC グレードの水に加えます。次いで、濃縮ギ酸(0.1% v/v)をこの溶液に加える。

2. 3D培養システムの構築

注:初代または不死化の細胞が異なると、異なる培養特性を有するため、スフェロイドの形成は細胞タイプによって異なる可能性がある。このプロトコルは、バイオリアクターと革新的な3D細胞培養システムを使用したHepG2 / C3Aスフェロイド形成のために確立されています。

1. 標準的な増殖培地を用いて、細胞が80%コンフルエントになるまで単層として増殖させる。
2. 細胞をHBSS(75 cm 2フラスコの場合は5 mL)で洗浄し、HBSSで希釈した5 mLの0.05%トリプシン-EDTA(1:²希釈)で細胞を5%_CO2で37 ^oCで5分間インキュベートします。
3. 顕微鏡下で細胞剥離を確認し、3mLのウシ胎児血清(FBS)または増殖培地(5%〜10%FBSを含む)を加えてトリプシンを中和する。
4. 細胞数をカウントし、細胞懸濁液を希釈して、最大容量1.5mLで1 x¹⁰⁶ 個の細胞を得た。
5. 超低付着24ウェル丸底プレート(ウェルあたり複数のマイクロウェルを含む)を0.5mLの成長培地でウェルを洗浄することによって平衡化する。プレートを 3,000 x g で 5 分間遠心分離し、ウェルの表面から気泡を除去します。
6. 細胞懸濁液をプレートに移し、120 x gで3分間遠心分離 する。
7. プレートを37 ^°Cで24時間インキュベートし、回転楕円体形成のために5%_CO2 とインキュベートする。一方、湿度チャンバーを25mLの滅菌水で満たし、細胞チャンバーを9mLの成長培地で満たすことによってバイオリアクターを平衡化する。
8. バイオリアクターを、クリノスタットインキュベーター内で回転させ、5%CO2で ^37oCで₂₄時間インキュベートする。

3. バイオリアクターにおけるスフェロイドの成長

注記: 回転楕円体の構造を保持するために、3D 構造の処理にはワイドボアチップが使用されます。

1. 1mL幅のボアチップで優しく上下にピすることにより、スフェロイドを超低付着プレートから切り離し、組織培養処理皿に移す。
2. 予め加温した成長培地0.5mLでプレートを洗浄し、同じ皿に移す。
3. 顕微鏡でスフェロイドの品質を評価し、十分に形成されたスフェロイドを選択します。良質の回転楕円体は、均一なサイズ、コンパクトさ、および真円度を有する。
4. スフェロイドを、5mLの新鮮な成長培地で満たされた平衡化バイオリアクターに移す。スフェロイドを移した後、バイオリアクターを新鮮な成長媒体で完全に充填する。
5. バイオリアクターをクリノスタットインキュベーターに入れ、回転数を10〜11rpmに調整する。
6. 10 mLの古い培地を除去し、10 mLの新鮮な培地と交換することによって、2〜3日ごとに成長培地を交換する。
7. 回転楕円体の成長に応じて回転速度を調整し、回転楕円体のサイズと数が増えるにつれて増加します。
8. 培養で18日後、スフェロイドは治療および/または収集の準備ができています

4. 回転楕円体の治療と収集

注:このプロトコルでは、HepG2/C3Aスフェロイドを酪酸ナトリウム(NaBut)およびコハク酸ナトリウム(NaSuc)で処理し、アセチル化およびスクシニル化を含むヒストンマークのレベルをそれぞれ評価する。

1. 化合物の適切な作業濃度(例えば、20mMのNaButまたは10mM NaSuc)で成長培地を調製する。バイオリアクター内の培地を処理された培地と交換する。
   注:対照条件を確立するには、処理を追加する前に実験のために十分なスフェロイドを収集するか、未処理のスフェロイド用のバイオリアクターを指定します。
2. 十分な処理時間(例えば、NaSuc治療の場合は48〜1週間、NaBut治療の場合は48〜72時間)の後にプロテオミクス分析のためにスフェロイドを収集します。
   注:このプロトコルを使用したヒストン抽出のために、約1 x 106個の細胞を含む^6〜8個の スフェロイドを採取した。
   1. 上部ポートを通ってバイオリアクターから3〜5mLの培地を除去する。
   2. 前面ポートを開き、幅 1 mL のボアチップを使用して回転楕円体を除去し、微量遠心チューブに入れます。
   3. 回転楕円体を100 x g で5分間遠心分離し、媒体を廃棄する。
      注:バイオリアクター内の培地は変更することができ、バイオリアクターは追加の処理時間または回収のためにインキュベーターに戻すことができる。
   4. スフェロイドを200 μLのHBSSで洗浄し、FBSを除去します。100 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
      注: 回転楕円体は、処理まで -80 ^oC で保存できます。

