ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。
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この記事について
サマリー
要約
間葉系幹細胞の治療可能性を探ることは、単離の容易さ、分化に対する効力、および供給源の信頼性と堅牢性にかかっています。ここでは、ヒト臍帯組織(uMSC)から間葉系幹細胞を単離するための段階的なプロトコール、それらの免疫表現型決定、およびいくつかの継代にわたるそのような培養物の増殖について記述する。この手順では、酵素消化がないためuMSCsの生存率は高い。さらに、臍帯動脈および静脈を含む血管の除去は、内皮起源の細胞の汚染がないことを確実にする。フローサイトメトリーを用いて、単離時のuMSCはCD45−CD34−であり、造血系統からの細胞の不在を示す。重要なことに、それらは重要な表面マーカー、CD105、CD90、およびCD73を表現します。培養物の樹立に際し、本稿では、これらのuMSCを骨格筋系統に分化誘導する効率的な方法を記載する。分化したuMSCにおける筋原性進行の詳細な分析により、uMSCは分化の初期段階において筋原性前駆細胞のマーカーであるPax7を発現し、続いてMyoDおよびMyf5の発現、そして最後に終末分化マーカーであるミオシン重鎖(MyHC)を発現することが明らかになった。
概要
ヒト臍帯は、間葉系幹細胞の堅牢な貯蔵庫を有すると信じられており、それらは、その堅牢な増殖および分化速度、免疫調節特性、および3つの胚葉すべてから細胞を生成する能力のために、現在再生療法のために探求されている1。臍帯組織は、臍帯血、臍帯静脈下内皮、ウォートンゼリー(WJ)などの複数の区画からなり、それ自体が血管周囲ゾーン、血管間ゾーン、および羊膜下またはコードライニング(CL)2の3つの不明瞭な領域を包含する。uMSCはこれらすべての異なる領域から単離され、主要なMSCマーカーを広く発現することができるが、これらのコンパートメントが同じ集団のuMSCを含むのか、それともそれらの分化能に違いを示すのかについては明確ではない3。したがって、uMSCの単離のためのプロトコルは、その分離のモードおよび領域におけるより高い精度、分化電位の堅牢な特性評価、および最後に、コードの異なる区画からの比較分析を必要とする。
この文脈において、コードの異なる部分間のuMSC増殖性および分化電位の違いを実証した研究はほとんどない。これらのうち、CL領域およびWJ領域から単離されたuMSC間の比較分析は、CL由来uMSCs3,4においてより大きな増殖能
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プロトコル
この研究における臍帯組織の使用は、幹細胞研究のための機関委員会(IC-SCR)、機関倫理委員会、トランスレーショナルヘルス科学技術研究所(IEC-THSTI)、市民病院、グルグラム、ハリヤーナ州の機関倫理委員会、および施設バイオセーフティ委員会THSTIによって承認されました。ヒト臍帯組織サンプルは、出生時の期間分娩から採取した。インフォームド書面による同意が被験者から得られた。全ての方法は、関連するガイドライン及び規制に従って実施した。
1. 臍帯組織からのMSCの単離
- 送達時には、少なくとも5cmのコードを、好ましくは胎盤の近くに切断し、外表面を70%エタノールで拭いてコードを滅菌する。コード組織片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1つの50mL収集チューブから、それを含む別の収集チューブに順次移す。氷上の被験者の名前を冠した収集チューブを1時間以内に実験室に輸送する。
注: 大規模な試験では、サンプルをバーコード化して、試験全体を通して追跡できるようにすると便利な場合があります。重要なことに、ヒト組織を扱うすべての人員は、B型肝炎ワクチンの完全なレジメンを提供されるべきである。 - ラボでは、使用前にオートクレーブ処理された器具とピペットを滅菌するために、BSL-2フードでUVを25分間オンにします。
- コード組織片を収集チューブから、5 g/L グルコース、50 μg/....
