Method Article

成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング

DOI:

10.3791/63620

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

In This Article

Summary

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プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。

Abstract

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びまん性浸潤性神経膠腫は、腫瘍転移の浸潤性の性質のために、高い罹患率および死亡率と関連している。それらは形態学的に複雑な腫瘍であり、腫瘍自体とその不均一な微小環境の両方にわたって高度なプロテオミクス変動性を有する。これらの腫瘍の悪性化の可能性は、細胞の安定性を維持し、微小環境の構造的完全性を維持するプロセスを含む、いくつかの重要な経路に関与するタンパク質の調節不全によって増強されます。バルクおよび単一細胞神経膠腫の解析は数多く行われていますが、これらのプロテオミクスデータの空間層別化は比較的不足しています。内因性腫瘍、浸潤端、微小環境の間の腫瘍形成因子と免疫細胞集団の空間分布の違いを理解することは、腫瘍の増殖と伝播の根底にあるメカニズムへの貴重な洞察を提供します。デジタル空間プロファイリング(DSP)は、これらの重要な多層解析の基盤を形成できる強力なテクノロジーです。

DSPは、組織標本中のユーザー指定の空間領域内のタンパク質発現を効率的に定量化する方法です。DSPは、区別領域内および領域間での複数のタンパク質の発現差を研究するのに理想的であり、複数のレベルの定量的および定性的分析を可能にします。DSPプロトコルは体系的でユーザーフレンドリーであり、プロテオミクスデータのカスタマイズされた空間分析を可能にします。この実験では、組織マイクロアレイは、アーカイブされた膠芽腫コア生検から構築されます。次に、サンプル内の目的のタンパク質を標的とする抗体のパネルが選択されます。次に、UV光切断可能なDNAオリゴヌクレオチドにプレコンジュゲートされた抗体を組織サンプルとともに一晩インキュベートします。抗体の蛍光顕微鏡による可視化下で、タンパク質発現を定量するための関心領域(ROI)がサンプルとともに定義されます。次に、UV光が各ROIに向けられ、DNAオリゴヌクレオチドが切断されます。オリゴヌクレオチドはマイクロ吸引され、各ROI内でカウントされ、対応するタンパク質を空間ベースで定量します。

Introduction

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びまん性浸潤性神経膠腫は、成人の悪性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、常に致命的です。神経膠腫細胞が脳内で広範囲に移動する傾向は、主要な治療上の課題です。それらが広がるメカニズムには、指示された移動とチェックされていない侵入が含まれます。浸潤性グリオーマ細胞は、白質路に沿った向性と遊走を示すことが示されており1、最近の研究では、これらの管の脱髄が活性で腫瘍形成性の特徴として関与しています2。浸潤は上皮から間葉への移行によって媒介され、グリオーマ細胞は、細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着分子をコードする遺伝子の発現を低下させ、遊走を増幅し、腫瘍微小環境を介した増殖を促進することによって間葉系特性を獲得する3,4,5。

分子レベルでは、細胞の安定性と免疫原性成分との界面を付与するいくつかのタンパク質の破壊が実証されています6。浸潤性神経膠腫は、抗アポトーシス性(PTENなど)特性を有するタンパク質の抑制を受けることが知られている7。また、宿主の免疫応答の回避を促進するタンパク質(PD1/PDL1など....

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Protocol

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以下に概説するプロトコルは、ダートマス-ヒッチコック人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。インフォームドコンセントは、組織サンプルがこの研究に含まれた患者から得られました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、「 材料の表 」セクションを参照してください。

1. スライド準備17

  1. ヒト成人型びまん性浸潤性神経膠腫からホルマリン固定パラフィン包埋組織を採取または調製します。
    注:この実験では、膠芽腫の3人の患者からの生検のパラフィン包埋ブロックが使用されました。
  2. 組織マイクロアレイ(TMA)ブロックを作成します。各生検からいくつかの2 mmコアを取り出し、それらを単一のTMAブロックに入れます(図1、上)。TMAブロックから切片を4 μmで切り取り、スライドガラスに取り付けます。各スライドをスライドホルダーガスケットの内側に配置します。スライドを60°Cで30分間インキュベートします。

2. 半自動IHCシステムの準備とソフトウェア構成(スライドのロードと実行用)1....