5. ヒストン抽出

注:ヒストン中に存在する多くの塩基性アミノ酸残基は、リン酸骨格を有するDNAと密接に相互作用することを可能にする。ヒストンは核内の最も塩基性の高いタンパク質の一部であるため、氷冷硫酸(0.2M_H2SO4)で抽出すると汚染が最小限に抑えられます。非ヒストンタンパク質は強酸中で沈殿する。終濃度33%に希釈された高濃度トリクロロ酢酸(TCA)は、硫酸からヒストンを沈殿させるために後に使用される。ヒストン抽出全体のために、すべてのサンプル、チューブ、および試薬を氷上に保管してください。

1. 5 倍量 (約 100 μL) の冷たい 0.2 M H₂SO₄ を細胞ペレット (約 10 ~ 20 μL) に加え、ピペットを上下させてペレットを破砕し、ヒストンを放出します。
2. チューブを一定の回転で最大4時間、または4 ^°Cで振とうしてインキュベートする。
   注: 500 μL を超える容量の再懸濁サンプルの場合、ヒストンを抽出するには 2 時間のインキュベーションで十分です (インキュベーションが長いと、他の塩基性核タンパク質が抽出される可能性があります)。200 μL未満の容量の再懸濁サンプルの場合、より良い収率を得るためには4時間のインキュベーションが必要です。
3. 3,400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 新しいチューブに上清を集め、後でペレットを捨てます。
4. 最終的な25%〜33%のv/v(例えば、40〜60μLの低温TCA:120μLの上清)を構成するように冷濃縮TCAを加え、チューブを数回反転させて混合する。
5. チューブを一定の回転で少なくとも1時間、または4 ^°Cで振とうしてインキュベートする。
   注:開始ペレットサイズが小さい場合は、一晩インキュベーションすることをお勧めします。
6. 3,400 x g で4 ^oCで5分間遠心分離し、上清をピで捨てます。上清を慎重に吸引する。チューブやペレットの側面には触れないでください。
   注:ヒストンはチューブの側面と底部の両方に堆積します。チューブの一番下に形成された白色の不溶性ペレットは、主に非ヒストンタンパク質および他の生体分子を含む。
7. ガラス製パスツールピペット(~500 μL/チューブ)を使用して、冷たいアセトン+ 0.1% HClでチューブ(壁とペレット)を洗浄します。
8. 3,400 x g で4 ^oCで5分間遠心分離し、チューブをひっくり返して上清を捨てます。
9. ガラスパスツールピペット(〜500 μL /チューブ)を使用して、チューブ(壁とペレット)を100%冷たいアセトンで洗浄します。3,400 x g で4 ^°Cで5分間遠心分離機。
10. チューブをひっくり返して上澄みを捨て、残りのアセトンをピペットで取り出します。蓋を開け、ベンチの上のサンプルを約20分間空気乾燥させます。
11. プロピオニル化に進むか、使用時までサンプルを-80 ^°Cに保管してください。

6. 第1ラウンドの誘導体化

注:ヒストンタンパク質を消化するためにトリプシンを使用すると、従来のプロテオミクスセットアップでは同定が困難な過度に小さいペプチドが発生します。このため、無水プロピオン酸は、未修飾およびモノメチルリジン残基のɛ-アミノ基を化学的に誘導体化するために使用される。これは、トリプシンタンパク質分解をC末端アルギニン残基に制限する。96ウェルプレートのサンプルの場合、試薬ピックアップ用のマルチチャンネルピペットとリザーバの使用をお勧めします(図2A)。誘導体化はまた、ペプチドの疎水性を高め、したがって逆相クロマトグラフィー保持を増加させるペプチドの遊離N末端を標識するために消化後に行われる。

