方法論記事

ヒト臍帯組織からの間葉系幹細胞の生成と骨格筋系統への分化

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DOI：

10.3791/63725

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2022年8月31日

 , 
1Translational Health Science and Technology Institute (THSTI), NCR Biotech Science Cluster

この記事について

サマリー

ヒト臍帯組織から間葉系幹細胞を単離し、骨格筋系統に分化させるためのプロトコルについて説明する。

要約

間葉系幹細胞の治療可能性を探ることは、単離の容易さ、分化に対する効力、および供給源の信頼性と堅牢性にかかっています。ここでは、ヒト臍帯組織(uMSC)から間葉系幹細胞を単離するための段階的なプロトコール、それらの免疫表現型決定、およびいくつかの継代にわたるそのような培養物の増殖について記述する。この手順では、酵素消化がないためuMSCsの生存率は高い。さらに、臍帯動脈および静脈を含む血管の除去は、内皮起源の細胞の汚染がないことを確実にする。フローサイトメトリーを用いて、単離時のuMSCはCD45−CD34−であり、造血系統からの細胞の不在を示す。重要なことに、それらは重要な表面マーカー、CD105、CD90、およびCD73を表現します。培養物の樹立に際し、本稿では、これらのuMSCを骨格筋系統に分化誘導する効率的な方法を記載する。分化したuMSCにおける筋原性進行の詳細な分析により、uMSCは分化の初期段階において筋原性前駆細胞のマーカーであるPax7を発現し、続いてMyoDおよびMyf5の発現、そして最後に終末分化マーカーであるミオシン重鎖(MyHC)を発現することが明らかになった。

概要

ヒト臍帯は、間葉系幹細胞の堅牢な貯蔵庫を有すると信じられており、それらは、その堅牢な増殖および分化速度、免疫調節特性、および3つの胚葉すべてから細胞を生成する能力のために、現在再生療法のために探求されている1。臍帯組織は、臍帯血、臍帯静脈下内皮、ウォートンゼリー(WJ)などの複数の区画からなり、それ自体が血管周囲ゾーン、血管間ゾーン、および羊膜下またはコードライニング(CL)2の3つの不明瞭な領域を包含する。uMSCはこれらすべての異なる領域から単離され、主要なMSCマーカーを広く発現することができるが、これらのコンパートメントが同じ集団のuMSCを含むのか、それともそれらの分化能に違いを示すのかについては明確ではない3。したがって、uMSCの単離のためのプロトコルは、その分離のモードおよび領域におけるより高い精度、分化電位の堅牢な特性評価、および最後に、コードの異なる区画からの比較分析を必要とする。

この文脈において、コードの異なる部分間のuMSC増殖性および分化電位の違いを実証した研究はほとんどない。これらのうち、CL領域およびWJ領域から単離されたuMSC間の比較分析は、CL由来uMSCs3,4においてより大きな増殖能を明らかにした。別の研究では、WJ由来のuMSCは、血管周囲細胞(HUCPV)と比較して増殖アッセイにおいてより優れた性能を発揮しました5。臍帯血由来uMSCと血管汚染を欠く臍帯組織由来uMSCの違いを調べる際に、2つのコンパートメント間で主要なMSCマーカーの差異発現が報告され、臍帯組織由来uMSCsの増殖速度が増加した6。

骨形成、脂肪原性、軟骨形成性系統などの中胚葉系譜の組織へのuMSCの分化能を調べたいくつかの研究のうち、筋原性分化およびその後の特徴付けのための詳細なプロトコル、ならびに様々なコードコンパートメント間の比較分析を提供した研究はほとんどない。この文脈で、我々は堅牢な筋肉分化プロトコルを開発し、臍帯組織由来uMSCsが臍帯血と比較して優れた筋原性分化能力を示すことを観察した6。ここでは、血管系に関連する細胞を欠いている臍帯組織全体からのuMSCの単離、それらの特徴付け、および筋原性系統への分化について、段階的なプロトコールが詳述されている。

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プロトコル

この研究における臍帯組織の使用は、幹細胞研究のための機関委員会(IC-SCR)、機関倫理委員会、トランスレーショナルヘルス科学技術研究所(IEC-THSTI)、市民病院、グルグラム、ハリヤーナ州の機関倫理委員会、および施設バイオセーフティ委員会THSTIによって承認されました。ヒト臍帯組織サンプルは、出生時の期間分娩から採取した。インフォームド書面による同意が被験者から得られた。全ての方法は、関連するガイドライン及び規制に従って実施した。

