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方法論記事

腎除神経の改善により、アンジオテンシンII注入による高血圧が軽減されました。

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DOI：

10.3791/63719

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2022年5月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、アンジオテンシンII注入によって誘発された高血圧マウスにおける腎交感神経除神経(RDN)のプロトコルを提示します。この手順は再現性があり、便利であり、高血圧および心肥大に対するRDNの調節メカニズムを研究することを可能にする。

要約

血圧に対する腎交感神経除神経(RDN)の利点は、近年の多数の臨床試験で証明されています。しかし、高血圧に対するRDNの調節メカニズムはとらえどころのないままです。したがって、マウスでより単純なRDNモデルを確立することが不可欠です。この研究では、アンジオテンシンIIを充填した浸透圧ミニポンプを14週齢のC57BL / 6マウスに移植しました。ミニ浸透圧ポンプの移植の1週間後、フェノールを使用してマウスの両側腎動脈に対して修正RDN手順を実施した。年齢性別を一致させたマウスに生理食塩水を与え、偽群とした。血圧はベースライン時とその後21日間毎週測定されました。次に、腎動脈、腹部大動脈、心臓を採取し、H&Eおよびマッソン染色を用いた組織学的検査を行った。この研究では、高血圧を制御し、心肥大を緩和できる、シンプルで実用的で再現性のある標準化されたRDNモデルを提示します。この技術は、腎動脈に損傷を与えることなく末梢腎交感神経を除神経することができます。以前のモデルと比較して、修正されたRDNは、高血圧の病態生物学および病態生理学の研究を容易にします。

概要

高血圧は、世界中の主要な慢性心血管疾患です。制御されていない高血圧は、標的臓器に損傷を与え、心不全、脳卒中、および慢性腎臓病の一因となる可能性があります1,2,3。高血圧の有病率は、中国では1991年から2007年の間に20%から31%に増加しました。中国の高血圧症の成人の数は、高血圧の診断基準(130/80 mmHg)4の最近の改訂に続いて倍増する可能性があります。高血圧は薬で制御できますが、最大耐量で少なくとも3つの降圧薬(1つの利尿薬を含む)を投与された場合でも、患者の約20%が高血圧を制御できず、薬剤耐性高血圧の発症につながる可能性があります5。

腎交感神経除神経(RDN)は、高血圧の潜在的な治療法であることが証明されています。2009年、KrumらはRDNを用いた抵抗性高血圧治療を初めて報告した。経皮的腎動脈焼灼術は、患者6の持続的な血圧低下を効果的に引き起こす可能性があることがわかりました。しかし、シンプリシティ高血圧3(HTN-3)試験の失敗により、RDN7の適用が妨げられ、RDNは物議を醸す治療法になりました。それにもかかわらず、RDNの見通しはまだ排除されていません。RADIANCE-HTN SOLO、SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED、SPILAL HTN-OFF MED Pivotalなどの最近の臨床試験では、高血圧に対するRDNの有効性が確認されています8,9,10,11,12。したがって、RDNの効果を調査するには、より詳細な機構研究を実施する必要があります。

この研究の全体的な目的は、マウスのRDNをどのように変更して、より簡単で安定した手術を生み出すことができるかを示すことです。多数の実験が、異なる動物モデルにおける血管内凍結焼灼、体外超音波および化学的または神経毒の局所適用など、RDNの様々なアプローチを研究してきた13、14、15、16、17。フェノールによる化学的アブレーションを用いて生成されたRDNモデルは、高血圧に対する交感神経活性化の病因を研究するための確立された実験モデルです。このモデルは、綿棒18を使用した10%フェノール/エタノール溶液による腎交感神経の化学腐食によって生成されます。一方では、従来のRDNは腎交感神経活動を潜在的に阻害し、それがレニン分泌およびナトリウム再吸収を減少させ、腎血流を増加させる。一方、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系19を抑制する。これにより、RDNは高血圧に対して有益な効果を有する。しかし、化学的アブレーションで生成されたRDNモデルにはアブレーション基準やアブレーション時間が欠けており、実験手順の詳細はまだ不明です。また、利用可能なテクニカルレポートはありません。本報告では,C57BL/6マウスにおけるアンジオテンシンII(Ang II)誘発高血圧症における計量紙を用いたフェノールを用いたRDNモデル作製の手術プロトコールについて述べる.フェノールを含む秤量紙で腎動脈を包み、アブレーション時間を統一することで、より再現性と信頼性の高いRDNモデルの確立に貢献します。この実験モデルは、高血圧に対するRDNの効果を評価することを目的としています。