1. サンプルを 20 μL の 15% ~ 20% アセトニトリルで 100 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) に再懸濁します。渦を 15 秒間処理し、1,000 x g で 30 秒間スピンダウンします。
2. サンプルが 8 つ以上ある場合は、再懸濁した各サンプルを 96 ウェルプレートに移します。
   注: サンプルが 96 ウェルプレートに移されていない場合は、ステップ 6.3 ~ 6.7、7.1 ~ 7.5、および 8.1 ~ 8.5 でシングルチャンネルピペットを使用できます。
3. フードの下に、マルチチャンネルピペットを使用して2μLの無水プロピオン酸を加えます。上下5倍のピで混ぜる。
4. マルチチャンネルピペットを使用して水酸化アンモニウム10 μLを素早く加えます。上下5倍のピで混ぜる。
   注:プロピオン酸は、無水プロピオン酸とペプチド由来の遊離アミンとの反応の産物であり、サンプルのpHを低下させる可能性があります。pH 8は、水酸化アンモニウムを1:5(v/v)の比率でサンプルに添加することによって再確立することができる。
5. pH試験紙を使用してpHが8であることを確認します。pHが8<場合は、水酸化アンモニウムを1μL加えて調整する。pHが8>場合は、1 μLのギ酸または酢酸を加えて調整する。pHが10>場合、より高いpKaで他のアミノ酸残基の標識が可能となる。
6. 室温で10分間インキュベートする。
7. 手順 6.3 ~ 6.6 を繰り返します。ヒストンプロピオニル化の二重ラウンドは、ほぼ完全な反応効率を保証します。
8. すべてのウェルが完全に乾燥するまで(〜9時間)速度真空中で乾燥プレート。
9. トリプシン消化に進むか、使用時まで-80°Cでサンプル ^を保管してください。

7. ヒストン消化

注:ヒストンは、アルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側で切断するトリプシンを使用してペプチドに消化される。しかし、プロピオニル化はリジン残基を修飾するので、アルギニン残基のみが切断される(図2B)。

1. トリプシン溶液(50 mM NH₄HCO₃、pH 8.0 で 25 ng/μL)を調製します。各サンプルに20 μLのトリプシン(500 ng)を加える。
   1. 50 mM NH 4 HCO 3 溶液を調製するには、100 mM NH₄HCO₃ 溶液_をHPLC グレードの水で 1:1 v/v に希釈します。
2. pH試験紙を使用してpHが8であることを確認します。pHが8<場合は、水酸化アンモニウムを1μL加えて調整する。pHが8>場合は、1μLのギ酸または酢酸を加えて調整します。
3. 室温で一晩消化するか、37 ^°Cで6〜8時間インキュベートする。
4. 可能であれば、消化の約3時間後にpHが低下した可能性があるため、pHを確認してください。pHが8<場合は、水酸化アンモニウムを1μL加えて調整する。
5. さらに5 μLの50 ng/μLトリプシン溶液(250 ng)を加え、消化を続けます。
6. プロピオニル化の第2ラウンドに進むか、使用時までサンプル ^を-80°Cで保管してください。

8. ペプチドN末端の誘導体化

注:N末端でのヒストンペプチドのプロピオニル化は、プロピオニル基がペプチドの疎水性を増加させるので、逆相液体クロマトグラフィー(例えば、ヒストンH3のアミノ酸3〜8)による最短ペプチドの保持を改善する。

1. フードの下に、マルチチャンネルピペットを使用して2μLの無水プロピオン酸を加えます。上下5倍のピで混ぜる。
2. マルチチャンネルピペットを使用して水酸化アンモニウム10 μLを素早く加えます。上下5倍のピで混ぜる。
   注:プロピオン酸は、無水プロピオン酸とペプチド由来の遊離アミンとの反応の産物であり、サンプルのpHを低下させる可能性があります。pH 8は、水酸化アンモニウムを1:5(v/v)の比率でサンプルに添加することによって再確立することができる。
3. pH試験紙を使用してpHが8であることを確認します。pHが8<場合は、水酸化アンモニウムを1μL加えて調整する。pHが8>場合は、1 μLのギ酸または酢酸を加えて調整する。pHが10>場合、より高いpKaで他のアミノ酸残基の標識が可能となる。
4. 室温で10分間インキュベートする。
5. 手順 8.1 ~ 8.4 を繰り返します。ヒストンプロピオニル化の二重ラウンドは、ほぼ完全な反応効率を保証します。
6. すべてのウェルが完全に乾燥するまで(〜9時間)速度真空中で乾燥プレート。
7. 脱塩工程に進むか、使用時までサンプルを-80 ^°Cで保管してください。