1. 臍帯組織からのMSCの単離

  1. 送達時には、少なくとも5cmのコードを、好ましくは胎盤の近くに切断し、外表面を70%エタノールで拭いてコードを滅菌する。コード組織片を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1つの50mL収集チューブから、それを含む別の収集チューブに順次移す。氷上の被験者の名前を冠した収集チューブを1時間以内に実験室に輸送する。
    注: 大規模な試験では、サンプルをバーコード化して、試験全体を通して追跡できるようにすると便利な場合があります。重要なことに、ヒト組織を扱うすべての人員は、B型肝炎ワクチンの完全なレジメンを提供されるべきである。
  2. ラボでは、使用前にオートクレーブ処理された器具とピペットを滅菌するために、BSL-2フードでUVを25分間オンにします。
  3. コード組織片を収集チューブから、5 g/L グルコース、50 μg/mL ゲンタマイシン、2.5 μg/mL アンホテリシン B、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンで濃縮した PBS を含む 10 cm 2 組織培養処理ディッシュに移します (図 1 の模式 図)。
  4. メスを使用して、コード組織をその長手方向軸に沿って垂直にスライスし、2つの半円筒形片を得る。コードねじれと粘液状表面のために、もう一方の手で保持された一対の鉗子で組織をピン留めする。
  5. この時点で、臍帯動脈と静脈を観察し、メスを使って表面から一方向に掻き取って血管を取り除きます。臍帯組織をもう一度PBSですすぎ、組織に関連するすべての残留血液を除去します。容器を囲むWJ内の細胞の完全性を維持するために、掻き取りが穏やかであることを確認してください。
  6. 臍帯組織の各半分を0.5cm3サイズの断片に細かく刻み、管腔面を下に向けて皿の上に置きます。ディッシュを5%CO2を含む37°Cの加湿チャンバー内で10分間短時間インキュベートする。
  7. インキュベーション後、コード組織片を含むディッシュに、L-グルタミン、リボおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないMEM Alpha修飾を含む20mLの培地、15%ウシ胎児血清(熱失活していない)、および50μg/mLゲンタマイシンを浸水させる。成長培地を側面に沿って穏やかに追加して、組織外植体がそれらの向きから外れるのを防ぎます。インキュベーション中に組織外植体によって吸収される画分を説明するために、過剰な培地を加える。
  8. 3日間の培養後、培養物に新鮮な培地を加える。皿を取り扱っている間、培養物が外植体の衝撃や動きから保護されていることを確認してください。
  9. 1週間後、滅菌鉗子を使用して組織断片を個別に除去し、廃棄のために適切なバイオハザードバッグを使用して廃棄する。既存の培地を保持し、10mLの新鮮な増殖培地を加える。個々のコロニーが70%の合流点に達するまで、4日ごとに増殖培地を交換する。
    注:細胞は、時間の経過とともに合流するために監視する必要がある個々の増殖性コロニーが存在するため、ディッシュ全体に均一に分布しない可能性が高い。一般に、1ヶ月以内に、10cm2の皿は、別の皿に分割されるのに十分な細胞を生成する。
  10. トリプシン/EDTA溶液(ハンクス平衡塩溶液[HBSS]中の1x 0.25%トリプシンおよび0.02%EDTA)を使用して接着細胞を採取する。細胞懸濁液を470 × g で25°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを増殖培地に再懸濁した。

2. uMSCSの免疫表現型決定と伝播

  1. 接着細胞が50%〜60%の合流点に達し、十分に広がっていたら、イムノフェノタイピングに進みます。完全にコンフルエントな培養物ではMSCマーカー分析を実行しないでください。これは、主要なMSCマーカーのダウンレギュレーションを引き起こす傾向があるためです。
  2. トリプシン処理後、1×106 細胞/mLの細胞懸濁液をFACSチューブ(1×105 細胞/チューブ)に分配し、適切なフルオロフォア結合抗体(すべて1:50希釈)で染色する:染色なし;CD105 + CD90;CD105 + CD73;CD105;CD90;CD73;CD34 + CD45(一般的な蛍光色素分子);各蛍光色素分子のアイソタイプ制御。フローサイトメーターに少なくとも10,000のイベントの総数を記録し、さらに分析します。
    注: 細胞は表面マーカーごとに個別に分析されるため、細胞サブセットのゲーティングは必要ありません。
  3. 上記のマーカーに加えて、個々の臍帯組織サンプルから作成されたuMSCラインにおける陽性および陰性表面マーカーの存在を確認する(表1)。
  4. 標識細胞をフローサイトメトリーで分析し、CD105+CD90+ およびCD105+CD73+ 細胞の割合を決定します。CD105+ 細胞とCD34-CD45-細胞を 別々に分析する。

3. uMSCの骨格筋への分化

  1. 組織培養プレートに0.01%コラーゲンと20μg/mLラミニンをPBSでコーティングする。これらのプレートを室温で最低4時間コーティングします。
  2. 増殖培地中でuMSCを10,000細胞/cm2 の密度でプレートする。
  3. 細胞が70%コンフルエントになったら、増殖培地を吸引し、培養物をPBSで2xすすいでください。DMEM+5%ウマ血清+0.1μMデキサメタゾン+50μMヒドロコルチゾンを含む筋原性分化培地(M1)をuMSCsに加える。筋原性進行の動態の決定のために、M1培地を1日おきに培養物に添加する。
  4. 筋原性進行の動態を決定するために、それぞれ2日、4〜5日、6〜7日、および10〜14日におけるPax7、MyoD、ミオゲニン、およびMyHC発現のuMSCを分析する。