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結果
臍帯組織からのuMSCの単離の成功は、全臍帯血からの成功率の低さとは異なり、>95%である。uMSCの単離に成功すると、FACS分析により、すべての細胞がCD34−CD45−CD105+CD90+であることが明らかになった。しかしながら、比較解析において、臍帯血から単離されたuMSCは不均一な集団を示し、ここで細胞の割合はCD34+CD45+CD105+(〜15%)を示す。さらに、ダブルポジティブCD105+CD90+は数が少なく(〜5%)(補足図S1)。これは、CD105およびCD90発現の両方が筋形成の誘導に必要であるため、臍帯血からのuMSC間の筋原性分化のレベルを低下させる。uMSCはまた、表1に列挙されたマーカーの発現を表示する。臍帯血由来uMSCの汚染がある場合、CD34 + CD45 +細胞の存在もあります。これ.......
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ディスカッション
重要なステップ
このプロトコルの重要なステップは、送達時から無菌培養物の維持まで、増殖の全期間にわたって、無菌条件下での組織の収集である。コード収集中は、コードが滅菌されていない表面に触れず、抗生物質を添加したPBSを含むチューブに収集する前に70%エタノールで外部から拭き取ることが不可欠です。uMSC単離のために、コード収集と組織の処理との間の時間を制限することが重要です。組織を収集部位から実験室に輸送する必要がある場合は、抗生物質含有緩衝液で組織を維持し、氷上に保存するように注意する必要があります。
メソッドの変更とトラブルシューティング
uMSCの筋原性分化を誘導するためのこのプロトコルの重要な修正は、0.01%タイプ1コラーゲンおよび20μg/mLラミニンによるディッシュのコーティングである。我々は、接着条件も調節されると、M1培地の存在下でuMSCsにおける筋原性進行が増強されることを観察した。高価ではあるが、Matrigelのような他の優れた行列の使用が、このプロトコルをさらに改善する可能性.......
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開示事項
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
謝辞
撮影とビデオ制作に協力してくれたOjas Tikoo氏に感謝します。我々はまた、GARBH-Ini(Advanced Research and Birth Outcome-DBT India)のスタッフ、看護師、上級研究官、及びPallavi Kshetrapal博士から物流に関する支援を受けたことを認識する。この研究は、インドのバイオテクノロジー省からSuchitra Gopinathに授与された助成金によって支援されました(BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | D1306 | |
| アムホテリシン B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| 抗生物質溶液 100x 液体、エンドトキシン試験済み (10,000 U ペニシリンと 10 mg ストレプトマイシン/mL 0.9% 生理食塩水溶液) | HiMedia | A001A-50mL | |
| 抗 GAPDH 抗体 | Sigma Aldrich | G8795 | |
| 抗MyHC抗体 (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| 抗MyoD抗体 (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| 抗ミオゲニン抗体 (クローンF5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| 抗Pax7抗体 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| コラーゲン 1型 | メルク | C8919 | |
| D (+) グルコース | Sigma Aldrich | G7021 | |
| デキサメタゾン | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II または FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, 認定ブラジル | GIBCO | 10270106 | 熱不活化 |
| FITCマウス 抗ヒトCD106クローン 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC マウス抗ヒトCD14クローン M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC マウス抗ヒトCD31クローン WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC マウス抗ヒトCD34クローン 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC マウス抗ヒトCD45クローンHI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC 抗ヒトマウス CD49D クローン 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC マウス抗ヒト CD90 クローン 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC マウス抗ヒト HLA-A,B,C クローン G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC マウス抗ヒト IgG クローン G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo ソフトウェア | BD Biosciences | ||
| ゲンタマイシン | シグマ アルドリッチ | G1264 | |
| 馬血清 | HiMedia | RM1239 | |
| ヒドロコルチゾン | メルク | H4001 | |
| ラミニン | メルク | L2020 | |
| MEM アルファ修飾 L-グルタミン、リボ-およびデオキシリボヌクレオシドなし | ハイクロン | SH30568. | FS uMSCs PEマウス抗 |
| ヒトCD105クローン 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE マウス抗ヒトCD44クローン 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE マウス抗ヒトCD49EクローンllA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PEマウス抗ヒトIgGクローン G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7マウス抗ヒトCD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| トリプシン/EDTA 溶液 (1x 0.25% トリプシンと 0.02% EDTA のハンクス平衡塩溶液 (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
参考文献
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L.
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