9. 脱塩とサンプルのクリーンアップ

注:サンプル中に存在する塩は、質量分析分析を妨げます。塩はまた、エレクトロスプレー中にイオン化され、ペプチドからのシグナルを抑制することができる。塩はペプチド上にイオン性付加物を形成することができ、これは付加ペプチドが異なる質量を有する原因となる。これにより、ペプチドのシグナル強度が低下し、適切な同定と定量が妨げられます。脱塩のセットアップを 図2Cに示します。

1. HLB樹脂(100%アセトニトリル中50mg/mL)をマグネチックスタープレート上で混合し始める。
2. フロースルーを収集するために、96 ウェルのポリプロピレンフィルタープレートの下に 96 ウェルの収集プレートがあることを確認します。
3. 1ウェルあたり70 μLのHLB懸濁液をフィルタープレートに加える。飛沫を防ぐために真空を静かにオンにします。フロースルーを破棄します。
4. 100 μL の 0.1% TFA で樹脂を洗浄します。飛沫を防ぐために真空を静かにオンにします。フロースルーを破棄します。
5. 各サンプルを100 μLの0.1% TFAに再懸濁する。pHを確認してください;それは〜2-3でなければなりません。
6. 各サンプルを各ウェルにロードします。飛沫を防ぐために、真空を静かにオンにします。フロースルーを破棄します。
7. 100 μL 0.1% TFAで洗浄します。飛沫を防ぐために、真空を静かにオンにします。フロースルーを破棄します。
8. 収集プレートを新しい96ウェル収集プレートと交換してください。
9. 1ウェルあたり60%アセトニトリル/0.1%TFAを60 μL加える。飛沫を防ぐために、真空を静かにオンにします。フロースルーを収集し、速度真空中で乾燥させる。
10. LC-MS/MS に進むか、使用するまで -80 ^oC でサンプルを保管してください。

10. 質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーによる ヒストンペプチド分析

1. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)上で実行するように移動相を準備します。移動相A(MPA):2%HPLCグレードのアセトニトリル+0.1%ギ酸。移動相B(MPB):80%HPLCグレードアセトニトリル+0.1%ギ酸。
2. HPLC法を次のようにプログラムする:(1)30分間にわたって4%〜34%のMPB;(2)5分以上34%-90%のMPB;(3)5分間のアイソクラティック90%MPB。推奨されるカラム特性は、C₁₈ 3 μm 充填材、内径 75 μm、長さ 20 ~ 25 cm です。内径が 75 μm のナノカラムの場合、流量を 250 ~ 300 nL/分に設定します。
   1. HPLCがサンプルローディング前にカラム平衡化を自動化するようにプログラムされていない場合は、(4)1分間にわたる90%〜4%MPBおよび(5)10分間にわたるアイソクラティック4%MPBが含まれる。
3. MS取得方法をプログラムします。
   1. 計測器が各デューティサイクルの開始時に1回のフルMSスキャンを実行することを確認します。信号抽出中に利用できる質量精度のために、高解像度計装(例えば、orbitrapまたは飛行時間分析器)が推奨されます。しかしながら、低分解能計装は、前述のように利用することもできる^27,28。
   2. フル MS スキャンの後に 16 個の MS/MS スキャン イベントが続き、各イベントが 50 m/z のアイソレーション幅を持ち、m/z の範囲が 300 ~ 1100 の範囲にまたがることを確認します。たとえば、最初のスキャンでは 300 ~ 350 m/z で信号を分離し、2 回目のスキャンでは 350 ~ 400 m/z で信号を分離する必要があります。可能であれば、MS/MSスキャンも高解像度で取得しますが、フルMSスキャンと比較して低分解能で十分です(無傷のイオンと比較してフラグメントイオンの質量が小さいため)。
   3. HPLC法は、〜3〜40秒のピーク幅を有するクロマトグラフィーシグナルを生成する。適切なシグナル定量を確実に行うには、質量分析計がクロマトグラフィーピークごとに少なくとも10デューティサイクル(すなわち、3秒以上のデューティサイクル)を実行するようにしてください。
   4. トラップスタイルの質量分析器(orbitrap、イオントラップ)を使用する場合は、イオン注入時間制限が<200ミリ秒に設定されていることを確認します。他のアナライザー(四重極、飛行時間)の場合、スキャン時間が速いため、これは問題になりません。予備テストが必要な場合があります。
      注:ヒストンペプチド分析のためのMS法に関するより詳細な詳細は、以下の参考文献²⁷、^28、29に見出すことができる。
4. サンプルを10 μLのMPAに再懸濁し、これは消化ヒストンサンプルの約1 μg/μLに相当します。バッチ内のすべてのサンプルが同様の希釈液と容量を使用してロードされている場合、正確なローディング量は重要ではありません(評価も簡単ではありません)。
5. 1 μL のサンプルを HPLC カラムにロードします。
6. 手順 10.1 ~ 10.3 でプログラムした LC-MS/MS 方式を実行します。