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Results

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図4 は、膠芽腫のサンプルに対して実施されたDSP実験の代表的な結果を示す。ヒートマップが表示され、DSPソフトウェアを使用してデータを視覚的にキャプチャする方法の1つが示されています。行はタンパク質ターゲットを表し、各列は関心領域に対応します。青から赤の色の範囲は、それぞれ低表現から高表現を示します。列内の色のばらつきは、地域のタンパク質の不均一性を反映しており、タンパク質発現の違いとの空間的関連の可能性を示唆しています。例えば、本実験では、S100とCD56は神経マーカーであるため普遍的に高い。

最も変動性の高いマーカーには、B7-H3、Ki-67、CD44、およびフィブロネクチンが含まれていました。これらのマーカーは、それぞれ腫瘍の増殖、遊走、および転移と重要な関連があります。したがって、悪性コア、悪性浸潤、および非悪性組織のサンプル間で地域変動を示すことは合理的です。数値データ表現も可能です。ROI内の各タンパク質マーカーの発現値を表形式で含むファイルは、数学的および統計的分析のためにエクスポートできます。この発現.......

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Discussion

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神経膠腫の攻撃性に影響を与える可能性のあるタンパク質の多様性と、これらのタンパク質のいくつかが未発見のままであるという考えを考えると、ハイスループットタンパク質定量法は理想的な技術的アプローチです。さらに、腫瘍学的サンプル中の空間データは示差的発現18と相関することが多いため、空間プロファイリングをタンパク質定量アプローチに組み込むことで、より効果的な分析が可能になります。

DSPのハイスループットアプローチにより、ショットガンのようなアプローチでの使用も可能になり、疾患や治療への反応の潜在的な新しいバイオマーカーを発見するのに理想的です。黒色腫に関する2件の研究では、DSPを使用して、イピリムマブとニボルマブの併用療法とニボルマブ単剤療法の比較19 、およびイピリムマブとニボルマブのネオアジュバント併用療法と標準的なアジュバント療法に対する反応を評価しました20。どちらの研究でも、治療後のさまざまなタンパク質標的のDSPプロファイリングは.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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著者らは、ダートマスヒッチコックヘルスシステムの病理学および検査医学部門の臨床ゲノミクスおよび先端技術研究所の支援を認めています。著者らはまた、ダートマスがんセンターの病理学共有リソースとNCIがんセンターサポート助成金5P30 CA023108-37を認めています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BOND Research Detection SystemLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyDS9455試薬トレイに開いた容器を含むオープン検出システム
BOND WashLeica Biosystems, Wetzlar, GermanyAR95010X 濃縮緩衝液 固定組織洗浄用
Buffer WNanoString, Seattle, WAcontact companyブロッキング試薬
Cy3 標識キットAbcam, Cambridge, UKAB188287Cy3蛍光抗体標識キット
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString, Seattle, WAcontact companyおよびRNAターゲットのイメージングと特性評価のためのシステム
GeoMx DSP Instrument BufferKitNanoString, Seattle, WA100471GeoMX DSP用バッファーキット(サンプル処理および調製用のバッファーを含む)
GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString, Seattle, WA121300401Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)NanoString, Seattle, WA121300101Protein module with targets for humans immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)NanoString, Seattle, WA121300105複数のヒト腫瘍タイプおよび上皮間葉系遷移のマーカーを標的とするタンパク質モジュール
GeoMx Protein Slide Prep FFPENanoString, Seattle, WA121300308GeoMX DSPタンパク質解析用サンプル調製試薬
LEICA Bond RXLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, Contact companyFully automated IHC stainer
Master Kit--12 reactionsNanoString, Seattle, WA100052nCounter 解析システムで使用する材料と試薬
nCounter 解析システムNanoString, Seattle, WAcontact companyプレックスターゲット発現定量自動システム (GeoMx DSP で使用)
TMA Master II3DHistech Ltd., Budapest, Hungaryマイクロアレイブロックの作成
タンパク質 マルチ 組織

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white ....

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