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結果

臍帯組織からのuMSCの単離の成功は、全臍帯血からの成功率の低さとは異なり、>95%である。uMSCの単離に成功すると、FACS分析により、すべての細胞がCD34−CD45−CD105+CD90+であることが明らかになった。しかしながら、比較解析において、臍帯血から単離されたuMSCは不均一な集団を示し、ここで細胞の割合はCD34+CD45+CD105+(〜15%)を示す。さらに、ダブルポジティブCD105+CD90+は数が少なく(〜5%)(補足図S1)。これは、CD105およびCD90発現の両方が筋形成の誘導に必要であるため、臍帯血からのuMSC間の筋原性分化のレベルを低下させる。uMSCはまた、表1に列挙されたマーカーの発現を表示する。臍帯血由来uMSCの汚染がある場合、CD34 + CD45 +細胞の存在もあります。これ...

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ディスカッション

重要なステップ
このプロトコルの重要なステップは、送達時から無菌培養物の維持まで、増殖の全期間にわたって、無菌条件下での組織の収集である。コード収集中は、コードが滅菌されていない表面に触れず、抗生物質を添加したPBSを含むチューブに収集する前に70%エタノールで外部から拭き取ることが不可欠です。uMSC単離のために、コード収集と組織の処理との間の時間を制限することが重要です。組織を収集部位から実験室に輸送する必要がある場合は、抗生物質含有緩衝液で組織を維持し、氷上に保存するように注意する必要があります。

メソッドの変更とトラブルシューティング
uMSCの筋原性分化を誘導するためのこのプロトコルの重要な修正は、0.01%タイプ1コラーゲンおよび20μg/mLラミニンによるディッシュのコーティングである。我々は、接着条件も調節されると、M1培地の存在下でuMSCsにおける筋原性進行が増強されることを観察した。高価ではあるが、Matrigelのような他の優れた行列の使用が、このプロトコルをさらに改善する可能性...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

謝辞

撮影とビデオ制作に協力してくれたOjas Tikoo氏に感謝します。我々はまた、GARBH-Ini(Advanced Research and Birth Outcome-DBT India)のスタッフ、看護師、上級研究官、及びPallavi Kshetrapal博士から物流に関する支援を受けたことを認識する。この研究は、インドのバイオテクノロジー省からSuchitra Gopinathに授与された助成金によって支援されました(BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
アムホテリシン BSigma AldrichA2411
抗生物質溶液 100x 液体、エンドトキシン試験済み (10,000 U ペニシリンと 10 mg ストレプトマイシン/mL 0.9% 生理食塩水溶液)HiMediaA001A-50mL
抗 GAPDH 抗体Sigma AldrichG8795
抗MyHC抗体 (My32)Novus BiologicalsNBP2-50401AF647
抗MyoD抗体 (5.8A)Novus BiologicalsNB100-56511
抗ミオゲニン抗体 (クローンF5D)Novus BiologicalsNBP2-34616AF594
抗Pax7抗体DSHBDSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10BD Biosciences559869
コラーゲン 1型メルクC8919
D (+) グルコースSigma AldrichG7021
デキサメタゾンSIGMAD4902
FACSCanto II または FACSAria IIIBD Biosciences
Fetal Bovine Serum, 認定ブラジルGIBCO10270106熱不活化
FITCマウス 抗ヒトCD106クローン 51-10C9BD Biosciences551146
FITC マウス抗ヒトCD14クローン M5E2BD Biosciences557153
FITC マウス抗ヒトCD31クローン WM59BD Biosciences557508
FITC マウス抗ヒトCD34クローン 581BD Biosciences555821
FITC マウス抗ヒトCD45クローンHI30BD Biosciences555482
FITC 抗ヒトマウス CD49D クローン 9F10BD Biosciences560840
FITC マウス抗ヒト CD90 クローン 5E10BD Biosciences555595
FITC マウス抗ヒト HLA-A,B,C クローン G46-2.6BD Biosciences557348
FITC マウス抗ヒト IgG クローン G18-145BD Biosciences555786
FlowJo ソフトウェアBD Biosciences
ゲンタマイシンシグマ アルドリッチG1264
馬血清HiMediaRM1239
ヒドロコルチゾンメルクH4001
ラミニンメルクL2020
MEM アルファ修飾 L-グルタミン、リボ-およびデオキシリボヌクレオシドなしハイクロンSH30568.FS uMSCs PEマウス抗
ヒトCD105クローン 266BD Biosciences560839
PE マウス抗ヒトCD44クローン 515BD Biosciences550989
PE マウス抗ヒトCD49EクローンllA1BD Biosciences555617
PEマウス抗ヒトIgGクローン G18-145BD Biosciences555787
PE-Cy7マウス抗ヒトCD73 CLONE AD2BD Biosciences561258
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH=7.4HiMediaM1866
トリプシン/EDTA 溶液 (1x 0.25% トリプシンと 0.02% EDTA のハンクス平衡塩溶液 (HBSS)HiMediaTCL049-100mL

参考文献

  1. Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
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  3. Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
  4. Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
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  10. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726(2013).
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CD105 CD90 CD73

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