11. データ分析

1. MS生データファイルをピーク面積統合を実行するように設計されたソフトウェアにートします。
   注:EpiProfile^30,31は現在の研究で使用されており、既知のヒストンペプチドの信頼性の高いピーク面積抽出に最適化されているため、一般的に推奨されています。しかしながら、スカイライン^32、33のような抽出イオンクロマトグラフィーのための他の自由に入手可能な^{ソフトウェアが適}している。
2. 特定の(非)修飾ペプチドの相対存在量を、単一のペプチドの面積を、そのすべての修飾形態のペプチドの総面積で割った値として計算します。EpiProfile^30,31などのソフトウェアには、シグナル抽出用のペプチドのライブラリがすでに含まれています。それ以外の場合は、目的のペプチドのライブラリーを手動で生成するか、ルーチンプロテオミクスパイプラインを使用したペプチド同定を介して生成します。

Results

このプロトコルでは、HepG2/C3Aスフェロイドを20 mM NaButおよび10 mM NaSucで処理し、どちらもヒストンPTMの全球レベルに影響を与えました(図3A)。その後、ヒストンPTMを同定し、MS/MS取得 により 単一残基レベルで定量化しました(図3B)。

サンプルを反復で実行する場合、統計解析を実行して、サンプル間のPTMのフォールド変化エンリッチメントと観察の再現性を評価できます。示されたデータは、アセチル化で修飾されたペプチドが、NaButで修飾されたスフェロイドと対照で修飾されたスフェロイドで富んでいることを実証し(図3C)、一方、NaSucで処理したサンプルは、リジンスクシニル化で修飾されたヒストンペプチドの相対的存在量が高い(図3D)。これらの計算は、別の出版物^3...

Discussion

ヒストンPTMの分析は、典型的なプロテオミクス分析パイプラインとは根本的に異なります。ほとんどのヒストンPTMは依然として謎めいた生物学的機能を持っています。その結果、遺伝子オントロジーや経路データベースなどの注釈は利用できません。ヒストン修飾をそれらの触媒作用を担う酵素またはこれらのPTMに結合するドメインを含むタンパク質(例えば、HISTome³⁶)に関連付けるいくつかのリソースが存在する。同様に、ヒストンPTMのグローバルレベルが調節されるときのクロマチンの全体的な状態を推測することが可能である。例えば、ヒストンアセチル化またはスクシニル化のような他のアシル化の全体的な増加は、通常、クロマチン脱縮合と関連している^37、38。