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プロトコル

すべての動物実験手順は、実験動物の世話と使用に関する関連する倫理ガイド(NIH出版物第85-23号、2011年改訂)に準拠し、復旦大学付属華東病院の動物研究委員会によって承認されました。14週齢の雄C57BL/6マウス(28-30g)を無作為に4つの群に分けた:シャム群、シャム+アンII群、RDN群、RDN+Ang II群、n = 6各群。すべての動物は、24 ± 1°Cの温度管理された部屋で、12時間の明暗サイクルと標準的なげっ歯類の固形飼料と水への自由な自由アクセスを備えた、特定の閉鎖病原体のない条件下で維持されました。

1. 操作フィールドの準備

  1. 手術台を70%エタノールで消毒します。加熱パッドの温度を37°Cに調整します。
  2. 手術前に、すべての手術器具が121°Cで30分間、または他の方法で滅菌されていることを確認してください。この手順には、マイクロ外科用ハサミ、2つの細い直線鉗子、2つの細かい湾曲した鉗子、止血鉗子、滅菌ガーゼ、および計量紙が必要です。

2.アンジオテンシンII誘発性高血圧

  1. 麻酔導入の直前にメロキシカム(0.5 mg / kg、SC)をC57BL / 6マウスに提供します。.次いで、前述のようにペントバルビタールナトリウム注射を用いてマウスを麻酔する20、21。好ましい場合はイソフルランも使用することができる。負のつま先のピンチ反射で麻酔の深さを確認します。
  2. シェーバーで背中の毛を取り除きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医軟膏を目に塗ります。
  3. 動物を背側の手術台に置きます。剃った部分をポビドンヨードで拭き取り、続いて70%エタノールで3回拭きます。
  4. 前脚の肩甲骨の上の耳の後ろで、尾に垂直に滅菌メスの刃を使用して1 cmの切開を行います。
  5. 滅菌止血剤を用いて皮膚下に皮下トンネルを作り、ポンプ22用のポケットを作る。アンジオテンシンII(1,000ng/kg/min)を充填した浸透圧ポンプをポケットにそっと挿入します。皮膚を伸ばさずに傷を縫合するのに十分な空きスペースがあることを確認してください。
  6. 中断された6-0ビクリル縫合糸で筋肉を縫合し、中断された4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。傷の部位をポビドンヨードで拭きます。対照群に対して等量の生理食塩水で同じ手術を行う。
  7. すべての手術器具を滅菌器に10秒間入れ、手術の合間に滅菌手袋を交換します。完全に回復するまですべてのマウスを監視します。
  8. マウスの創傷治癒を注意深く監視し、最初の週に少なくとも1日2回、その後は毎日1回、発赤、腫れ、感染を含めます。.Ang II注入中にマウスが死亡した場合は、直ちに解剖を行います。
  9. ベースライン時および毎週、意識のあるマウスのテールカフプレチスモグラフィ法23 を使用して、Ang II注入後に血圧を測定します。.血圧測定実験は、実験開始前にマウスを1時間順応させる22±2°Cの静かな場所で実施してください。ベースライン血圧測定の前に少なくとも5日間連続してマウスを馴化させる23、24。