MS分析は、アミノ酸配列上のそれらの正確な局在化など、これらの改変に関するより詳細な情報を提供する。このプロトコルでは、MS/MS取得を使用してヒストンPTMを同定および定量化し、生物学的解...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05%トリプシン-EDTA溶液	Gibco	25300054
0.5-20 µL ピペットチップ	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL 微量遠心チューブ	Bio-Rad	2239480
10 µL マルチチャンネルピペット	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL シリンジ	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	ルアーロックチップ、12 mL
10、20、200、1000 µL シングルチャンネルピペット	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µLピペットチップ	レイニン	30389164
18 Gシリンジ針	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3インチ長さ、0.05インチ直径
200 & マイクロ;Lマルチチャンネルピペット	Corning	4082
2-200 µLピペットチップ	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24ウェル超低添付マイクロプレート	Corning	07-200-602
75 cm2 U字型細胞培養フラスコ	コーニング	461464U	未処理、ベントキャップ付き
96ウェルスカートプレート	Axygen	PCR-96-FS-C (コーニング)
アセトン	フィッシャーサイエンティフィック	A949-1	アセトンは冷
冷重炭酸アンモニウム (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
水酸化アンモニウムソリューション	フィッシャーサイエンティフィック	AC423300250
細胞培養グレードの水	コーニング	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	3D細胞培養用バイオリアクター
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat 3D細胞培養用CO2インキュベーター
コントロールユニット	CelVivo	N/A	ClinoStar用タブレット設定
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X solution with 4.5 g/L グルコースとピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンとフェノールレッドなし
シ胎児血清 (FBS)	Corning	35-010-CV
ギ酸	Thermo Scientific	28905
ヒュームフード	モット	N/A	モデル 7121000
ガラスパスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-8B	9インチ、綿栓、ホウケイ酸ガラス、非滅菌
グルタグロサプリメント	コーニング	25-015-CI	200 mM L-アナニル-L-グルタミン
ハンク'	Corning	21-022-CV	1X 溶液 カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド
HPLC グレードアセトニトリル	Fisher Scientific	A955-4
HPLC グレード水	Fisher Scientific	W6-1
塩酸 (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	N/A	N/A
MEM非必須アミノ酸	コーニング	25-025-CI	100X 溶液
オアシス HLB 樹脂	ウォーターズ	186007549	親水性 - 親油性 - バランス (HLB) 樹脂 30µm 粒度
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	高分解能質量分析計
Oro-Flex I ポリプロピレンフィルタープレート	Orochem	OF1100	96ウェルポリプロピレンフィルタープレート w/ 10 µM PEフリット
ペニシリン-ストレプトマイシン	コーニング	30-002-CI	100X溶液
pH紙	Hydrion	Z111848(Sigma-Aldrich)	0-13 pH試験紙
ピペットガン	Eppendorf	Z666467(ミリポアシグマ)
ポリマイクロキャピ	Molex	50-110-7740(Fisher Scientific)	ポリイミドコーティングを施した柔軟な溶融シリカキャピラリーチューブ、75 & micro;M ID x 363 & マイクロ;M OD
ポリスチレン 10 mL 血清ピペット、滅菌済み	フィッシャー サイエンティフィ	1367549
無水プロピオン酸	Sigma-Aldrich	240311-50G
冷蔵遠心分離機	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur 樹脂	MSWIL	R13.AQ.0003	120 Å 細孔サイズ、C18-AQ 相、3 µMビーズサイズ
ローテーター	クレイ・アダムス	25477 (American Laboratory Trading)	ニューテーターミキサー 1105
シーケンシンググレード 改変トリプシン	プロメガ	V5111
酪酸ナトリウム	サーモサイエンティフィック	A11079
コハク酸ナトリウム 二塩基性	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac 真空濃縮器 (1.5 mL 微量遠心チューブ)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac 真空濃縮器 (96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
滅菌フード	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
硫酸 (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analyzed ACS reagent
組織培養処理 100 mm x 20 mm ディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-23
トリクロロ酢酸 (TCA)	サーモサイエンティフィ	サイエンティフィック セAC421451000	HPLCグレードの水で100%w/vを再懸濁
トリフルオロ酢酸(TFA)	フィッシャーサイエンティフィ	PI28904	シーケンシンググレード
バキュームマニホールド96ウェル	ミリポア	MAVM0960R
ボルテックス	Sigma-Aldrich	Z258415
ウォーターバス	フィッシャー サイエンティフィック	FSGPD10
ワイドボア ピペット チップ 1000 & マイクロ;L	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
ワイドボアピペットチップ 200 & マイクロ;L	Axygen	14-222-730 (フィッシャーサイエンティフィック)