3.両側腎除神経

  1. Ang II注入の1週間後に血圧(BP)が上昇≥140 / 90mmHgまたは収縮期血圧/拡張期血圧が25%増加したマウスを選択します。
  2. 手術前に動物の体重を記録し、腎除神経手術には最小体重24 gの動物を選択してください。
  3. ペントバルビタールナトリウムを用いてマウスを麻酔する。負のつま先のピンチ反射で麻酔の深さを確認します。
  4. シェーバーで腹部の毛を取り除きます。外科的汚染を避けるために、この手順を慎重かつ徹底的に実行してください。
  5. マウスを手術台の上に置き、腹部を上に保ち、その手足をテープで固定します。腹部の皮膚をポビドンヨードで消毒した後、70%エタノールで3回拭きます。
  6. メスの刃を使用して2cmの腹側正中線腹部切開を行います。37°Cの生理食塩水に浸したガーゼで腸を引き戻し、左腎動脈を露出させる。湾曲したピンセットを使用して、腎動脈から脂肪を注意深く、しかし鈍く解剖します。(図1A-C)。
  7. 計量紙を滅菌鋭利なハサミで腎動脈と同じサイズの長方形に切ります。参考までに、計量紙を 図1Cの点線で示されているのと同じサイズにカットします。
    注:それは手術の重要な部分であり、同じ形状を維持するために一度に計量紙のいくつかの部分をカットするようにしてください。
  8. 計量紙を10%フェノール/エタノール溶液に少なくとも30秒間浸します。左腎動脈の表面を覆い、血管を計量紙で包み、2分間保持します(図1D)。ガーゼを使用して周囲の組織を保護し、計量紙が周囲の腎臓や腸に触れないようにします。
    注意: フェノール溶液はプラスチックチューブでは安定していますが、ガラスバイアルでは安定していません。したがって、溶液は、実験18毎に新たに調製されなければならない。
  9. 右腎動脈についても同じ手順を実行します。生理食塩水に浸した計量紙で偽手術を行います。
  10. 筋肉を初期位置に再配置し、中断された縫合糸で6-0ビクリル縫合糸で腹膜を閉じます。次に、中断した4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。完全に回復するまですべてのマウスを監視します。

4.術後のケア

  1. ポビドンヨードを切開部に塗布し、回復と術後のモニタリングのために動物を温めた電気毛布に入れます。
  2. マウスを1日2回監視して、発赤、腫れ、痛みまたは腹部感染症を評価します。メロキシカム(0.5 mg / kg、SC)をRDN手順の約1時間前と24時間後にすべてのマウスに提供します。.

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結果

統計学
すべてのデータは、平均±標準偏差として表されます。一元配置分散分析は、3つ以上の条件での実験に使用され、その後、個々のグループ間の比較のためにボンフェローニ事後検定が行われました。0.05以下のp値を有意値と見なします。すべての統計分析を実行するために、市販のソフトウェアが使用されました。

Ang IIによって誘発される血圧の上昇は、RDN後に減弱しました
収縮期血圧(SBP)の有意な増加は、Ang II注入の1週間後に観察されました。.RDN + Ang II群は、RDN処置後21日目にSham + Ang II群と比較してSBPの有意な減少を示した(143.50 ± 5.43 vs 196.67 ± 14.26 mmHg、p < 0.01)。RDN後2週間で、Sham群とRDN群の間に差はありませんでした(113.33 ± 9.35 vs 113.17 ± 8.47 mmHg、p > 0.05)(図2)。

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ディスカッション

RDNが血圧を下げることができるかどうかは、シンプリシティHTN-3試験7,25の否定的な結果が発表されて以来、物議を醸しています。しかし、いくつかの臨床試験および動物実験は、高血圧のヒトおよび動物に対するRDNの肯定的かつ効果的な結果を示している9、10、11、12、13、14、15、16、17。フェノールは動物の腎神経の...

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開示事項

著者が宣言したように、金銭的またはその他の利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(81770420)、上海市科学技術委員会(20140900600)、上海臨床老年医学重点研究所(13dz2260700)、上海市重点臨床専門(shslczdzk02801)、および復旦大学付属華東病院老人冠状動脈疾患センターの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Angiotensin IISangon BiotechCAS:4474-91-3高血圧アニモールモデルを作るには
抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体Abcamab137869腎臓神経のTHの発現を評価するには
血圧分析Visitech SystemsBP-2000マウスの血圧を測定する
ミニ浸透圧ポンプDURECT CorporationCA 95014アンジオテンシンII
ノルエピネフリンELISAキットAbcamab287789腎臓ノルエピネフリンレベルを測定するために
フェノールSangon BiotechCAS:108-95-2腎臓交感神経を損傷する
計量紙Sangon BiotechF512112フェノールに浸した計量紙で腎臓神経を破壊するには; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 
で充填するには

参考文献

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